洞穴是人类探知地下世界的窗口, 在不同学科领域, 包括自然科学(地质、古生物、气候学、物理、化学和生物)、医学和工程以及社会学(如考古、神学和人类的文化历史)都具有重要价值^[1].洞穴为研究古气候和古环境^[2~4]、极端环境下的微生物^{[5, 6]}、岩溶洞穴系统发育^{[7, 8]}、岩石形成等^{[9, 10]}具有重大意义, 同时也为探索地下极端生态系统的演化奠定了基础, 提高了大众对地球历史的理解, 引发了社会大众对洞穴的好奇和关注, 也带动了各地的洞穴旅游热.截止到2014年10月, 我国旅游洞穴景点的总数己达到743个, 除了宁夏和上海外, 其余省份均有旅游洞穴景点.据统计, 2008年旅游洞穴年游客接待量约4 000万人次, 直接旅游收入数十亿元, 在我国旅游业中占重要地位, 给各地社会经济发展带来巨大的效益^[11].

岩溶洞穴常年封闭、贫营养、无光的特殊环境, 形成了一种高度特异性的生态系统, 从洞穴中分离得到的许多微生物新种极大地拓展了微生物资源.作为一种开放而独立的生态系统, 洞穴理化性质稳定, 通过不同洞穴微生物组的比较能够评估特定因素对微生物群落结构的影响, 追踪区域环境演变过程中微生物群落结构的演替, 研究洞穴历史演化过程中微生物的作用.由于缺少光照, 光合微生物作为初级生产者的作用受限, 诸多化能自养微生物(营养方式包括硫氧化作用、硝化作用和甲烷氧化作用等)和异养微生物构成了洞穴生态系统的支撑基础.对洞穴微生物组的研究表明, 在这种贫营养的环境中存在着数量众多、种类丰富的微生物类群, 是洞穴生态链的主要成分, 是洞穴生态系统的营养基础, 洞穴微生物以互相协作、合作共赢的方式, 构成洞穴微生物群体^{[12, 13]}.

洞穴旅游的经久不衰也给洞穴环境带来了不利影响, 人类进入洞穴, 改变了洞穴原本的封闭环境, 影响洞穴的温度、湿度、空气组成、微生物分布和来源及其沉积物景观等. Cigna^[14]对意大利Grotta di Castellana洞研究发现, 游客会对洞穴温度及湿度产生影响, 一个由105人的组成的旅游团进入洞穴停留10 min会使洞穴温度上升0.3℃. Hoyos等^[15]对西班牙北部Candamo洞研究发现, 游客活动除会影响洞穴温湿度之外, 还会使洞穴空气CO₂浓度上升100×10^-6~110×10^-6, 并指出游客容量应控制在29人·d^-1. Baker等^[16]认为游客呼吸作用使洞穴空气CO₂浓度上升, 同时洞穴CO₂浓度及温度的改变会使洞穴滴水中Ca²⁺浓度减少从而对石笋等洞穴沉积物产生溶蚀. Ikner等^[17]通过研究美国亚利桑那州Kartchner洞穴人类影响区域的微生物群落, 结果发现微生物丰度最大的变形菌门的出现指示游客携带棉质衣物和其他有机物使地下河水中有机质增加. Bastian等^[18]对法国Lascaux洞的研究发现, 游客呼吸作用和灯光的扰动使洞穴细菌及藻类大量繁殖, 洞穴壁画遭受大面积绿色生物膜破坏.人类活动的进入, 带来了外源的微生物和营养物质, 改变了洞穴的营养基础和微生物群落结构, 将给洞穴生态系统带来巨大的改变.探究洞穴的微生物群落, 能够为有效抑制微生物、保护洞穴沉积物及壁画提供方法指导.

