2018, Vol. 39
抗生素在农业生产中发挥着重要的作用, 在全球范围内几乎所有地区都采用添加各种抗生素来提高动物产品产量和经济效益.由于在动物体内不能被完全吸收和代谢, 大部分抗生素以母体形式通过粪便和尿液排出体外进入环境中[1].在众多的抗生素中, 四环素类抗生素是应用最为广泛的抗生素之一, 在畜禽粪便中检测到四环素的残留量高达98.20~354.00 mg·kg-1, 即使经过处理生产为有机肥, 其四环素含量也高达15.87~72.79 mg·kg-1[2, 3]. 2010年中国产生约19亿t畜禽粪便, 并呈增长的趋势[4].这些大量的畜禽粪便被用作粪肥施入土壤, 导致农田土壤中的四环素类抗生素残留量可达29.70~8 400 μg·kg-1[5, 6].
长期存在于土壤环境中的抗生素会对植物产生毒害, 而目前关于不同种类抗生素对植物生理代谢的研究还很有限[7].有研究发现抗生素会影响植物(如小麦、黄瓜、莴苣等)的生长, 抑制光合作用, 产生氧化胁迫等[8~12].但这些报道大多是在人为添加高浓度抗生素的液体介质中研究抗生素对种子和幼苗的影响[9], 而生长在土壤中的作物对抗生素的敏感性与生长在营养液中有很大不同[13].抗生素不仅对植物生长产生影响, 也会在植物体内富集, 尤其是可以通过食物链进入人体, 而对人类健康造成威胁[14]. Hu等[15]发现植物不同部位的抗生素含量分布为叶>茎>根, 而Michelini等[16]则认为抗生素主要集中在植物根部.可见, 目前对于抗生素在植物体的累积转运及对人类健康的风险还需要进一步的研究[15, 17, 18].
蔬菜生产需要大量的有机肥, 使蔬菜作物暴露于抗生素胁迫下.生菜(Lactuca sativa L.)和小白菜(Brassica chinensis L.)是种植广泛和人们喜食的蔬菜.四环素类抗生素因其广谱性而在农业生产中被广泛使用.因此, 本研究以生菜和小白菜为对象, 以3种典型的四环素类抗生素[四环素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)]为代表, 研究不同水平(50 mg·kg-1和150 mg·kg-1)的四环素类抗生素对生菜和小白菜生长、生理代谢的影响及抗生素在植物体内的富集和转运特性, 比较生菜和小白菜对四环素类抗生素的耐性和富集转运能力, 以期为抗生素对植物的毒性作用研究累积资料, 并为蔬菜安全生产提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试作物为菊科的意大利生菜(Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.)和十字花科的四季小白菜(Brassica chinensis L.).供试土壤采自重庆市北碚区西南大学紫色土监测基地, 土壤的基本理化性质为碱解氮74.59 mg·kg-1、有效磷38.59 mg·kg-1、速效钾65.07 mg·kg-1、全氮1.54 g·kg-1、pH为5.23、有机质8.87 g·kg-1.
3种四环素类抗生素(TCs)分别为四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC), USP级(BBI Life Science, China); 甲醇、乙腈为色谱级(Fisher Chemical, USA), 正己烷为色谱级(科龙化工, 成都), 其它化学试剂均为分析纯.固相萃取小柱为Poly-Sery HLB SPE [6 mL, 500 mg, ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc., China].
1.2 试验设计土培试验于2015-04-08~2015-06-10在西南大学1号玻璃温室内进行.试验种植生菜和小白菜两种作物.四环素类抗生素处理设置不添加抗生素的空白作为CK、TC(50 mg·kg-1和150 mg·kg-1)、OTC(50 mg·kg-1和150 mg·kg-1)和CTC(50 mg·kg-1和150 mg·kg-1)四环素类抗生素水平设置根据其在畜禽粪便和土壤中的残留量及前人的研究[11, 16].共14个处理, 每个处理5个重复, 随机排列.试验采用直径×高度=25 cm×17 cm的塑料桶, 装入3 kg过5 mm筛的土壤, 每盆分别定植三叶一心的生菜和小白菜幼苗3株.生菜和小白菜底肥用量为氮(N)180 mg·kg-1、磷(P2O5)100 mg·kg-1、钾(K2O)150 mg·kg-1, 由NH4NO3、KH2PO4和K2SO4提供.土培试验8周后收获.收获时用去离子水把植株洗净、擦干, 分成地上部和地下部, 一部分样品冻干用于测定抗生素含量, 一部分样品在4℃下切碎混匀测定生理生化指标.多点混合法采集土培的土壤样品, 冻干后用于测定土壤抗生素含量.
