2018, Vol. 39
2. 常州市环境监测中心, 江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室, 常州 213001;
3. 长沙理工大学水利工程学院, 长沙 410114;
4. 南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023
, LIU Fei1 , SUN Meng3 , JIANG Xiao-dong1 , GENG Jin-ju4 , TENG Jia-quan2 , XIE Wen-li2 , ZHANG Hao2 , CHEN Xin-yi2
2. Key Laboratory of Environmental Protection of Water Environment Biological Monitoring of Jiangsu Province, Changzhou Environmental Monitoring Center, Changzhou 213001, China;
3. School of Hydraulic Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China;
4. State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, School of Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China
浮游细菌是微生物食物网的关键组成部分, 在水生生态系统的生物地球化学循环和能量流入中具有关键作用[1].近年来, 水体富营养化和蓝藻水华暴发已经成为危害水生生态系统和人体健康的重大问题.太湖是我国第三大淡水湖, 自2007年无锡太湖区域蓝藻大面积暴发后, 通过控源截污、控氮降磷、调水引流、蓝藻打捞以及生态修复等治理措施, 水质有了明显改善, 但氮磷总量居高不下, 水体富营养化仍是其目前存在的主要问题[2].营养物质是淡水系统中蓝藻快速生长的主要因素, 其它因素如温度和pH值也可能在蓝藻水华暴发中扮演重要角色[3, 4].全球气候变暖会引起地表水温的升高, 致使春季太湖水温条件满足蓝藻快速繁殖的需求, 据报道, 至2017年5月15日, 相关部门已在太湖打捞蓝藻16.8万t, 是2016同期的5.5倍[5].蓝藻水华暴发后, 产生有毒物质(微囊藻毒素)会改变水生生态系统的群落结构[6].浮游细菌在淡水湖泊营养循环中发挥重要作用, 而竺山湾是太湖水质污染最严重的湖湾之一[7], 且一直以来都是太湖蓝藻水华暴发的重灾区[8], 但目前关于太湖竺山湾春季浮游细菌群落特征的研究还较少.
细菌的定量对于了解细菌在水生环境中的生态作用至关重要, 以往主要集中于利用PCR-DGGE[9, 10]和T-RFLP[11, 12]等技术研究太湖浮游细菌群落特征.随着分子生物学技术的发展, 高通量测序技术在微生物群落分析方面表现出前所未有的巨大优势[13], 并被广泛应用于湿地、土壤和生物膜等复杂环境中微生物群落结构的研究[14~16].为了获得细菌群落的高分辨率特征, 本研究采用16S rDNA扩增子测序, 基于Illumina HiSeq测序平台, 利用双末端测序的方法研究太湖竺山湾春季浮游细菌群落结构, 并利用冗余分析(redundant analysis, RDA)对浮游细菌与环境因子的相关性进行探讨, 以期为太湖春季蓝藻水华防控工作和建立优势菌群谱库提供参考数据.
1 材料与方法 1.1 样品来源与采集采样区为太湖竺山湾, 采样时间为2016年4月.共选取4个采样点(图 1), 分别为：雅浦港(120.075°E; 31.449°N)、沙塘港(120.035°E; 31.433°N)、竺山湖南(120.036°E; 31.373°N)和椒山(120.076°E; 31.340°N), 其中雅浦港和沙塘港位于河口区, 竺山湖南和椒山位于湖心区.文中图内分别以YPG、STG、ZSHN和JS表示雅浦港、沙塘港、竺山湖南和椒山.
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图 1 竺山湾采样点示意 Fig. 1 Sampling sites in Zhushan Bay |
使用灭菌的聚四氟乙烯塑料瓶采集水下0.5 m处的水样, 收集的样品进行冷藏保存并运回实验室进行预处理.使用经0.45 μm的混合纤维素滤膜过滤的水样测定水体理化指标, 待滤膜完全堵住后, 记录过滤的水样体积.用于高通量测序的水样先通过5 μm孔径滤膜过滤去除颗粒杂质, 再通过0.22 μm孔径滤膜过滤, 保存于-20℃条件下, 用于后续分析测试.
