在潜流人工湿地中, 因氧气扩散过低, 导致溶解氧(DO)长期处于较低水平, 尤其是处理污水的潜流湿地.在这种条件下, 微生物将会选择特殊的电子供体来氧化有机物.这些特殊电子供体在失去电子后将会对植物造成毒害作用, 例如亚硝态氮、Fe²⁺、Mn²⁺等^[1~3].当植物长期处于缺氧甚至厌氧环境时, 具有强还原性的离子Fe²⁺及Mn²⁺将会在植物体内形成O₂^-和H₂O₂等毒副产物^[4], 可造成膜脂质过氧化及蛋白质和DNA损伤等损害.生物炭的灰分元素(如K、Ca和Mg等)含量较为丰富, 投加至湿地后作为可溶性养分被植物利用, 并能通过贮存营养元素、改善湿地基质的理化性质来促进湿地植物的生长^{[5, 6]}.除此之外, 生物炭投加至人工湿地, 利于空气扩散进入湿地床体, 能改善湿地内部还原性环境以及局部缺氧(或厌氧)环境^[7].为此本研究拟通过对比不同生物炭投加比例对湿地植物的生理生态影响, 从植物生长、植物氮素吸收作用及植物体的过氧化应激反应等3个方面, 探讨生物炭投加对缓解湿地植物缺氧(或厌氧)胁迫可能具有的特殊作用.

本研究的湿地反应器采用圆筒形聚乙烯容器, 每个容器表面积为0.1 m², 深为35 cm.按照生物炭40%、30%、20%、10%和0%的添加比例分别构建一组微型系统(分别命名为BW-40、BW-30、BW-20、BW-10和CW-K), 为保证试验数据可靠有效, 本研究设置一组平行反应器.湿地反应器采用潜流湿地形式, 下部按照比例填充碎石(粒径为1~2 cm), 上部按照比例填充生物炭(采用芦竹作为原材料于500℃条件自制, 长度为1~2 cm)^[8], 生物炭的比表面积为345.92 m²·g^-1, 孔径为1.95 nm, 孔容为0.246 7 cm³·g^-1.在表层铺一层约3 cm碎石以防止生物炭轻质填料上浮, 填充总高度33 cm, 湿地栽种植物选用菖蒲(AC).在每个湿地反应器中央设置一根直径为3 cm, 长度为35 cm的穿孔管, 用于虹吸排水、取样、测定各种物理和化学参数.

植物经驯化扩培后, 选取长势好且根叶相似的AC, 分别栽入湿地中(对应湿地名称分别命名为AC-40、AC-30、AC-20、AC-10、AC-K), 栽种密度为30株·m^-2, 试验装置如图 1所示.所有湿地试验均置于温室中进行, 温度(25±2)℃, 光照强度(3 000±300) lx, 光暗比12 h:12 h.

图 1

Fig. 1

图 1 试验装置示意 Fig. 1 Scheme of the experimental microcosm

人工湿地进水采用自来水配置, 每升进水包括：390 mg C₆H₁₂O₆; 220 mg KNO₃; 75 mg NH₄Cl; 200 mg NaHCO₃; 11 mg KH₂PO₄; 18 mg K₂HPO₄·3H₂O; 10 mg MgSO₄·7H₂O; 10 mg FeSO₄·7H₂O; 7.6 mg CaCl₂和1 mL微量元素液.每升微量元素液包括：0.15 g H₃BO₃; 0.03 g CuSO₄·5H₂O; 0.18 g KI; 0.12 g MnCl₂·4H₂O; 0.06 g Na₂MoO₄·2H₂O; 0.12 g ZnSO₄·7H₂O; 0.15 g CoCl₂·6H₂O和10 g EDTA-Na₂.配好的进水包括420 mg·L^-1化学需氧量(COD), 20 mg·L^-1 NH₄⁺-N, 30 mg·L^-1硝态氮(NO₃^--N)和5 mg·L^-1总磷, 进水pH控制为7.5±0.3, DO控制为(2.0±0.5)mg·L^-1.湿地停留时间为2 d, 处理负荷设定为0.05 m³·(m²·d)^-1, 有效进水量为10 L, 进水水位可由顶部水位控制阀门调整.经过150 d左右稳定运行后, 湿地污染物去除效果如表 1所示.