雪玉洞是重庆著名的旅游景点, 2015年和2016年游客接待量约17万人次, 直接旅游收入约1 300万元, 给当地经济发展带来巨大收益.但是, 旅游活动不同程度也影响到了雪玉洞洞穴环境与洞穴景观.本文选取旅游洞穴雪玉洞及其临近未开发的水鸣洞作为研究点, 采集地下水样品, 运用16S rDNA高通量测序的方法, 研究洞穴地下水中的细菌群落结构, 对比旅游和未开放洞穴地下水中细菌群落结构的差异, 以分析人类活动给洞穴微生物带来的改变.通过了解旅游洞穴和未开放洞穴中主导微生物及其相关的代谢特征, 以期为洞穴微生物研究以及洞穴保护提供科学信息.

雪玉洞(29°47′00″N, 107°47′13″E)位于重庆市丰都县长江南岸的龙河下游峡谷内, 距丰都新县城12 km(图 1).洞口海拔233 m, 高出龙河平水面55.5 m, 因洞内次生沉积物种类丰富且色泽雪白如玉而得名.研究区内多年平均气温16.5℃, 多年平均降水量1 072 mm, 属于典型亚热带湿润性季风气候.雪玉洞发育在川东平行岭谷方斗山背斜北西翼的三叠系飞仙关组(T_1f)薄至中厚层灰岩中, 岩层产状为310°∠43°.洞穴顶板岩层厚150~250 m, 上覆植被以常绿阔叶林和灌丛为主, 土壤厚度0~50 cm.大气降水是洞内地下河唯一补给源, 受西南季风和东南季风的双重影响, 降水主要集中在每年的4~10月.雪玉洞属峡谷型洞穴, 洞道狭窄, 没有发育大的洞厅, 空间较小, 其中下层发育地下河, 地下河年流量88 821 m³·a^-1, 使得洞内相对湿度较高(一般≥100%).洞内气温较稳定, 但受灯光和游客的影响, 各层略有差异, 上层17.7~18.3℃, 中层17.4~18.1℃, 下层16.6~17.6℃, 地下河水温16.3~16.7℃.为便于洞穴管理, 当地工作人员在洞口安装两扇门, 减少洞内外气流交换^{[19, 20]}.

图 1

Fig. 1

(a)研究点位置; (b)雪玉洞洞穴形态及采样点位置; (c)水鸣洞洞穴形态及采样点位置 图 1 雪玉洞和水鸣洞地理位置及采样点位置示意 Fig. 1 Location of Xueyu Cave and Shuiming Cave and sampling sites

水鸣洞(29°47′00″N, 107°47′00″E)高出龙河水面十余米, 洞内次生沉积物种类、规模及色泽都次于雪玉洞, 但地质、地层、植被、气候等条件与雪玉洞相似(图 1).地下河流量大于雪玉洞, 洞口有一泉华堆积平台.洞穴末端为大厅, 并集成水塘, 地下水从池边涌出, 有砂层堆积.因洞道多通过薄层灰岩分布段, 故洞顶崩塌现象普遍, 且稳定性差, 洞内相对湿度较高(一般≥95%).洞内气温上下层有差异, 上层16.6~23.3℃, 下层17.8~19.7℃, 洞口17.4~21.2℃, 地下河水温16.4~16.7℃.洞口呈半封闭, 与洞外气流有交换.

本研究于2014年3月, 分别在雪玉洞内的地下河的主要入口处(上游：位于雪玉洞最深处)和地下河出口处(下游：位于雪玉洞入口处)水中进行样品采集[图 1(c)].此外, 还在水鸣洞内[图 1(b)]的地下河水中里采集了样品.采样时, 使用连接有真空泵的灭菌抽滤器及装有0.45 μm无菌滤膜(Millipore, 美国)过滤地下河水5~6 L, 过滤后将滤膜取出放入灭菌离心管(50 mL)内密封, 低温保存(冰包), 运回实验室冷冻保存(-20℃).

