2018, Vol. 39
在污水处理中, 传统硝化-反硝化是一种常用的生物脱氮处理工艺[1].低温对硝化细菌活性抑制明显, 冬季污水厂出水总氮浓度达标困难.硝化速率与细菌浓度呈正相关, 富集培养大大提高了细菌浓度, 包埋固定化实现了定性定量投加, 因此国内外对于硝化细菌的富集培养以及包埋研究成为热点.
于濛雨等[2]采用连续流运行方式培养AOB, 以游离氨(FA)抑制亚硝酸盐氧化菌的生长, 最终实现氨氧化速率2.028 g·(g·d)-1.盛晓琳等[3]采用膜生物反应器(MBR)为富集装置, 结果表明经过182 d富集培养后, 污泥的硝化活性到达98.41 mg·(L·h)-1.徐晓毅等[4]包埋固定化活性污泥, 结果表明在包埋颗粒的体积投加率为10%, 稳定期包埋颗粒的最大总氮去除负荷为7.78 mg·(L·h)-1.前人对硝化细菌的富集培养和包埋填料的制备仅停留在实验室小规模和单菌种水平, 且存在细菌培养周期长及包埋体的活性低等问题.
本实验采用工业级大型发酵罐, 通过PLC控制实验参数(pH、DO和温度), 同时实时控制FA和FNA, 进行硝化细菌工业化实验生产为探究出适合城市污水处理氨氮高效氧化单元技术作准备, 以期为大幅度提高城市污水处理系统的脱氮能力找到新的技术途径.
1 材料与方法 1.1 污泥富集培养材料与方法实验污泥取自北京高碑店污水处理厂回流污泥, 污泥富集培养装置见图 1, 反应器有效容积1 200 L.
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1.进气管; 2.搅拌电机; 3.加碱管; 4.发酵罐; 5.曝气环; 6.溶解氧探头; 7.pH计探头; 8.温度探头; 9.PLC控制柜; 10. pH变送器; 11.DO变送器; 12.温度控制器; 13.加碱泵14.碱液桶; 15.鼓风机 图 1 污泥富集培养装置示意 Fig. 1 Schematic of sludge enrichment and cultivation device |
培养过程中温度控制在28~30℃[5, 6], DO为1~1.5 mg·L-1[7~8], pH为7.2~7.4[9~10].具体pH值应根据进水氨氮浓度调节, 从而控制体系的FA与FNA的浓度.培养过程中间歇投加底物, 每隔3 d左右更换上清液, 并注入基础培养液, 成分见表 1, 始终维持体系的总有效体积为1 200 L.
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表 1 基础培养液的组成 Table 1 Composition of synthetic feed stock solution |
1.2 包埋填料的制备与应用
取培养后污泥100 L, 用隔膜压滤机(景津环保股份有限公司)浓缩成含水率为85%的污泥, 与质量分数15% PVA凝胶混合.同时, 加入添加剂碳酸钙38.83 g·L-1[11~15], 放入过饱和的硼酸溶液交联2 h, 再用自来水清洗后放入70 g·L-1的硫酸钠溶液中二次交联3 h, 期间不断地调节交联剂的pH在3.5以下.将包埋液均匀涂在圆柱体网格条子上(长50 cm, 直径1.0 cm), 然后切成1.5 cm长度的小圆柱体.包埋体活性恢复连续流装置见图 2, 反应器有效容积202 L, 包埋填料填充率为30%.实验采用人工模拟氨氮废水, 其成分同上.
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1.原水泵; 2.原水水箱; 3.碱泵; 4.碱水箱; 5.pH计及加碱管路; 6.溶解氧浓度探头; 7.出水溢流管路; 8.填料; 9.石砾和曝气环 图 2 实验装置示意 Fig. 2 Schematic of experimental equipment |
取原始污泥混合液和富集培养后的污泥混合液分别标记为A01和A02, 提取DNA并用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000分光光度计检测DNA浓度. PCR扩增区域选择样本16S rRNA的V3~V4区域, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.
1.3.2 DNA文库定量与测序将检测合格的污泥样本DNA建库并做相应的检测, 并使用设定的TAG序列进行样本区分.检测合格的文库采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量测序平台对样品进行测序.
1.3.3 生物多样性分析分析过程如图 3所示, 要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等信息, 就需要对序列进行归类操作.方法为将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类, 后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元(OTU).通常相似性为0.97分为一个OUT, 以不同的分类单元为基础, 进行α多样性分析, 其中反映群落丰度的指标为：Seq、Chao1和ACE, 反映微生物多样性的指标为:Shannon、Simpson和盖度.
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图 3 生物多样性分析流程 Fig. 3 Flow chart of biodiversity analysis |
进行相应指标分析前, 样品需用慢速滤纸过滤或者需要在121℃烘箱里烘干, 分析项目为NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD、污泥浓度(MLSS)等按照国家环境保护总局规定的标准检测方法, 具体方法见表 2.