表 1 (Table 1)

表 1 试验期内不同湿地的污染物去除效果 Table 1 Treatment performance of different constructed wetlands during the experimental period 污染物1) 进水 /mg·L-1 出水/mg·L-1 BW-40 BW-30 BW-20 BW-10 CW-K COD 414.12±10.67 39.73±8.77 44.71±12.96 45.75±14.03 50.51±11.77 49.63±14.86 NH4+-N 19.67±1.57 8.04±2.54 9.40±2.71 9.93±2.20 11.23±3.03 12.71±3.21 NO3--N 31.40±1.02 ND2) ND ND ND ND TN 50.08±1.88 9.85±1.61 10.78±3.01 11.56±1.78 12.00±2.57 14.53±2.55 1)污染物测定采用标准分析方法[9]; 2)ND表示未检出

表 1 试验期内不同湿地的污染物去除效果 Table 1 Treatment performance of different constructed wetlands during the experimental period

根据Ibarra-Obando等^[10]对水生植物叶片生长的测定方法, 栽入湿地前, 用防水笔在AC的根部顶端做上标记, 待测定时取出AC并清净, 测出叶片根部顶端与标记之间的长度, 即为该叶片生长量.每株AC标记3处, 测其生长量后求平均值. AC鲜重测定采用文献[11, 12]中的测定方法进行, 具体方法如下：将AC从湿地中取出后, 用自来水冲洗2~3遍, 自由滤水5 min, 滤纸吸水5 min后, 立即称量.

取新鲜的中等长度叶片, 擦去叶片上的污物, 截取距叶片尖端10~20 cm部分获得粗酶提取液^[13].可溶性蛋白(SP)含量参照Bradford法测定^[14], 光合色素采用乙醇作为提取溶剂, 参照植物生理学方法在665、649、470 nm下测定提取液吸光度值(A).利用如下公式计算叶绿素a (Chla)、叶绿素b (Chlb)、类胡萝卜素(Car)和总叶绿素(Chlt)^{[15, 16]}含量：Chla=(13.95×A₆₆₅)-(6.68×A₆₄₉), Chlb=(24.96×A₆₄₉)-(7.32×A₆₆₅), Car=(1 000×A₄₇₀)-(2.05×Chla)-(114.8×Chlb)/245, Chlt=Chla+Chlb.

SOD活力、POD活力和MDA含量的测定参照文献[17]的测定方法; 谷氨酰胺合成酶(GS)活力的分析参照文献[18]的改进方法.在37℃条件下, 每mg组织蛋白每分钟催化1 μg愈创木酚的酶量定义为一个POD活力单位; 每mg组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位; 以每小时37℃反应生成的γ-谷氨酰氧肟酸的1 μmol的量为一个GS活力单位.

将AC从湿地中取出并且冲洗干净, 然后迅速置于1.2 L的湿地进水中, 将其放置于温室中[温度(25±2)℃, 光照强度(3 000±300)lx, 光暗比12 h:12 h], 间隔一定的时间(0、8、12、16、20和24 h)取水样, 并测其NH₄⁺-N和NO₃^--N. NH₄⁺-N测定采用纳氏试剂分光光度法, NO₃^--N测定采用紫外分光光度法.分别做出溶液中NH₄⁺-N和NO₃^--N含量与时间变化的线性拟合方程, 得到斜率, 再除以鲜重得到AC对NH₄⁺-N和NO₃^--N的比吸收速率.

全部分析测试均平行3次试验, 试验数据通过Origin 8.5整理作图, 并由PASW Statistics 18.0进行数据分析.试验数据表达均采用平均值加或减标准差.对象之间相互关系采用相关性分析, 并经Pearson检验(水平包括显著P < 0.05和极显著P < 0.01).对象之间的差异性分析采用One-way ANOVA (水平包括显著P < 0.05和极显著P < 0.01).

相同时间内, 不同生物炭湿地中, AC的鲜重增长量如图 2所示.相对于空白湿地中的AC而言, 生物炭湿地中的AC, 其鲜重增长量均有所增高, 但是增高幅度不同, AC鲜重增长量均随生物炭添加量的增加而增加.经过单因素方差分析, 随着生物碳添加量的增加, AC的鲜重增长量显著增加.根据相关性检验, AC的鲜重增长量与生物炭的添加量呈极显著正相关关系(R²=0.992, P < 0.01).

图 2

Fig. 2

图 2 不同湿地中AC鲜重和叶片长度增长量 Fig. 2 Increase in fresh weight and leaf length of AC in different constructed wetlands

相对于空白湿地中的AC而言, 生物炭湿地中的AC叶片增长量均有所增高, 但是增高幅度不同, AC叶片增长量均随生物炭添加量的增加而增加(图 2).经过单因素方差分析, 随着生物碳添加量的增加, AC的叶片增长量显著增加.根据相关性检验, AC的叶片增长量与生物炭的添加量呈显著正相关关系(R²=0.924, P < 0.05).