1.3 植物生理指标 1.3.1 光合系统参数光合特性的测定使用便携式光合系统测定仪(Li-6400, LI-COR, USA), 在晴朗天气的09:00~11:00, 测定各处理生菜和小白菜第二片完全展开的叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳(Ci)和蒸腾速率(Tr), 重复3次.
1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性用氮蓝四唑光化学还原法测定, 以抑制NBT光化学还原50%的酶量为一个酶活力单位; 过氧化物酶(peroxidase, POD)活性的测定用愈创木酚比色法, 以每分钟增加1.0 D470酶量为一个酶活力单位; 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用紫外分光光度法, 以1 min减少0.01 D240的酶量为一个酶活力单位[19].丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[20].
1.4 植物和土壤中四环素类抗生素测定 1.4.1 样品提取样品提取方法参考文献[21], 主要过程为：准确称取冻干的3.000 0 g土壤或1.000 0 g植物样品于50 mL离心管中, 加入10 mL提取液(0.1 mol·L-1 Na2EDTA-McIlvaine:甲醇=1:1), 漩涡混匀1 min, 超声10 min后, 4 000 r·min-1离心10 min, 此提取过程重复3次, 合并上清液.植物样品提取液用10 mL的正己烷反复洗涤, 静置后去除上层正己烷.上清液于40℃旋转蒸发至体积为12 mL左右.固相萃取小柱先依次用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化, 用固相萃取装置将提取液以1 mL·min-1的流速通过小柱后, 用5 mL 5%的甲醇溶液淋洗小柱, 真空抽干10 min.以5 mL洗脱液(0.01 mol·L-1草酸甲醇溶液)洗脱小柱, 收集洗脱液, 在40℃下用氮吹仪吹干, 用混合流动相(0.01 mol·L-1草酸:乙腈:甲醇=76:16:8)定容至1 mL, 过0.22 μm滤膜后转移到自动进样瓶中, 上机测定.
1.4.2 样品分析和质量控制四环素类抗生素的提取液使用高效液相色谱仪(HPLC, 岛津, 日本)进行测定, HPLC配备SPD-20A紫外检测器, LC-20AD泵, SIL-20A自动进样架.抗生素使用C18色谱柱[5 μm, 4.6×150 mm(岛津, 日本)]进行分离, 测定的液相条件为0.01 mol·L-1草酸:乙腈:甲醇=76:16:8, 等度洗脱, 流动相流速为1 mL·min-1, 进样体积为10 μL, 在355 nm处检测, 采集时间25 min.
TCs混合标准工作液是用甲醇准确配制浓度为100 mg·L-1 TC、100 mg·L-1 OTC和200 mg·L-1CTC的储备液, 再用混合流动相稀释10倍, 得到含有10 mg·L-1 TC、10 mg·L-1 OTC和20 mg·L-1 CTC的混合标准工作液, 4℃下避光保存.采用加标法测定3种抗生素的回收率, OTC、TC和CTC的平均回收率分别为58.3%、57.1%和87.4%, 所有变异系数小于11.04%.
植物对四环素类抗生素的富集可以用生物浓缩系数BCF值表示, 计算公式为：
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四环素类抗生素从植物地下部向地上部的转运能力用转运系数TF值表示, 计算公式为：
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用Excel 2010和SPSS 21.0对数据进行计算和统计分析, 对不同处理数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较, 数据以平均值±标准差表示, 用Origin 9.0进行绘图.
2 结果与分析 2.1 生物量如表 1, TCs对生菜的生长总体上表现出抑制作用.除在OTC 50 mg·kg-1时外, 生菜地上部和地下部鲜重分别较CK降低了1.56%~26.84%和17.36%~51.04%. TCs总体上增加了小白菜鲜重(除了CTC 50 mg·kg-1处理的地上部鲜重).小白菜地上部和地下部鲜重较对照提高了3.7%~7.3%和3.1%~82.2%.小白菜地下部生物量在50 mg·kg-1的TCs处理时较CK高30.22%~82.22%.生菜地上部和小白菜地下部的鲜重在150 mg·kg-1TCs处理下均显著低于50 mg·kg-1TCs(TC处理除外).