利用德国Testo公司生产的Testo535 CO₂测量仪(检测范围为1×10^-6~9 999×10^-6)进行洞穴空气CO₂体积分数的监测.洞外气温和降雨量数据来自安放在距雪玉洞洞口1 km的美国Davis公司生产的BS28-VP2型野外小型气象站, 其中温度记录范围为(40~65)℃(±0.5℃)、降雨量记录范围为0~819 mm(±4%), 记录时间间隔为30 min.现场测试水样水温、pH值、电导率以及HCO₃^-浓度.水温、pH值、电导率采用德国WTW公司生产的Multi350i测定, 精度分别为0.1℃、0.01和1 μS·cm^-1. HCO₃^-浓度用德国产Merck碱度计测定, 精度为0.1 mmol·L^-1.用于测试阳离子浓度的水样用50mL聚乙烯塑料瓶采集, 并加入1 :1优级纯硝酸酸化至pH＜2, 以防止阳离子附着在瓶壁上.用500 mL聚乙烯塑料瓶收集地下水测试阴离子浓度.阳离子浓度的测试工作在西南大学地理科学学院地球化学与同位素实验室完成, 使用仪器为美国Perkin-Elmer公司生产的Optima-2100DV电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES), 测量相对误差＜5%.阴离子浓度测试在西南大学地理科学学院水化学分析室和有机污染分析室进行.使用的仪器为日本岛津公司生产的UV2450紫外分光光度计, 检测精度优于0.01 mg·L^-1.

根据基因组DNA提取试剂盒Water DNA Kit D5525(OMEGA, USA)标准方法提取DNA：①水体样品经0.45 μm微孔滤膜过滤后, 滤膜直接在经Buffer SLX重悬后, 70℃处理10 min裂解细菌; ②加入Buffer SP2离心去除杂质, 加入异丙醇沉淀基因组DNA; ③加入Elution buffer溶解DNA, 加入HTR Reagant吸附去除腐殖酸; ④加入Binding Buffer调节结合条件, 离心过柱进一步纯化基因组DNA; ⑤经过两步快速洗涤后, 最后用Elution buffer洗脱DNA, -20℃保存DNA模板.

将基因组DNA利用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行荧光定量扩增. PCR扩增反应体系(20 μL)为5×FastPfu Buffer 4 μL, dNTPs(2.5mmol·L^-1) 2 μL, 338F(5 μmol·L^-1)0.8 μL, 806R(5 μmol·L^-1)0.8 μL, FastPfu Polymerase 2 μL, DNA模板10ng, 用无菌水补至20 μL. PCR扩增条件为：95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 45 s, 27个循环; 72℃ 10 min.获得的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物, Tris-HCl洗脱, 将PCR产物用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行定量检测, 按照每个样品的测序量要求, 进行相应比例的混合, 测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成.

使用软件QIIME(版本1.9.1)对测序数据去杂：①过滤reads尾部质量值20以下的碱基, 设置50bp的窗口, 如果窗口内的平均质量值低于20, 从窗口开始截去后端碱基, 过滤质控后50bp以下的reads, 去除含N碱基的reads; ②根据PE reads之间的overlap关系, 将成对reads拼接(merge)成一条序列, 最小overlap长度为10 bp; ③拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2, 筛选不符合序列; ④根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品, 并调整序列方向, barcode允许的错配数为0, 最大引物错配数为2.数据库被进一步分类以除去类似于叶绿体或蓝细菌的序列, 最终获得了3个样品的60 247个序列数.

通过归类操作(cluster), 将序列按照彼此的相似性分归为许多小组, 一个小组就是一个操作分类单元OTU(Operational Taxonomic Units).根据不同的相似度水平, 对所有序列进行OTU划分, 使用Uparse^[21](version 7.1 http://drive5.com/uparse/)方法软件, 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列.为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 采用RDP classifier(版本2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 置信度阈值为0.7.

对97%相似水平下的OTU进行多样性统计分析, 多样性指数包括香农维纳指数(Shannon Wiener)、辛普森指数(Simpson)和Chao1指数.香农维纳指数反映样品中微生物多样性的指数. Shannon值越大, 说明群落多样性越高.辛普森指数用来估算样品中微生物多样性指数, 在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性. Simpson指数值越大, 说明群落多样性越低. Chao是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数, chao1在生态学中常用来估计物种总数.稀释性曲线^[22](Rarefaction curve)用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度, 也用来说明样本的测序数据量是否合理, 利用mothur软件做Rarefaction分析, 利用R语言工具制作曲线图.群落柱形图基于tax_summary_a文件夹中的数据表, 使用R语言工具作图.