作为无机肥料的提供者, 生物炭被报道能改善局部营养环境, 为植物提供营养元素, 提高植物产量^[19].根据现有土壤生态系统对生物炭的应用研究发现, 通过添加生物炭, 植物产量的响应范围为-29%~324%^[19].在本研究中, 生物炭添加对AC生长具有显著的促进作用, 可能的原因包括：增强营养盐的保持^[20]; 改善离子交换能力^[21]; 增加孔隙率, 改善基质环境, 利于植物根系的生长发育^[22]等.

湿地运行150 d后, 生物炭添加对湿地植物光合色素(Chlt、Chla、Chlb和Car)的影响如图 3所示.相对于CW-K而言, 生物炭湿地中AC的Chla、Chlb和Car含量均有所增高, 但是增高幅度不同, AC叶片内Chla、Chlb和Car含量均随生物炭添加量的增加而增加.经过单因素方差分析可知, 生物炭湿地中AC叶片Car含量的变化不显著, Chla、Chlb及Chlt的含量在高生物炭添加比例(30%~40%)的湿地之间变化不显著, 而在低生物炭添加比例(0~20%)的湿地之间变化显著.根据相关性检验可知, Chlt和Chlb的含量与生物炭的添加比例呈极显著正相关关系(R₁²=0.960, R₂²=0.970, P < 0.01), Chla和Car的含量与生物炭的添加比例呈显著正相关关系(R₁²=0.953, R₂²=0.924, P < 0.05).

图 3

Fig. 3

图 3 不同湿地中AC光合色素含量 Fig. 3 Photosynthetic pigment content in AC in different constructed wetlands

除了AC-10中SP含量与AC-K无显著差异外, 其余湿地中AC的SP含量随生物炭添加比例的增大显著增加(图 4), 并呈极显著正相关关系(R²=0.981, P < 0.01).光合色素作为绿色植物光合系统中的重要部分对植物的代谢具有显著影响.在本研究中, 生物炭添加显著增加了AC体内的Chla和Chlb含量, 增强光合作用, 利于植物体内SP的积累和植物生物量的增加. Car是一大类脂溶性抗氧化剂, 可以作为自由基清除剂, 并能替代过氧化物酶, 保护植物体内的叶绿体.因此, 生物炭湿地AC中Car的增加, 有利于增强叶绿体进行光合作用的能力, 促进植物代谢, 加速碳水化合物的合成, 表现出对SP的正效应.

图 4

Fig. 4

图 4 不同湿地中AC的SP含量 Fig. 4 SP content in AC in different constructed wetlands

生物炭湿地中AC的GS活力显著高于空白湿地CW-K, 且随着生物炭添加量的增加, 逐渐呈显著增大的趋势(图 5). GS作为连接植物体内碳氮代谢的关键酶, 在无机氮转化为有机氮的过程中起重要作用.在ATP存在的情况下, GS负责将NH₄⁺-N和谷氨酸合成谷氨酰胺^[18].在本研究中, 5组人工湿地的出水NH₄⁺-N浓度均超过5 mg·L^-1, 不会对AC造成NH₄⁺-N限制^[23], 因此, 通过添加生物炭能够促进植物生长, 同时加强GS活力, 增强植物体内NH₄⁺-N的合成代谢, 利于AC吸收去除NH₄⁺-N.另外, 根据相关性检验可知, AC叶片中的GS活性与生物炭的添加量呈显著正相关关系(R²=0.944, P < 0.05).

图 5

Fig. 5

图 5 不同湿地中AC的GS活力 Fig. 5 GS activities of AC in different constructed wetlands

生物炭湿地中AC对NH₄⁺-N和NO₃^--N的比吸收速率显著高于空白湿地CW-K, 且随着生物炭添加量的增加, 逐渐呈显著增大的态势(表 2和图 6).这与GS活性的变化趋势是一致的, 生物炭的添加增强了GS的活性, 而GS在植物体内氮代谢过程中具有重要作用, GS活性的增强促进了植物对NH₄⁺-N和NO₃^--N的吸收.另外, 相关性分析可知, 植物对NO₃^--N的比吸收速率与生物碳的添加量呈显著正相关关系(R²=0.950, P < 0.05), 植物对NH₄⁺-N的比吸收速率与生物碳的添加量呈极显著正相关关系(R²=0.996, P < 0.01).

