2018, Vol. 39
2. 神华集团中国节能减排有限公司, 北京 100011
2. China Energy Saving and Emission Reduction Limited Company of Shenhua Group, Beijing 100011, China
传统硝化工艺首先在氨氧化菌(AOB)作用下, 将铵态氮转化为亚硝态氮, 然后通过亚硝酸盐氧化菌(NOB)使亚硝态氮氧化为硝态氮.短程硝化将氨氮氧化控制在亚硝酸盐氮阶段, 不仅可以节省25%曝气能耗, 反硝化过程还可以减少有机碳源投加量[1].近几年, 学者对短程硝化的关注力度有所增加.短程硝化的实现机理是利用AOB和NOB生理特性差异, 使AOB的生长速率高于NOB.实现和维持短程硝化的技术手段主要有：高温、高pH、高游离氨(FA)、高游离亚硝酸(FNA)、适宜的水力停留时间(HRT)、低溶解氧(DO).本研究采用比值控制[2]实现移动床生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)工艺短程硝化.短程硝化成功实现的关键因素是富集AOB, DO和NH4+-N是AOB生长繁殖的主要基质, 故优先选取DO和出水NH4+-N质量浓度作为控制因素. Bartrolí等[3]和Jemaat等[4]认为比值控制策略可同时调控DO和出水NH4+-N浓度, 发挥氨抑制和氧抑制双重作用, 最大程度可使氨氮100%氧化为亚硝态氮.目前, 短程硝化的关注热点多在于实现方法和维持手段, 对短程硝化微生物种群研究较少, 且鲜有对短程硝化的实现过程中菌群差异进行对比分析.了解生物膜内短程硝化实现过程中菌群的空间分布规律和群落结构及功能的变化, 对反应器尽快达到预期处理效果有一定的理论指导意义.
不同的短程硝化实现手段可影响胞外聚合物(EPS)的分泌和组成成分.胞外聚合物(EPS)是细胞新陈代谢分泌的一种高分子聚合物, 包裹在微生物细胞膜外面, 是生物膜的重要组成部分, 具有保护和维持生物膜的作用. EPS的成分主要以蛋白质(PN)和多糖(PS)为主(约70%~80%), 其余20%~30%为核酸、脂类和其他物质. EPS成分和空间结构的改变, 直接影响生物膜的亲和性、凝聚性和传质阻力等理化性能.李延等[5]探究了SBBR反应器运行周期中EPS产生和变化特征, 揭示了EPS在反应器运行中的重要作用.因此, 考虑到EPS在污水处理中的重要性, 深入研究和辨识EPS主要成分, 对更好地理解短程硝化的实现机理具有十分重要的意义.但是, 目前对这方面的研究较少.
荧光原位杂交(FISH)利用已知的携带荧光标记的特异寡核苷酸片段作为探针, 与待测微生物DNA依据碱基互补配对原则进行杂交, 可对被测微生物种群进行定性、定位和半定量分析[6].但由于传统荧光显微镜精确度不高, 对荧光物质分析存在较大偏差, 故FISH常与激光共聚焦显微镜技术(CLSM)联用. CLSM激光穿透性强, 可对样本进行一定深度光学断层, 更全面、形象地分析生物膜结构[7].本研究利用FISH和CLSM联用技术, 探究MBBR反应器短程硝化实现过程中菌群演替和空间变化规律.三维激发发射矩阵(EEM)具有高选择性和不损坏样品等优点, 广泛用于EPS测定.本文研究了在短程硝化实现过程中EPS的含量和组成的变化, 并解析了不同时期生物膜样品荧光吸收类有机组成与浓度的变化特征.
1 材料与方法 1.1 反应器运行概况本实验装置采用连续流反应器, 如图 1所示.反应器为立方体结构, 长×宽×高为18 cm×12 cm×18 cm, 有效体积约为4.3L.反应器材质采用有机玻璃, 底部设有曝气盘.用DO和pH探头在线监测DO、pH值的变化.生物膜载体采用鲍尔环, 由高密度聚乙烯, 辅以多种微量元素及改性剂加工而成, 内部设有交叉支撑面, 外部为波浪状沟棱, 其主要技术参数为：密度>0.96 g·cm-3, 规格Ф25 mm×10 mm, 有效表面积>400 m2·cm-3.鲍尔环填充体积约为1 L.成功挂膜后的鲍尔环上形成一层淡黄色薄膜.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of experimental device |
反应器直接填充已成功挂膜、并已连续运行200 d的鲍尔环, 此时亚硝酸盐积累率(NAR)约为5%.此时, FISH分析显示, AOB约为NOB的1%±1%.进水水质采用人工配水, NH4+-N(NH4Cl)质量浓度约为60 mg·L-1, COD(CH3COONa)值90 mg·L-1, 磷(KH2PO4)为2 mg·L-1, 通过调节投加NaHCO3量, 维持pH为7.8~8.2.同时添加适量营养液, 为微生物生理活动提供所需微量元素. MBBR工艺采用比值控制方式实现短程硝化, 通过调节转子流量计和蠕动泵, 控制曝气量和HRT, 从而调节DO和出水NH4+-N浓度, 改变和维持DO/NH4+-N值.