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表 1 不同四环素类抗生素对生菜和小白菜生物量(鲜重)的影响1) Table 1 Effects of tetracycline antibiotics on biomass (FW) of lettuce and Chinese cabbage |
2.2 光合特性
如图 1(a)所示, 生菜的胞间二氧化碳(Ci)在50 mg·kg-1的TC处理下较CK显著降低了7.30%, 在150 mg·kg-1的TC下较CK显著增加11.80%, 而小白菜的Ci在TCs处理下与CK间无显著性差异.生菜的净光合速率(Pn)在TCs处理下显著降低(50 mg·kg-1的CTC除外), 比CK降低了32.43%~82.43%, 其中在TC处理下的变化最明显[图 1(b)].小白菜的Pn仅在50 mg·kg-1的CTC处理下较CK显著增加了38.81%.生菜的气孔导度(Gs)在CTC和OTC处理下显著增加, 是CK的2.48~5.33倍[图 1(c)].在TCs处理下, 小白菜的Gs增加, 且在150 mg·kg-1TCs水平时达到显著水平, 是CK的2.20~3.48倍.生菜和小白菜的蒸腾速率(Tr)在TCs处理下分别比CK提高了70.45%~143.18%和17.21%~71.31%;生菜在OTC处理下的变化最显著, 而小白菜在CTC处理下变化最显著[图 1(d)].
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a、b、c表示同种蔬菜在不同抗生素处理下的显著性差异(P < 0.05), 下同 图 1 不同浓度的TCs对生菜和小白菜Ci、Pn、Gs、Tr的影响 Fig. 1 Effects of tetracycline antibiotic treatments on Ci, Pn, Gs, and Tr of lettuce and Chinese cabbage |
在不同TCs处理下, 生菜和小白菜抗氧化酶活性和MDA含量的变化不同, 且不同部位的敏感性存在显著性差异.如图 2(a)所示, TCs处理对生菜和小白菜的SOD活性有不同程度的抑制作用. TCs降低了生菜地上部和地下部的SOD活性, 较CK低29.17%~94.19%, 小白菜地下部的SOD活性比CK也降低了33.94%~223.12%. 3种TCs中均以OTC的抑制作用最强.在TCs处理下, 小白菜和生菜地下部的POD活性分别比CK增加了32.63%~104.34%和1.28%~253.32%, 且在CTC处理下的变化最显著[图 2(b)]. TCs对小白菜和生菜地上部的POD活性总体上表现出抑制作用, 且以OTC的作用最显著.
生菜地上部和地下部的CAT活性在OTC处理下, 分别比CK降低了19.33%~37.56%和18.90%~44.04%[图 2(c)].小白菜地上部的CAT活性在TCs处理下增加, 且150 mg·kg-1TCs水平时的CAT活性高于50 mg·kg-1TCs, 而小白菜地下部的CAT活性较CK降低了8.22%~60.43%(TC 50 mg·kg-1处理除外).除生菜地上部外, 生菜地下部及小白菜地上部和地下部的MDA含量均在150 mg·kg-1TCs水平时达到最高值, 生菜地下部比CK增加了27.27%~43.22%, 小白菜地上部是CK的2.37~6.26倍, 且以OTC和CTC的影响最显著[图 2(d)].
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a、b、c表示植物相同部位在不同抗生素处理下的显著性差异(P < 0.05), 下同 图 2 不同浓度的TCs对生菜和小白菜抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影响 Fig. 2 Effects of different tetracycline antibiotic treatments on antioxidative enzyme (SOD, POD and CAT) activities and malondialdehyde (MDA) content of lettuce and Chinese cabbage |
由图 3可知, 小白菜地上部和地下部的TCs含量均高于生菜, 分别是生菜的1.11~1.25倍和1.16~3.55倍.除小白菜在CTC 150 mg·kg-1处理外, 生菜和小白菜的地下部抗生素含量比地上部高27.27%~167.63%.在相同抗生素水平下, 生菜和小白菜的CTC含量均最高, 分别比TC和OTC高10.44%~103.22%和88.24%~197.43%;在同种抗生素处理下, 生菜和小白菜的TCs含量总体上以150 mg·kg-1 TCs处理显著高于50 mg·kg-1 TCs.