1.2 水体理化指标测定利用YSI水质分析仪(美国, YSI 6600)现场测定水样的水温、pH、叶绿素a(Chl-a)、藻密度和溶解氧(DO).每个采样点采集3份水样带回实验室测定总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)、总磷(TP)和磷酸盐(PO43--P)指标, 测定方法参照文献[17].
1.3 DNA提取与PCR扩增使用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP bio, USA), 按照试剂盒说明步骤提取基因组DNA, 使用NanoDrop2000超微量蛋白质核酸分析仪(Thermo Fisher, USA)测定提取出的DNA浓度和纯度后, 将DNA样品于-20℃中保存, 用于后续的PCR扩增等分析.
将提取好的DNA产物利用16S rDNA V1-V2区扩增引物进行PCR扩增[18], 引物序列(5′-3′)：正向引物AGAGTTTGATYMTGGCTCAG, 反向引物TGCTGCCTCCCGTAGGAGT. PCR产物以等密度比混合后使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)纯化.
1.4 高通量测序纯化后的产物送至江苏中宜金大分析检测有限公司使用Illumina(USA)的Hiseq平台进行高通量测序和分析.使用TruSeq® DNA PCR-Free样品制备试剂盒(Illumina, USA)生成测序文库.使用Qubit@2.0荧光计(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent, USA)评估测序文库质量.最后, 在Illumina HiSeq 2500平台(Illumina, USA)上进行了测序, 产生了250bp的配对末端读数.
1.5 数据分析为了使信息分析的结果更加准确、可靠, 首先对原始数据进行拼接、过滤, 得到有效数据.然后基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析.序列分析由Uparse软件进行, 将具有≥97%相似性的序列分配给相同的OTU, 筛选每个OTU的代表序列以进一步注释, 得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况.对于每个代表性的序列, 使用基于RDP分类器算法的GreenGene数据库来注释分类信息[19].
为了研究不同OTU的系统发育关系, 以及不同样本中优势种的差异, 使用MUSCLE软件(3.8.31版本)进行多序列比对; 基于QIIME(1.9.1版本)计算样品香农(Shannon)指数、辛普森(Simpson)指数、Chao1指数、文库覆盖率和Unifrac距离[20]; 处理后的数据使用Origin(8.5版本)绘图; 利用SPSS(17.0版本)进行细菌群落多样性与环境因子的Pearson相关性分析; CANOCO(4.5版本)用于优势细菌与水环境因子的冗余分析[21].
2 结果与讨论 2.1 水样水质分析各采样点的基本理化因子见表 1.从中可以看出竺山湾水体整体呈弱碱性, 平均水温为21.22℃.选择TN、TP和Chl-a作为评价指标, 根据文献[22]进行湖泊营养状态评价, 其中沙塘港、竺山湖南和椒山水体达到了中度富营养, 雅浦港水体达到了重度富营养.位于河口区的雅浦港和沙塘港的TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TP和PO43--P均高于位于湖心区的竺山湖南和椒山. DO变化范围为8.9~12.3 mg·L-1, 以雅浦港点位最低. Chl-a与藻密度是水体中藻类的监测指标, 雅浦港的Chl-a最高, 且藻密度仅次于椒山, 竺山湖南的Chl-a和藻密度均最低.
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表 1 各采样点的基本理化因子 Table 1 Physical and chemical factors for the sampling sites |
2.2 OTU聚类和多样性分析
各点位的OTU聚类结果和多样性指数统计见表 2. 4个采样点的文库覆盖率均为100%, 表明此次测序效果理想.稀释曲线(图 2)表明当4个采样点的测序数超过25 000时, 曲线渐进平缓, 测序量的增加不会引起OTU数目的上升[23].雅浦港、沙塘港、竺山湖南和椒山的样品最终得到注释信息的测序数均超过25 000, 可用于OTU聚类.对所有样品的有效序列以97%的一致性聚类成为OTUs, 得到的OTUs分别为雅浦港(89)、沙塘港(89)、竺山湖南(97)和椒山(144).