1.2 水质检测NH4+-N：纳氏试剂分光光度法; NO2--N：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N：麝香草酚分光光度法; DO、pH和T采用在线探头检测(WTW, 德国).定义亚氮积累率为NAR=NO3--N/(NO2--N+NO3--N), 其中NO3--N、NO2--N均指由NH4+-N氧化而来的部分. MLSS、MLVSS：超声波(45 kHz, 120 W, 2~3 min)剥落生物膜, 离心(10000 g, 15 min)后重量法测量.
1.3 生物膜分析 1.3.1 荧光原位杂交(FISH)本实验采用荧光原位杂交技术(FISH)和共聚焦激光显微镜技术(CLSM)分析生物膜内总菌、AOB和NOB的空间分布规律.样品用1×PBS溶液清洗3次, 然后置于4%多聚甲醛溶液于4℃固定1~3 h, 固定后样品可在-20℃环境下保存6个月.加入杂交缓冲液和探针的混合液, 放入46℃杂交箱杂交2~3 h, 再用清洗缓冲液清洗20 min[8, 9].杂交后样品加入抗荧光衰减剂, 避光保存, 依次在共聚焦激光扫描显微镜(FV1200, Olympus, Japan)下观察.实验中探针主要特性[10, 11]如表 1所示, 探针上所携带荧光染料均在5′末端标记, 根据荧光颜色的不同来区分细胞种类.
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表 1 实验所用FISH探针的主要特性 Table 1 Main characteristics of the FISH probe used in the experiment |
1.3.2 CLSM荧光染色观察
用可以穿透细胞膜、对细胞毒性较低的荧光染料Hoechst 33342, 标记活细菌; 碘化丙啶(propidium iodide, PI)可穿过破损细胞膜, 对细胞核染色, 但不能通过活细胞膜[12], 标记死细胞.异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)是氨基标记荧光染料, 具有较强的蛋白结合能力, 本实验中用来指示胞外蛋白质. Hoechst 33342和PI染色同一样品, FITC单独染色.生物膜样品荧光染色所用染料、激发波长、发射波长和使用浓度见表 2.具体染色过程如下：取生物膜样品用1×PBS清洗3遍; 首先加入Hoechst 33342(10 μL, 0.01 mg·mL-1)染色30 min(置于200 r·min-1恒温摇床中, 以下染色过程条件相同); 随后加入PI(1 μL, 0.02 mg·mL-1)染色30 min; 再加入FITC(10 μL, 10 mg·mL-1)染色1 h; 上述每种染料染色结束后均用1×PBS清洗3遍.最后用FV1200显微镜观察样品.
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表 2 CLSM所用荧光染料的主要特性 Table 2 Main characteristics of fluorescent dyes used in the CLSM |
1.3.3 高通量测序[13]
分别取短程硝化不同时期鲍尔环样品, 将生物膜从载体上剥离, 离心预处理后, 送往上海生工进行高通量测序分析.
1.3.4 EPS测定预处理方法同1.3.3节, 离心得到的沉淀物置于PBS中, 将混浊悬浮液水浴80℃加热0.5 h, 再次离心所得上清液即为EPS样品.所得样品一部分用于PN、PS检测：PN采用考马斯亮蓝法, PS采用蒽酮法; 一部分用于三维荧光光谱测定：采用荧光光谱仪(F-7000, 日本日立), 设置激发(Ex)波长200~400 nm, 每次增加5 nm, 发射(Em)波长240~600 nm, 波长间隔2 nm, 激发光和发射光的狭缝均为5 nm, 扫描速度为1200 nm·min-1.