RDA/CCA又称多元直接梯度分析, 主要用来反映菌群与环境因子之间的相互作用关系, 将对应分析与多元回归分析相结合, 每一步计算均与环境因子进行回归. RDA是基于线性模型, CCA是基于单峰模型.分析可以检测环境因子、样本、菌群三者间的关系或者两两之间的关系^{[6, 23]}. RDA或CCA模型的选择原则：先用species-sample数据(97%相似性的样本OTU表)做DCA分析, 看分析结果中Lengths of gradient第一轴的大小, 如果大于4.0, 就应该选CCA, 如果在3.0~4.0之间, 选RDA和CCA均可, 如果小于3.0, RDA的结果要好于CCA; 通过bioenv函数判断环境因子与样本群落分布差异的最大Pearson相关系数, 通过最大相关系数得到环境因子子集; 将样本物种分布表与环境因子或环境因子子集分别做CCA或者RDA分析; 通过类似于ANOVA的permutest分析来判断CCA或者RDA分析的显著性.利用软件R语言vegan包中RDA或者CCA分析和作图.相关性Heatmap图表示的是微生物分类与环境变量比较, 评估微生物分类与环境变量之间的相关性(Spearman相关).基本输出是一个距离矩阵, 表示群落中每个微生物分类与每个环境因子变量之间的相关系数, 可以用热图直观的展现数值矩阵.分析软件为R(pheatmap package).

细菌群落多样性指数(图 2)结果表明, 3个样品的细菌群落多样性很高, 雪玉洞上游、下游以及水鸣洞3个地下水样品的覆盖度为99%, 98%和98%.当香农维纳指数曲线趋向平坦, 测序数据量足够大, 可以反映样本中绝大多数的微生物信息.从香农维纳指数和辛普森指数(表 1)来看, 雪玉洞地下水细菌多样性较高, 香农维纳指数都大于4.7, Chao1指数都大于400, 水鸣洞地下水细菌多样性较雪玉洞低.

图 2

Fig. 2

图 2 地下水细菌的多样性指数 Fig. 2 Bacteria diversity index in the underground streams

表 1 (Table 1)

表 1 细菌16S rDNA的多样性指数 Table 1 Diversity index of bacterial 16S rDNA 采样点 测序数据量 OTUs 香农维纳指数 辛普森指数 Chao1 雪玉洞上游 13 589 543 4.72 0.029 6 548 雪玉洞下游 5 728 391 4.7 0.024 6 498 水鸣洞 3 928 265 4.02 0.046 5 327

表 1 细菌16S rDNA的多样性指数 Table 1 Diversity index of bacterial 16S rDNA

从3个地下水样品细菌OTU分布Venn图来看(图 3), 地下水中细菌种类繁多, 每个地下水样品中都存在的OTU数量为186, 占雪玉洞地下水中细菌OTU的20%, 占水鸣洞地下水中OTU总量的70%左右.雪玉洞上游地下水中独有OTU最多, 共计148种独有OTU, 而雪玉洞下游和水鸣洞分别只有16种、19种独有OTU.其中雪玉洞上游地下水中独有OTU主要的属有蓝藻细菌(norank_c_Cyanobacteria)、棒状杆菌属(Corynebacterium_1)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、柠檬球菌属(Citricoccus)、地杆菌(Geobacter)和Simplicispira; 雪玉洞下游地下水中独有OTU主要有Alloprevotella、Arenimonas、Brochothrix、Candidatus_Omnitrophus和Chitinivorax; 水鸣洞地下水中独有OTU主要有甲基球菌科(norank_f__Methylococcaceae)、紫单胞菌科(unclassified_f__Porphyromonadaceae)、弧菌属细菌(Vibrio)和Sideroxydans; 3个地下水样品中共有OTU中大于2%的属主要有不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)和norank_f__BSV26.