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表 2 各点位OTU聚类与多样性分析 Table 2 Clustering and diversity analysis of each site |
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图 2 稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curve |
选定衡量样品OTUs丰富度的Chao1、Simpson和Shannon指数来表征竺山湾的物种组成多样性.由Chao1指数反映出OTUs丰富度以椒山最高, 其次是竺山湖南, 位于同一湖区的沙塘港和雅浦港物种丰富度较为接近, 这表明椒山可能具有更丰富的细菌群落.由Shannon指数和Simpson指数表征物种分布的均匀度, Shannon指数和Simpson指数均为竺山湖南＞沙塘港＞雅浦港＞椒山, 表明物种分布均匀度以竺山湖南最高, 椒山最低.
描述点位到点位物种组成的β-多样性对于了解各种空间尺度上物种多样性的模式至关重要[24], 可以考察到不同点位和湖区的生境多样性, 有利于了解竺山湾的生物生产力差异.选用Weighted Unifrac距离指标来衡量样品间的相异系数(图 3).沙塘港与雅浦港位于河口区, 相异系数为0.297, 表明这两点物种多样性的差异较小.沙塘港与位于湖心区的椒山相异系数较大, 但与竺山湖南的物种多样性的差异小, 可能是由于沙塘港距离竺山湖南较近, 空间差异小. β-多样性反映出物种沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的相异程度, 相距最远的雅浦港和椒山的相异系数高达0.611.总体上看, 同一湖区的物种多样性差异小, 不同湖区的物种多样性差异大.
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图 3 β-多样性指数热图 Fig. 3 The β-diversity index heatmap |
竺山湾水样样品经高通量测序共得到OTUs为419, 基于RDP分类器算法的GreenGene数据库注释分类信息, 得出竺山湾门水平细菌群落结构(图 4).结果表明竺山湾优势菌门有蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿菌门(Chlorobi)等.
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图 4 门水平优势细菌丰度和变形菌亚纲 Fig. 4 Abundance of dominant bacteria at the phylum level and four classes within the Proteobacteria phylum |
由于采样点的环境因子, 包括营养盐、水温、pH和食物网组成都会对浮游细菌群落结构有影响[25], 从而各个采样点的优势细菌丰度有所差异.蓝藻门在4个采样点占比最大, 依次为椒山(80.10%)＞雅浦港(73.64%)＞沙塘港(54.50%)＞竺山湖南(50.68%).椒山的蓝藻门丰度最高, 比例达到总细菌丰度的1/4.有害藻类增殖会进一步导致该区域的物种分布不均, 致使4个采样点中椒山的物种均匀度最低.蓝藻威胁着世界范围内的湖泊, 比如维多利亚湖(非洲)、伊利湖(美国、加拿大)、奥基乔比湖(美国佛罗里达州)、太湖和霞浦湖(日本)[26].蓝藻对氮磷等营养元素具有极高的竞争力, 由于温度的升高, 使其生长速度加快, 而营养元素与气候条件均可以促进有害蓝藻增殖和扩张[27].此次蓝藻门在竺山湾所占比重最高, 表明此时的环境条件已适于其快速增殖.蓝藻水华暴发往往经历4个阶段：湖底休眠、水体复苏、上浮积聚和死亡分解[28], 竺山湾水体中蓝藻门平均丰度高达64.73%, 正处于水体复苏阶段, 已有蓝藻水华暴发态势, 为进一步防控蓝藻灾害, 必须建立蓝藻水华的灾害监测预警机制, 以完成太湖生态修复工作.