2 结果与讨论 2.1 MBBR反应器运行工况接种鲍尔环在高曝气(DO为7~8 mg·L-1)下实现全程硝化.图 2显示MBBR反应器运行期间NO3--N、NO2--N、NH4+-N和NAR的变化.反应器运行期间调节DO约为2.0 mg·L-1和出水NH4+-N浓度约8.0 mg·L-1, DO/NH4+-N=0.25±0.05.经过20 d运行, 成功实现短程硝化, NAR在第20 d达90.54%, 说明采用比值控制(DO/NH4+-N)可高效迅速实现MBBR工艺短程硝化.根据亚硝酸盐积累情况, 1~20 d为短程硝化实现阶段, 21~60 d为短程硝化稳定运行阶段.前20 d, 出水NO3--N浓度由46.83 mg·L-1降为4.58 mg·L-1, NO2--N浓度由2.69 mg·L-1逐渐升高至46.03 mg·L-1.短程硝化稳定运行阶段, 出水NO3--N、NO2--N浓度约为(3.62±0.1) mg·L-1和(46.64±0.2) mg·L-1, NAR值均在90%以上, 说明生物膜上AOB活性很高, NOB处于抑制状态.分别取NAR=10.27%(2 d)、NAR=52.12%(10 d)和NAR=93.54%(45 d)时样品生物膜进行检测分析.
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图 2 NO3--N、NO2--N、NH4+-N和NAR变化 Fig. 2 Variation of NO3--N, NO2--N, NH4+-N and NAR |
EUB338、EUB338 Ⅱ、EUB338 Ⅲ三者标记的细菌总和记为总菌, 携带FAM荧光染料, 激发后呈现绿色; NSO190为β-氨氧化菌的通用探针, 采用Cy3荧光染料标记, 激发后呈红色; NIT3探针5′端用Cy5染料标记, 激发和发射波长分别为630 nm和670 nm, 呈紫色.随机选取样品上荧光强度较强的某点, 进行分层扫描, 利用FV10-ASW 4.20 Viewer软件对图像三维重组.图 3为样品荧光原位杂交3D照片, 其中T1、T2、T3是NAR为10.27%、52.12%和94.53%这3个时期生物膜总菌三维图像; A1~A3、N1~N3分别为3时期AOB和NOB三维图像.
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图 3 FISH原位杂交3D照片 Fig. 3 FISH 3D images of simples |
FV1200显微镜激光束发射点位于样品下方, 故3D图像下层为生物膜最外层.由图 3可以看出, 短程硝化不同时期生物膜上细菌空间分布大致相同.生物膜外层荧光强度最弱, 说明外层微生物分布最少.分析其原因, 外层生物膜直接与原水接触, 水质水量波动较大, 生物膜易脱落, 细菌不易生长; 同时, 以胞外蛋白质指示胞外聚合物, 做CLSM荧光染色分析, 如图 4(a)所示, 图像下层为生物膜最外层, 该层蛋白质荧光强度最大, EPS聚集最多, 故生物膜外层细菌生长空间变少.随着扫描深度的增加, 总菌、AOB、NOB所代表的荧光强度均有大幅度增加, 说明微生物种群主要分布在生物膜内部.分析其原因, 生物膜内部环境更稳定, 菌群所需DO和基质都十分丰富, 适宜细菌增殖.当激光束照射到直接与载体接触的最内层生物膜时, 荧光稍有减少, 说明微生物菌落有所减少.这是因为生物膜上存在传质阻力, 使得传递到最内层生物膜的DO和基质大大减少, 细菌生长受到抑制, 故微生物数量和种类较少.
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图 4 CLSM荧光染色图 Fig. 4 CLSM fluorescent staining images |
CLSM分层扫面结果表明, MBBR工艺生物膜厚度约30 μm, 硝化细菌主要分布在生物膜表面的6~25 μm处, AOB和NOB分布位置并无明显区别.另外, 观察图 3中A1~A3和N1~N3发现AOB和NOB硝化细菌层位于其他异养细菌层里面, 这是由于异养菌和硝化菌对生存基质的竞争导致生物膜结构出现分层现象[14].比增殖速率更高的异养菌靠近生物膜外层, 直接获取DO和有机碳源, 获得更多生存空间; 硝化细菌在较低DO下即可达到最大比生长速率, 故生长在异养菌内层.另外, 外层异养菌作为内层硝化细菌的屏障, 也有一定保护作用.更为重要的是, 异养细菌的内源呼吸作用会促使硝化层氧抑制的形成, 更易实现短程硝化.异养菌增殖迅速、活性高, 分泌EPS多, 硝化细菌增殖慢、活性低, 分泌EPS少, 这也阐明了图 4(a)中生物膜外层蛋白质含量最多的原因.同时观察到生物膜内微生物分布是不均匀的, 而且许多细菌聚集在一起, 形成菌胶团.且图 3中生物膜上没有细菌分布的区域, 可能存在空隙和沟壑, 这些结构或与基质和细菌代谢产物传递相关.