表 2 (Table 2)

表 2 湿地植物吸收NO3--N和NH4+-N的拟合方程、决定系数和比吸收速率(以鲜重计) Table 2 Fitting equations, determination coefficients, and relative NO3--N and NH4+-N uptake rates of wetland plants 吸收种类 植物 拟合方程 R2 比吸收速率 /μg·(h·g)-1 AC-40 y=-1.53 x+29.78 0.975 9.339 AC-30 y=-1.11 x+32.49 0.981 9.092 NO3--N AC-20 y=-0.96 x+32.42 0.982 8.581 AC-10 y=-0.86 x+33.58 0.814 8.037 AC-K y=-0.50 x+32.37 0.745 6.617 AC-40 y=-0.67 x+22.20 0.982 4.321 AC-30 y=-0.51 x+22.44 0.994 4.148 NH4+-N AC-20 y=-0.43 x+22.69 0.981 3.848 AC-10 y=-0.45 x+21.45 0.954 3.541 AC-K y=-0.35 x+22.56 0.963 3.241

表 2 湿地植物吸收NO3--N和NH4+-N的拟合方程、决定系数和比吸收速率(以鲜重计) Table 2 Fitting equations, determination coefficients, and relative NO3--N and NH4+-N uptake rates of wetland plants

图 6

Fig. 6

图 6 不同湿地植物的比吸收速率 Fig. 6 Relative uptake rates of AC in different constructed wetlands

不同生物炭湿地中, AC的SOD和POD活性如图 7所示.相对于CW-K而言, 生物炭湿地中AC的SOD活性均有所降低, 但是降低的幅度不同, AC的SOD活性均随生物炭添加比例的增加而降低.经过单因素方差分析可知, 随着生物炭添加量的变化, AC的SOD活性变化显著.根据相关性检验可知, AC的SOD活性与生物炭的添加比例呈极显著负相关关系(R²=-0.966, P < 0.01).

图 7

Fig. 7

图 7 不同湿地中AC的SOD和POD活力 Fig. 7 SOD and POD activities of AC in different constructed wetlands

相对于CW-K而言, 生物炭湿地中AC的POD活性均有所降低, 但是降低的幅度不同, AC的POD活性均随生物炭添加比例的增加而降低.经过单因素方差分析可知, 在高生物炭添加比例的湿地之间, AC的POD活性变化不显著, 但是在低生物炭添加比例的湿地之间变化显著.根据相关性检验可知, AC的POD活性与生物炭的添加比例呈极显著负相关关系(R²=-0.992, P < 0.01).

当植物处于过氧化胁迫阶段, 植物体内对适应和生存极为重要的几个功能相关的抗氧化系统将去除体内多余的ROS^[24]. SOD是抗氧化防御系统的重要组成部分, 最先承担着将超氧化物(如O₂^-)催化为H₂O₂的任务^[25].因此, 高SOD活性意味着植物承受的胁迫压力更大^[26].本试验结果表明, 因湿地长期处于缺氧(或厌氧)的环境, AC体内可能发生前述的过氧化应激反应, 而随着生物炭添加量的增大, SOD活力显著降低.生物炭有利于缓解AC体内超氧化物的积累, 减少植物的过氧化应激反应. SOD催化产生的H₂O₂需要经POD进一步催化分解, 因此, POD活力变化与SOD相对应, 表现出一致的变化规律(R²=0.971, P < 0.01).生物炭对POD也具有同样的影响.在高生物炭添加比例下(40%和30%), 生物炭的添加降低植物体内SOD活力同时, 代谢产生的H₂O₂未有明显变化, 并未对POD活力有根本改变.由于在不同湿地中AC体内SOD和POD活力水平同步变化, 体内的O₂^-和H₂O₂是否能被全部催化降解需要结合MDA变化进一步讨论.

从图 8中可以发现, 5组湿地植物AC体内MDA含量(以蛋白计)均超过6 nmol·mg^-1, 说明在5组菖蒲体内O₂^-和H₂O₂并未完全被SOD和POD催化降解.尽管有报道AC是一类对缺氧条件具有显著抵抗能力的湿地植物, 但湿地长期的缺氧(或厌氧)环境会对AC体内造成膜脂被氧化的不良影响.生物炭添加(添加量20%~40%)虽然能缓解AC体内超氧化物和过氧化物的积累, 显著降低AC体内MDA含量, 但仍无法完全消除湿地长期缺氧(或厌氧)带来的过氧化胁迫.

图 8

Fig. 8

图 8 不同湿地中AC的MDA含量 Fig. 8 MDA content in AC in different constructed wetlands

(1) 生物炭能够促进湿地中菖蒲的新陈代谢, 增加菖蒲体内光合色素含量, 利于植物体内可溶性蛋白的积累和植物生物量的增加.

(2) 生物炭可以提高菖蒲的谷氨酰胺合酶活性, 增强植物体内氨氮的合成代谢, 增加菖蒲对氨氮的比吸收速率.

(3) 湿地长期缺氧或厌氧环境会对菖蒲体内造成膜脂氧化, MDA含量(以蛋白计)均超过6 nmol·mg^-1. 20%~40%生物炭添加虽然能缓解菖蒲体内超氧化物和过氧化物的积累, 显著降低菖蒲体内丙二醛含量, 但仍无法完全消除湿地长期缺氧(或厌氧)带来的过氧化胁迫.