图 3

Fig. 3

红色表示雪玉洞上游; 绿色表示雪玉洞下游; 天蓝色表示水鸣洞; 黑色表示3个地下水样品共有OTU中的属 图 3 地下河样品细菌OTU Venn图 Fig. 3 OTU Venn diagram of bacteria in the underground river samples

所获得序列共分属于19个门类[图 4(a)], 其中变形菌门(Proteobacteria)是最多的门类, 所占比例在35%以上, 其次是拟杆菌门(Bacteroidetes), 所占比例在10%以上.除绿菌门(Chlorobi)以外, 其他类群所占比例较小, 包括酸杆菌门(Acidobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、异常球菌属-栖热菌属(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Bacteria_norank、Bacteria_unclassified、Candidate_division_OP3、BD1-5和CKC4, 这些类群所占比例在2%以下.

图 4

Fig. 4

图 4 地下水细菌群落组成(＞1%) Fig. 4 Distribution of bacterial 16S rDNA gene sequence clones from each underground river sample(> 1%)

两个洞穴地下水中的细菌群落组成[图 4(a)]存在差异, 以变形菌门和拟杆菌门为主, 变形菌门所占比例超过30%(水鸣洞样品为38%, 雪玉洞样品都超过60%), 拟杆菌门所占比例大于10%.两个洞穴地下水中的优势种类存在差异, γ-变形菌纲(γ-Proteobacterium)和拟杆菌门为雪玉洞的优势种类, 但水鸣洞中除优势菌落γ-变形菌纲和拟杆菌门外, 出现雪玉洞中未发现的绿菌门(Chlorobi), 所占比例24%.

γ-变形菌纲占了变形菌门的绝大部分, β-其次, α-、δ-和ε-变形菌门占变形菌门的比例较小.而γ-变形菌纲在两个洞穴地下水中的主导细菌种类存在差异[图 4(b)].不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)为雪玉洞样品中的主要细菌, 上游地下水分别占γ-变形菌纲的51%和32%, 下游地下水分别占γ-变形菌纲的43%和17%, 水鸣洞中除不动杆菌属和假单胞菌属分别占γ-变形菌纲的16%和11%外, 未培养的甲基球菌科(Methylococcaceae-uncultured)、甲基单胞菌属(Methylomonas)以及甲基杆菌属(Methylobacter)分别占水鸣洞中主要的γ-变形菌纲类群的19%、14%和10%.此外, 地下水中仅次于变形菌门的拟杆菌门主导菌群[图 4(c)]也有所不同.雪玉洞两个洞穴地下水样品中黄杆菌科(Flavobacteriaceae)为主, 所占比例分别为54%和66%;而水鸣洞中黄杆菌科占32%, 另有Chitinophagaceae科占28%.

雪玉洞和水鸣洞细菌群落结构以γ-变形菌纲和拟杆菌门为主, 与其他碳酸盐洞穴与硫酸岩洞穴中的细菌群落结构存在显著差异(表 2).如罗马尼亚Movile洞微生物席中β-和γ-变形菌相对丰度接近, 均在20%以上, 而α-变形菌、δ-变形菌及拟杆菌门相对丰度都在10%以上^[24], 与雪玉洞和水鸣洞地下河水中的细菌组成类似.美国维吉尼亚Cesspool洞优势群落为γ-变形菌, 所占比例大于40%, ε-变形菌大于20%^[24]; 意大利Frasassi洞穴地下河生物薄膜中γ-变形菌为优势群落, 所占比例大于50%, 其次为δ-和ε-变形菌纲, δ-变形菌为34%, ε-变形菌纲大于20%^[25]; 以上两个洞穴水的细菌优势群落均为γ-变形菌, 但与雪玉洞和水鸣洞相比ε-变形菌在20%以上.美国俄怀明州Lower Kane洞微生物席优势种群为ε-变形菌, 所占比例为68%, γ-变形菌和β-变形菌占12.2%和11.7%^{[26, 27]}; 美国Glenwood Springs的优势群落为ε-变形菌, 所占比例为60%, γ-变形菌不到10%, 放线菌门(Actinobacteria)占14.1%^[28]; 这两个洞穴水的细菌优势群落均为ε-变形菌, 与雪玉洞和水鸣洞不同的是, ε-变形菌都大于60%. ε-变形菌的大量存在说明与硫循环有关, 雪玉洞、水鸣洞地下水的细菌群落结构ε-变形菌所占比例小而以γ-变形菌为主, 可能与游客活动有关.