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表 2 检测项目及方法 Table 2 Analysis equipment and methods |
2 结果与讨论 2.1 硝化细菌富集培养结果及分析
有研究表明AOB对FA(free ammonia)的敏感度较NOB低, FA对亚硝酸盐氧化菌(NOB)的抑制浓度为0.1~1.0 mg·L-1, 对氨氧化菌(AOB)是10~150 mg·L-1[16].最近研究表明, FNA(free nitrous acid)完全抑制NOB和AOB生长的浓度分别为0.02和0.4 mg·L-1[17~18], FA浓度达到6 mg·L-1时就可完全抑制NOB的生长[19].
图 4和图 5表明, 在富集培养的过程中, 通过调节系统的pH(7.2~7.35)及进水氨氮的浓度, 来实现整个培养的过程中, FA在2.0 mg·L-1以下, FNA稳定为0.007 mg·L-1.在第一阶段(0~14 d), 进水氨氮浓度维持在50 mg·L-1, 出水氨氮总体低于20 mg·L-1, 出水亚硝氮维持在10 mg·L-1左右, 表明前期AOB和NOB受抑制作用较小.第二阶段(15~24 d)进水氨氮提高到100 mg·L-1, FA和FNA分别随着氨氮浓度提高及亚硝氮积累而增加.此时FNA浓度为0.002~0.007 mg·L-1, 达不到NOB的抑制阈值, 而FA浓度为1.1~1.9 mg·(L·h)-1, 对NOB有明显的抑制作用.同时, 培养过程中的定期排出上清液, 劣势菌种NOB被逐步淘洗出反应器, 反应器亚硝氮浓度逐渐升高.随着系统中亚硝氮的积累, 进一步加强了对NOB的抑制, 维持了短程硝化的稳定.
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图 4 污泥进出水氨氮浓度及FA变化曲线 Fig. 4 Changes in sludge water ammonia concentration and FA |
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图 5 FNA及亚硝氮速率变化曲线 Fig. 5 Sludge effluent nitrogen, FNA, and nitrite removal rate |
由图 6中可知, 在第一阶段(0~14 d), 污泥浓度变化较小.排水后整个体系的污泥浓度减小, 换水3 d左右污泥浓度即可恢复, 污泥浓度变化曲线总体呈现上涨趋势.第二阶段(15~24 d), 随着反应进水氨氮浓度的提高, 第15 d氨氧化速率迅速升高, 该变化与莫诺方程相吻合.经过24 d的培养, 体系的污泥浓度从5 472增至6 920 mg·L-1, 硝化速率从7.5增至118.3 mg·(L·h)-1, 表明此时污泥的培养基本成熟.
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图 6 污泥培养中硝化负荷及污泥浓度的变化 Fig. 6 Changes in nitrification load and sludge concentration |
通过对两组样品16S rRNA基因文库高通量测序, 污泥原样(A01)与筛选后的污泥样品(A02)的α多样性指标计算结果见表 3.
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表 3 α多样性指标计算结果 Table 3 Calculation results of diversity index |
由表 3可知, 两个样品的文库覆盖率均大于0.95, 表明测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种. A02的Chao1和ACE指数均大于A01, 表明A02具有较大的OTU数, 即筛选后的污泥物种丰富度大于原始污泥, 具有较多的物种总数.而A01的Shannon和Simpson多样性指数大于A02, 说明原污泥群落多样性高于筛选后的污泥.由此可知, 多样性指数较高的原始污泥群落各种之间个体分配较均匀, 而筛选后的污泥各种之间生物量差异较大, 优势种群明显.
2.2.2 菌群变化分析有研究表明AOB可分为5个属[20], 分别为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)和亚硝化叶菌属(Nitrosolobus), NOB分为将NOB分为4个属, 分别为硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nitrococcus)、硝化刺菌属(Nitrospina)和硝化螺菌属(Nitrospira), 研究表明在污水处理厂经常出现的AOB主要是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)[21]; 经常出现的NOB主要是硝化杆菌属(Nitrobacter)和硝化螺菌属(Nitrospira)[22].