除蓝藻门外, 放线菌门、变形菌门和拟杆菌门在竺山湾一带占比丰富.各采样点放线菌门丰度依次为竺山湖南(37.23%)＞沙塘港(26.67%)＞雅浦港(10.56%)＞椒山(7.09%).大多数的变形菌门对有机基质具有很强的代谢能力, 使其在富营养化湖泊占据主导地位.本次变形菌门以沙塘港丰度最高, 占比16.21%.对变形菌门进行细分(图 4), 得到各变形菌纲的平均丰度依次为α-变形菌纲(α-Proteobacteria, 7.51%)＞δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria, 1.08%)＞γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 0.96%)＞β-变形菌纲(β-Proteobacteria, 0.62%).拟杆菌门是一个系统发育高度多样化的群体, 可以将复杂的分子加工成简单的化合物, 在生态系统中起着重要的作用[29], 此次拟杆菌门以椒山采样点占比最高. Tang等[30]于春夏秋冬四季采集太湖水样研究其细菌群落组成, 结果表明放线菌门、变形菌门和拟杆菌门长期存在于太湖水体中, 平均丰度以放线菌门＞变形菌门＞拟杆菌门, 与本文的研究结果一致.这三类细菌也在长江[31]和西藏纳木错湖[32]的水体检出, 是既适合生存于淡水环境, 又可广泛存在于咸水湖的优势类群.
图 5为细菌群落的属水平分类, 丰度较高的属水平细菌主要有鱼腥藻属(Anabaena, 23.98%)、hgcI_clade(15.99%)、CL500-29_marine_group(6.12%)、微囊藻属(Microcystis，3.07%)、聚球藻属(Synechococcus，2.53%)、分枝杆菌属(Mycobacterium，1.52%)、Candidatus_Planktophila(0.72%)等.
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图 5 属水平优势细菌丰度 Fig. 5 Abundance of dominant bacteria at the genus level |
鱼腥藻属、聚球藻属和微囊藻属隶属于蓝藻门; 在本次研究中, 椒山的鱼腥藻属丰度高达48.41%, 其次为竺山湖南; 沙塘港、椒山和竺山湖南检出了少量的聚球藻属; 微囊藻属在4个采样点均有分布, 丰度分别为椒山(0.97%)、沙塘港(0.54%)、竺山湖南(0.37%)和雅浦港(0.11%).微囊藻属与细菌群落之间存在物种特异性关联, 以往研究表明与微囊藻群落相关的优势细菌有α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌门以及假单胞菌属等[33].太湖微囊藻诱导的缺氧区细菌群落结构与水体溶解氧和离子浓度密切相关, 缺氧发生时, 梭状芽胞杆菌成为优势细菌, 整个缺氧过程中, 脱硫弧菌和丛毛单胞菌科占主导地位[11].本次测序结果并未发现梭状芽胞杆菌、脱硫弧菌和丛毛单胞菌科, 表明此时微囊藻属还未引起水体缺氧.
隶属于放线菌门的hgcI_clade、CL500-29_marine_group和分枝杆菌属也发现于太湖竺山湾一带, 这3类细菌属于养殖环境中的有益微生物[34].其中hgcI_clade和CL500-29_marine_group在竺山湖南所占比重较高, 分别为26.80%和4.16%;分枝杆菌属在4个采样点均有检出.
2.4 环境因子对细菌群落的影响将竺山湾细菌群落的OTUs、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数与水环境因子进行Pearson相关性分析(表 3).结果表明, TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TP和PO43--P与OTUs和Chao1指数都呈负相关, 表明随着营养盐的增加, 细菌群落多样性呈下降趋势, 之前已有研究报道表明营养盐水平的增加会导致细菌群落多样性显著下降[35].藻密度与细菌群落均匀度呈显著负相关, 蓝藻门在竺山湾平均丰度高达64.73%, 蓝藻疯长致使竺山湾细菌群落多样性下降.水温和DO与细菌群落多样性呈正相关, 与细菌群落均匀度呈负相关, 表明水温和DO上升有利于太湖水体大多数细菌的生存, 但会造成优势物种的疯长, 导致水生生态系统的失衡. pH与细菌群落均匀度显著负相关, 表明太湖多数细菌较适宜生存在中性条件下.