表 2 (Table 2)

表 2 其他碳酸盐洞穴与硫酸岩洞穴优势群落1)/% Table 2 Major affiliations for microbial communities found in karst cave or sulfidic cave systems/% 优势群落 雪玉洞 (上游/下游) 水鸣洞 Movile洞[24] Cesspool洞群[24] Frasassi洞[25] Lower Kane洞[26, 27] Glenwood洞[28] 地下河水 地下河水 微生物席 洞穴水 地下河水 微生物席 热泉水 Proteobacteria 62/64 38 Y   α-Proteobacterium 6/7 2 ＜5 Y   β-Proteobacterium 8/15 17 ＞25 ＜5 ＞5 11.7   δ-Proteobacterium 2/1 1 ＞10 ＜10 34 0.8 1.2   γ-Proteobacterium 46/40 17 ＞20 ＞40 ＞50 12.2 9.4   ε-Proteobacterium 0.7/Y 0.1 ＞15 ＞20 ＞20 68 60 Actinobacteria 10/11 2 Y 14.1 Bacteroidetes 11/16 19 ＞15 Y Y 1.7 Y Chlorobi Y/Y 24 1) Y表示1%＜OUT＜2%

表 2 其他碳酸盐洞穴与硫酸岩洞穴优势群落1)/% Table 2 Major affiliations for microbial communities found in karst cave or sulfidic cave systems/%

可能受游客带入微生物所致, 数据显示雪玉洞内部有大量的外来细菌如不动杆菌属^[29]和假单胞菌属^{[30, 31]}.此外, 雪玉洞上游发现存在一定含量的ε-变形菌纲, 一般认为ε-变形菌纲为参与硫循环的化能自养细菌, 适宜于贫营养环境, 广泛存在于未受人类影响的洞穴中^{[26, 27]}.本研究中, 雪玉洞上游位于洞穴最深处, 相对洞内其他部分, 微生物群落最原始, 因此含有较多洞穴原生细菌; 在地下河下游, 由于洞穴环境和微生物群落发生改变, 大量原生洞穴细菌消失.如表 2所示, 与其他洞穴样品相比, 除土壤样品^{[32, 33]}外, 雪玉洞和水鸣洞地下河中细菌群落相对丰度较高.从洞穴地下水中所含细菌种类和数量来看, 游客众多的雪玉洞高于水鸣洞(图 3)和其他洞穴.对于雪玉洞而言, 雪玉洞上游地下河水中可能同时含有洞内原生微生物和人类活动带入的微生物, 导致微生物种类和数量远高于下游.因此, 人类旅游活动影响导致洞穴地下水细菌种类与数量发生变化.