对生物膜样品进行活细胞和死细胞检测, 如图 4(b)所示, 蓝色荧光表示活细胞, 红色荧光表示死细胞.可以看出活、死细胞分布比较均匀, 活细胞数量是高于死细胞的, 且活细胞包围着死细胞.这是由于生物膜结构的阻碍作用, 位于生物膜内部的微生物由于DO、底物传质受限缺乏代谢所需物质而死亡.且图 4(b)中空隙和沟壑周围活细胞荧光强度较大, 这可能是由于空隙和沟壑是底物、DO的传输通道.
2.3 短程硝化实现过程中微生物菌落演替规律图 3显示了短程硝化不同时期, 总菌、AOB和NOB变化情况.从中可以观察到, 总菌空间结构和荧光强度变化不显著, AOB和NOB变化较为明显.第2 d NAR为10.27%时, 生物膜中AOB和NOB均存在; 随着短程硝化的实现, 图 3中N1和N2中NOB逐渐被洗脱, 但图 3中N3仍含有少量NOB, 说明比值控制(DO/NH4+-N)可通过抑制NOB活性可有效地实现短程硝化, 并且短程硝化的实现在NOB未完全洗脱的基础上仍可以实现, 这与Bian等[2]的结论是一致的, 但其也证实长期(>200 d)采用比值控制策略, 反应器后期基本上检测不到NOB.与此同时, 观察到亚硝酸盐积累率提升的同时, AOB的数量逐渐增多.比值控制高效地发挥氧抑制作用, 使得AOB比增长速率高于NOB, NOB活性一直处于高抑制状态, AOB受到较弱抑制, 经过长期运行, 反应器中AOB得以富集.
通过对NAR为10.27%、52.12%和93.54%时生物膜样品进行高通量测序, 了解短程硝化实现过程中异养菌、AOB和NOB等菌群变化.侯爱月等[15]和Wagner等[16]证实处理生活污水的微生物系统中变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主要优势菌门, 但拟杆菌门不含AOB和NOB, 故不作讨论.高通量分析报告显示, 变形菌门中β-变形菌门和α-变形菌门的丰度最高, β-变形菌门包含AOB、NOB、反硝化细菌和异养菌[17], 其中包含污水处理系统中最常见氨氧化菌Nitrosomonas和Nitrosospira, 因此可以认为富含AOB的生物膜样品β-变形菌门丰度可能很高; α-变形菌门中23%为异养菌[18], 还包含常见NOB菌属Nitrobacter. Nitrospira为另一种典型NOB菌属, 属硝化螺旋菌门(phylum Nitrospira). Nitrosomonas和Nitrosospira数量的总和计为AOB, NOB以Nitrobacter和Nitrospira计, 以“AOB/NOB”表征短程硝化性能. Shannon指数和Simpson指数是用来估算微生物多样性的指数之一, Shannon值越大, Simpson值越小, 微生物多样性越高.表 3中列出短程硝化不同时期不同细菌占总菌比例及AOB/NOB、Shannon、Simpson变化情况.
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表 3 短程硝化不同时期微生物种群特性 Table 3 Characteristics of microbial population during different periods of partial nitrification |
观察表 3, 在NAR逐步增长过程中, β-变形菌门在总菌中比例逐渐增大至68.17%, 但α-变形菌门所占比例由23.11%锐减至3.99%, 这与β-变形菌门中AOB菌属的富集和α-变形菌门中NOB的洗脱有一定的关系.但β-变形菌门和α-变形菌门之和占总菌的比例均超过70%, 印证了变形菌门是污水处理系统的主要菌门. Nitrosomonas菌属的含量逐步增加, 但Nitrosospira的比例减少, 可能是Nitrosomonas较高的比生长速率(0.088 h-1)和较好的环境适应性[19], Nitrosospira最大比生长速率仅为0.033~0.035 h-1[20], 但AOB所占比例由2.72%增至4.98%. NOB菌属Nitrobacter和Nitrospira所占比例均在减少, AOB/NOB比值递增至15.56, 说明生物膜反应器的硝化性能是逐步提升的.同时发现, 短程硝化稳定运行的第45 d, 生物膜中仍有0.41%的NOB存在, 这与FISH-CLSM结果是一致的. Shannon值下降了1.86, Simpson值增长了0.01, 说明短程硝化实现过程中微生物多样性降低, 这可能是因为AOB的大量聚集, 消耗DO过多, 使得某些菌群生长受限; 也可能是NO2--N积累, 对细胞起抑制作用的FNA浓度增大[21, 22], 部分菌群死亡.