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表 3 细菌群落多样性与环境因子的关系1) Table 3 Relationship between bacterial community diversity and environmental factors |
对属水平优势细菌与水环境因子进行冗余分析, 图 6表明环境因子对浮游细菌群落具有一定影响, 其中, TN、PO43--P、TP、水温、NO2--N、NO3--N和藻密度与第一主轴呈正相关, 与第二主轴呈负相关; NH4+-N和DO与第一主轴和第二主轴都呈正相关; Chl-a和pH与第一主轴呈负相关, 与第二主轴呈正相关.水温、Chl-a、NH4+-N、DO和PO43--P对浮游细菌群落的解释量为0.774、0.645、0.641、0.577和0.552, 对浮游细菌群落有较大的影响, 与以往研究结果一致; Su等[36]研究环境因子对浮游细菌群落的影响, 发现含氮量和水温是浮游细菌的主要驱动因素; Wei等[37]根据冗余分析得出硝酸盐和DO是影响黄前水库细菌群落组成的主要因素, 并且环境因素和细菌群落在维持水库生态平衡中扮演了重要角色; Hu等[38]对洱海浮游植物和浮游细菌丰度和群落特征展开研究, 发现浮游细菌丰度和群落多样性与浮游植物丰度呈显著相关.
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图 6 浮游细菌与环境因子的RDA图 Fig. 6 RDA ordination graph for the bacterioplankton and environmental factors |
图 6表明微囊藻属与DO呈显著正相关(P＜0.05), 相关系数为0.973, 与NH4+-N、TN、PO43--P、TP、水温、NO2--N、NO3--N和藻密度呈正相关关系. hgcI_clade、CL500-29_marine_group和分枝杆菌属三类细菌与Chl-a呈正相关关系, 与水体营养盐和水温呈负相关关系, 可见营养盐和水温过高均会抑制这三类细菌的生长.聚球藻属、Candidatus_Planktophila和Arenimonas与NH4+-N和DO呈负相关关系.
近年来, 可能由于湖泊富营养化, 蓝藻细菌大量被鉴定为微囊藻属, 且有研究表明产毒的微囊藻属主要存在于太湖营养充足的湖区[39].本次微囊藻属在竺山湾4个采样点均有检出, 通过冗余分析找出微囊藻属的制约因子, 以控制环境因子达到对有害微囊藻水华的防控.温度和营养盐在微囊藻属的有害增殖过程中起着重要的作用, 是推动微囊藻水华暴发的主要因素. Liu等[40]发现当TN与TP之比小于30, NH4+-N与NOx-N之比小于1, 临界水温为25~30℃等条件下, 微囊藻属在夏季太湖北部湖湾占比高达总藻类的一半, 成为主导优势细菌, 可见控制营养盐输入对预防微囊藻水华的重要性.
3 结论(1) 本研究的测序结果能够反映太湖竺山湾浮游细菌群落结构特征.物种多样性指数表明椒山物种组成多样性最丰富, 但其物种分布均匀度较低.
(2) 竺山湾主要优势菌门为蓝藻门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门, 蓝藻门的平均丰度高达64.73%, 正处于水体复苏阶段, 已有蓝藻水华暴发态势.属水平优势细菌主要有鱼腥藻属、hgcI_clade、CL500-29_marine_group、微囊藻属、聚球藻属和分枝杆菌属.
(3) 浮游细菌与环境因子冗余分析表明, 水温、Chl-a、NH4+-N、DO和PO43--P是影响浮游细菌群落的主要环境因子, 其中, DO能显著影响微囊藻属, 营养盐和水温对其也有一定程度影响.
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