地下水中细菌类型也反映了游客活动和洞穴环境影响.雪玉洞两个地下水样品中主要细菌种类为变形菌门、拟杆菌门而水鸣洞中还含有一定量的绿菌门[图 4(a)].绿菌门为绿硫细菌的一种, 属于光能自养细菌.由于水鸣洞洞道较短, 洞内有微弱光照, 导致光能自养微生物的存在.水鸣洞中Ignavibacteriales目的存在, 与硫氧化细菌功能相似, 有利于硫循环^[34].另外, 水鸣洞中主要为甲基球菌科、甲基单胞菌属以及甲基杆菌属^{[35, 36]}[图 4(c)], 这类细菌是利用甲烷作为碳源获得能量的化能自养菌, 被称为甲烷氧化菌, 广泛存在于陆地、海洋环境中, 总体而言能适应比较贫瘠的环境, 属于受洞穴本身环境影响的原生微生物群落组分.大量的人类旅游活动带来了足量的外来碳、氮源, 改变了洞穴中原本的贫营养环境, 使原本洞穴中比较重要的化能自养细菌如ε-变形菌纲、甲基球菌科等在洞穴微生物群落中的营养优势降低, 反之原本不适应贫营养环境的化能异养细菌在竞争中更具有优势.大量游客进入洞穴, 改变了洞穴气流; 洞穴内的养分主要来自垃圾、灰尘、动物粪便、植物腐殖质和风化形成的泥土, 游客随身携带的尘土和有机物会改变洞内微生物养分获取方式; 开发洞穴中固定灯具照明和游客进入游览拍摄时增加的辅助闪光灯, 使洞内的灯光植物消减.另外, 人类活动也带来了大量的外来细菌不动杆菌属、假单胞菌属等, 这类细菌对环境的适应性极强, 在获得充足营养物质来源的基础上, 在洞穴中停留繁殖, 从而占据有利地位, 成为洞穴中的优势群落.不动杆菌属和假单胞菌属都是自然界广泛存在的细菌种类, 在土壤和自然水域等都大量存在, 两类细菌都属于异养菌, 包含大量致病菌种类, 需要在营养相对较多的环境中生存.假单胞菌属是受人类影响较大的开放洞穴中的主要细菌之一, 其存在可能破坏洞穴的环境, 对洞穴及其保护不利^{[37, 38]}.雪玉洞中Chitinophagaceae科的缺失也能证实以上结论[图 4(c)], Chitinophagaceae科和黄杆菌科都是广泛存在于土壤中的拟杆菌门细菌^[39], 但是Chitinophagaceae科能分解利用木质素, 营养受限制时更有利于其生长繁殖.

为探讨游客活动对地下水细菌群落的影响程度, 采用RDA/CCA分析, 对3个地下水样品的环境因子(游客数量、降雨量、洞穴空气温度、洞穴空气CO₂、地下河流量、水温、电导率、pH、HCO₃^-、NO₃^-、SO₄^2-、F^-、Cl^-、Si、K、Na、Mg、Ca、Ba和Sr等)与地下水细菌群落属分类水平总丰度前30的物种进行回归分析, 验证不同细菌类群地理分布与环境因子之间的关系.由于环境因子多于样品个数, 为更准确地分析环境因子与细菌群落的分布关系, 结合RDA/CCA分析方法的自身特点, 对环境因子进行两两分组逐一分析.选取一组影响最显著的环境因子进行论述, 结果作图分析, 如图 5所示, 其中箭头表示环境因子, 倒三角表示物种, 圆圈、正三角、菱形代表样本, 物种与环境因子之间的夹角代表两者之间的正相关(锐角)、负相关(钝角)、不相关(直角), 由不同样品向环境因子做垂线, 投影点间的远近代表该环境因子对样品的影响程度^[40].不动杆菌属、假单胞菌属等菌属与游客数量(tourist)和洞穴空气(CO₂)呈正相关而某些菌属与游客数量之间呈现出负相关(图 5), 从而再次表明人类旅游活动对洞穴菌种具有明显的影响作用, 对某些菌落的消亡起到了积极的作用.通过雪玉洞上游(up)与下游(down)样品点对环境因子tourist和CO₂投影点距离分析发现：无论是洞穴空气CO₂还是游客数量对雪玉洞上游与下游的影响程度存在着明显的差异, 其中游客数量相比洞穴空气CO₂具有更高的影响程度.导致该种状况的原因, 可能是由于雪玉洞上游的生态相较下游而言更加地敏感脆弱, 环境因子的变化对洞穴内部的影响更大.