2.4 生物膜EEM荧光光谱由图 4可以看出, 生物膜表面EPS含量最多, 既可富集环境营养物质传送至细胞, 也可形成保护层以抵制不利因素的影响; 生物膜内部EPS均匀分布, 包裹着细胞, 对支撑生物膜有着重要意义.有研究表明[23, 24], 短程硝化实现过程中, EPS产生量和化学结构会发生相应变化.图 5是短程硝化实现过程中, 不同时期(NAR为10.27%、52.12%、93.54%)生物膜EPS的EEM荧光光谱图.荧光图谱波峰位置、荧光强度、化学成分及PN、PS变化情况总结在表 4中.
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图 5 短程硝化不同时期EPS的EEM荧光光谱图 Fig. 5 EEM fluorescence spectra of EPS during different periods of partial nitrification |
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表 4 EPS荧光元素及PN、PS变化 Table 4 Variation of EPS fluorescence parameters, PN and PS |
结果显示, 短程硝化实现期间, 生物膜EPS都包含3种峰, 即芳香性蛋白质Ⅰ[Ex/Em=(220~250)/(280~330)nm]、芳香性蛋白质Ⅱ[Ex/Em=(220~250)/(330~380)nm]和微生物沥出物[Ex/Em=(250~280)/(290~380)nm]的特征峰, 说明在运行过程中生物膜的EPS物质结构和组成变化不大.但波峰位置、荧光强度和PN、PS值均有较大变化, 说明亚硝酸盐的积累对EPS分泌会有一定影响.其中峰A、D属于微生物沥出物, 峰B、C属芳香性蛋白质.短程硝化实现过程中, 仅图 4(a)、5(b)中特征峰A转化为图 5(c)特征峰D, 化学成分由Tryptophan PN-like转化为Tyrosine PN-like, 戚韩英等[25]证实Tyrosine PN-like的富集对生物脱氮系统有至关重要的作用.
其中微生物沥出物指示细胞代谢产物, 微生物沥出峰荧光强度越高, 说明细胞代谢越旺盛.观察表 4发现, 运行过程中, A(C)波峰荧光强度均先降低再增加, 这是由于起始生物膜反应器DO高达7~8 mg·L-1, 微生物活性较高, 分泌大量的EPS, 故此时波峰荧光强度处于最高值, 且PN和PS值(以VSS计)分别高达15.23 mg·g-1和24.16mg·g-1; 为实现短程硝化, 增强氧抑制, 反应器DO降至2 mg·L-1, 微生物活性降低, 分泌EPS量减少; 第45 d短程硝化已稳定运行25 d, 适应低DO环境的AOB等菌大量增殖, EPS分泌增多, 此时荧光强度和PN、
PS值均有所回升.而短程硝化过程中, 生物膜上芳香性蛋白质的荧光强度均是最高的, 其表示的是细胞物质的组成部分, 表明在整个反应过程中, 细胞更替是比较迅速的, 尤其是NAR由52.12%升至93.54%期间, B和C峰荧光强度各升高了579.63和145.65, 这与高通量分析报告中微生物种群多样性下降是相关的, 可能是由于NOB和其他不耐高FNA菌群的衰亡.整个反应过程, 并没有发现代表富里酸类物质[Ex/Em=(220~250)/(380~480)nm]和腐殖酸类物质[Ex/Em≥250/(380~480)nm], 李延等[5]认为, 腐殖酸类物质以溶解性为主, 没有滞留在EPS中.
3 结论(1) 采用DO/NH4+-N调控反应器工况, 经过20d运行成功实现短程硝化, 证实比值控制(DO/NH4+-N)是实现短程硝化的有效手段.
(2) 异养菌和硝化细菌共生于生物膜中, 既相互竞争又相互影响, 外层为异养细菌, 内层为硝化细菌.
(3) 在短程硝化的实现过程中, AOB菌属主要是Nitrosomonas, AOB/NOB高达15.56, 成功实现AOB富集、NOB抑制.但稳定运行时期仍存在0.32%的NOB, 说明在NOB未完全洗脱的情况下, 也可实现短程硝化.但反应器运行过程中微生物多样性下降, 说明亚硝酸盐积累率升高的同时, 可能抑制了某些种群活性.
(4) 反应器运行过程中, EPS与微生物菌群变化息息相关.微生物活性降低, EPS分泌较少; 短程硝化稳定时期, NOB等不耐FNA菌群衰亡, 芳香性蛋白质荧光强度下降.但整个过程中, EPS种类变化不明显.
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