图 7和图 8是全样本在属层次群落结构分析结果.由图 7可知, 原泥中的菌属分布较均匀, 培养前A01样本中未分类菌属比例为29%, other是比例很小菌属的总和(37.17%).前三类优势菌属为Dokdonella (6.39%)、Ottowia(2.48%)和Ferruginbacter(2.44%). Ferruginbacter属于鞘脂杆菌属, Dokdonella和Ottowia是与生物脱氮性能无关的菌属, 相关研究表明在厌氧消化污泥中常检测到两者[23]. Nitrosospira所占比例相对较少, Nitrosomonas几乎没有检测到.培养后样品A02中未分类的菌属比例为6.23%, other的比例减少到10.44%, 前三类优势菌属为Comamonas(19.75%), Terrimonas(15.79%)和Nitrosomonas(10.27%). Terrimonas属于鞘脂杆菌属, 不属于常见的脱氮菌属系列; Comamonas是新型的异养硝化菌属[24], Nitrosomonas属于亚硝化球菌属; 具有硝化作用的AOB(Nitrosomonas)与NOB(Nitrospira)菌属在原始污泥中比例分别为0.53%和2.42%, 经过富集培养以后比例分别为Nitrosomonas 10.27%、Nitrospira为1.73%.结果表明富集培养后Nitrosomonas是优势菌种[25], 宏观上表现为污泥硝化速率由7.5mg·(L·h)-1经培养后达到118.3mg·(L·h)-1.后期FA的抑制作用和定期的排上清液导致体系中NOB较原始活性污泥低, 从经济角度考虑, 短程硝化具有节能降耗的效果, 所以体系中AOB的快速增长是具有一定意义的.
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图 7 污水厂原始污泥种群分布(属层次) Fig. 7 Distribution of raw sludge(genus) |
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图 8 污水厂培养后污泥种群分布(属层次) Fig. 8 Distribution of sludge population after cultivation(genus) |
此阶段对包埋填料进行活性恢复, 包埋填料占反应器有效容积的30%.由图 9可知, 第一阶段(0~17d)进水氨氮浓度为50 mg·L-1左右, 控制反应器的DO(2~3 mg·L-1), 第17 d出水氨氮浓度处于较低水平.第二阶段(17~27 d)提高进水氨氮浓度提高到100 mg·L-1, 控制DO维持在3~4 mg·L-1.由硝化速率变化曲线可知, 第17 d后硝化速率明显增加.第二阶段末期, 氨氧化速率由原污泥的0.29 mg·(L·h)-1提高至63.66 mg·(L·h)-1, 实现了大幅度的提升.第1~17 d亚硝氮积累率随着氨氮浓度的提高而增加, 与包埋前NOB占有比例少相符合, 第17~27 d积累率下降, 与DO的提高和细菌在包埋体内增殖有关.在低溶解氧环境中AOB的竞争力强于NOB, 更有利于实现亚硝酸盐的积累.所以溶解氧的提高会破坏或者降低系统内的亚硝酸盐的积累[26].
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图 9 包埋填料活性恢复过程 Fig. 9 Active recovery process of entrapped fillers |
为证明填料可重复利用性, 在填料放置一个月以后, 对填料进行为期13 d的二次恢复.采用逐渐提高负荷的恢复策略, 进水氨氮由52 mg·L-1逐渐增加到137 mg·L-1, 控制pH在7.3~7.5, DO在2~4 mg·L-1之间.由图 10可以看出硝化速率从4.75 mg·(L·h)-1升到29.68 mg·(L·h)-1, 亚硝氮积累率在30%以上.二次恢复的最高速率是第一次的47%, 是污水厂活性污泥硝化速率的2~3倍, 由此说明填料可重复利用.
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图 10 填料的二次恢复速率变化 Fig. 10 Change in efficiency of fillers after two recovery cycles |
从图 11可知, 在填料二次恢复的基础上, 基质氨氮维持在50 mg·L-1左右, 进水COD(加入葡萄糖)在110 mg·L-1左右, HRT维持在2h, 连续运行5d.硝化速率保持在较高水平, 表明加入COD对氨氮的去除没有影响.出水COD在80 mg·L-1左右, 填料对COD的去除率只有27%, 由于填料表面的吸附作用以及包埋前培养的污泥中含有的细菌种类繁多, 存在部分好氧反硝化的作用.高COD出水能够使后续反硝化工艺很好地运行, 有利于整个A2O工艺的运行.
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图 11 常温下COD及不同温度下的硝化负荷变化 Fig. 11 Changes in COD and nitrification load at different temperatures |
(1) 采用逐渐提高基质浓度, 控制游离氨(FA)和游离亚硝酸(FNA)浓度并采用定期排水的方式, 实现了硝化细菌的规模化富集, 最终氨氧化速率为118 mg·(L·h)-1, 亚硝氮积累率稳定在50%左右.
(2) 高通量测序结果表明, 筛选后的污泥系统多样性较原污泥小, 硝化细菌大量增长, Nitrosomonas成为系统的优势菌种, 证明工业级的富集培养是可行的.
(3) 包埋筛选富集后的活性污泥, 通过短期的恢复, 氨氧化速率为62 mg·(L·h)-1, 将停止运行一个月后的填料进行二次恢复, 运行14 d后氨氧化速率为30 mg·(L·h)-1.
(4) 利用人工废水进行填料的二次恢复, 氨氮去除效率达96%左右, COD平均去除率为32.6%.
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