图 5

Fig. 5

箭头代表环境因子, 倒三角代表物种 图 5 地下水细菌群落与环境因子RDA/CCA分析 Fig. 5 RDA/CCA analysis results showing the relationship between environmental factors and the bacterial community

为进一步探讨游客数量和洞穴空气CO₂对地下水细菌群落结构的影响程度, 通过环境因子相关性Heatmap图来评估微生物分类与环境变量之间的相关性^[41], 影响因子及细菌群落的选取与RDA/CCA分析中一致, 如图 6所示, 该方法在某一置信区间(P)内将每个微生物与每个环境因子变量之间的相关系数(R)输出一个距离矩阵, 其中相关系数的大小以热图表示, 颜色的深浅表示相关系数绝对值的大小(图 6).结果显示, 致病菌属(不动杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属等)与游客数量之间呈现高度正相关(R=0.866＞0.8, P=0.033)与洞穴空气CO₂呈现正相关(R=0.5, P=0.067).因此, 某些细菌菌属的群落组成随着游客数量的增加而丰富.此外, 人类旅游活动会增加洞内空气CO₂浓度^[15]进而对细菌菌属起到更加积极的作用.对于硝化螺旋菌属(Nitrospira)、unclassified-Chitinophagaceae、norank-Hydrogenophilaceae、norank-BSV26和Deefgea(图 6), 表现为高度负相关(|R=-0.866|＞0.8, P=0.033)而与洞穴空气CO₂则具有完全的线性关系(|R=-1|=1, P=0), 对于上述菌属而言, 人类旅游活动对该类细菌菌属结构的影响是致命的, 如图 7所示, 水鸣洞中丰度高的原生细菌unclassified-Chitinophagacea、norank-Hydrogenophilaceae和norank-BSV26在雪玉洞几乎不存在, 由此可见, 雪玉洞受游客活动影响, 导致大量原生细菌消失.

图 6

Fig. 6

X轴和Y轴分别为环境因子和物种, 通过计算获得R值, R值在图中以不同颜色展示, 右侧色卡是不同R值的颜色分区; tourist表示游客数量, CO2表示洞穴空气CO2 图 6 地下水细菌群落与环境因子相关性Heatmap图 Fig. 6 Spearman Correlation Heatmap between environmental factors and the bacterial community in groundwater

图 7

Fig. 7

热图下侧和右侧分别为样本名称和物种名称, 左侧和上侧分别为物种聚类树和样本聚类树, 热图中颜色的深浅分别代表物种丰度的高低 图 7 地下水细菌群落Heatmap图 Fig. 7 Heatmap of bacterial communities in groundwater

建议旅游洞穴控制每日游客量并分批进入, 增加进出口密闭装置, 避免洞穴气流内外交换; 在进出口增加除菌装置, 减少游客随身携带细菌和有机物, 同时避免将垃圾留于洞内, 减少洞内外微生物交换; 减少洞内固定灯具照明, 通过游客携带冷光源照明灯具, 实现人走灯灭, 减少长时间照射.

(1) 地下水中细菌群落组成显示, 两个洞穴地下水样品细菌以变形菌门和拟杆菌门为主, 变形菌门所占比例超过30%, 拟杆菌门所占比例大于10%. γ-变形菌纲和拟杆菌门为两个洞穴地下水中的优势种群但其主导细菌种类存在差异：不动杆菌属、假单胞菌属和黄杆菌科为雪玉洞样品中的主要细菌, 属于致病菌; 水鸣洞中主要的γ-变形菌纲细菌是未培养的甲基球菌科、甲基单胞菌属以及甲基杆菌属, 属于甲烷氧化菌.

(2) 多样性指数分析结果显示受旅游活动强烈影响的雪玉洞的群落多样性较未开发的水鸣洞丰富且旅游洞穴相对未开发的洞穴存在更多的致病菌群落.地下水细菌群落与环境因子的多元直接梯度分析(RDA)结果表明细菌群落分布规律与游客数量和洞穴空气CO₂两种环境因子呈正相关, 游客数量对地下水细菌群落结构的影响更为明显并导致大量原生细菌消失.