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图 3 生菜和小白菜不同部位四环素类抗生素含量 Fig. 3 Tetracycline antibiotic concentrations in different parts of lettuce and Chinese cabbage |
由图 4可知, 收获时生菜盆栽土壤中的TCs残留量总体上略高于小白菜(TC 50 mg·kg-1时除外).在同一抗生素水平下, 生菜和小白菜盆栽土壤中均以OTC的残留量最高, 分别是TC和OTC的2.18~7.31倍和1.71~4.77倍.在同一抗生素处理下, 土壤TCs的残留量在150 mg·kg-1TCs水平时是50 mg·kg-1TCs水平时的2.20~10.22倍, 且TC和OTC的残留量在不同抗生素水平间的差异达到显著水平.
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图 4 生菜和小白菜收获时盆栽土壤中四环素类抗生素残留量 Fig. 4 Tetracycline antibiotic reduction in lettuce and Chinese cabbage soil at harvest |
如表 2所示, 小白菜对TCs的富集系数和转运系数较高, 分别是生菜的1.07~7.35倍和1.15~2.25倍.两种蔬菜不同部位的富集系数以地下部略高(小白菜的CTC 150 mg·kg-1处理除外), 是地上部的1.14~2.71倍.在同一水平抗生素处理下, 生菜和小白菜对CTC的富集能力较强, 均在50 mg·kg-1 TCs水平时显著最高; 生菜对TC的转运能力最强, 其转运系数比OTC和CTC高9.17%~78.68%, 小白菜在CTC 150 mg·kg-1时转运系数最高.在同一抗生素处理下, 生菜和小白菜在50 mg·kg-1 TCs处理下的富集系数显著高于150 mg·kg-1, 而生菜和小白菜对TCs的转运系数在150 mg·kg-1 TCs处理时显著高于50 mg·kg-1 TCs处理(OTC除外).
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表 2 生菜和小白菜的四环类抗生素的生物富集系数(BCF)和转运系数(TF)1) Table 2 Bioconcentration factors and translocation factor of tetracycline antibiotics for lettuce and Chinese cabbage |
2.6 四环素类抗生素在土壤和植物中的含量与植物生理指标的相关性
相关性分析的结果进一步表明, 在土壤中添加不同水平的TCs对生菜和小白菜的影响不同(表 3).土壤TCs水平与生菜的地下部生物量呈显著负相关(r=-0.534, P < 0.05), 而与小白菜生物量间无显著相关性(P>0.05).土壤TCs水平与生菜的Pn呈显著负相关(r=-0.632, P < 0.05), 与小白菜的Tr和Gs呈(极)显著正相关(r=0.564, P < 0.05; r=0.801, P < 0.01).生菜和小白菜的SOD活性与土壤TCs水平和不同部位的抗生素含量总体上呈(极)显著负相关.土壤TCs水平与生菜和小白菜根的POD活性呈(极)显著正相关(r=0.552, P < 0.05; r=0.829, P < 0.01).生菜和小白菜地下部的MDA含量分别与土壤抗生素水平和小白菜不同部位抗生素含量呈极显著正相关(r=0.770, P < 0.01; r=0.905, 0.710, P < 0.01).
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表 3 土壤和两种蔬菜不同部位中四环素类抗生素含量与其生理生化特性的相关性1) Table 3 Correlation analysis of tetracycline antibiotic in soil with different parts of lettuce and Chinese cabbage and physiological-biochemical characteristics |
3 讨论 3.1 四环素类抗生素对两种蔬菜的植物毒性 3.1.1 TCs对生菜和小白菜生长的影响
Pan等[22]比较了不同种类抗生素对生菜、番茄、胡萝卜和黄瓜生长的影响发现生菜对抗生素更敏感, 并认为其可以作为抗生素毒性的重要指示作物之一.本试验中, 生菜在不同水平TCs处理下的生长均受到抑制, 较小白菜对TCs更为敏感.这表明不同种属的作物对抗生素的耐受性不同, 该结果与前人的研究相似[7].此外, 本研究中小白菜地下部的生长在土壤TCs水平为50 mg·kg-1时受到促进作用, 这在一定程度上反映了TCs对植物生长的双向作用, 即低浓度促进生长而高浓度抑制生长[9, 23].
3.1.2 TCs对生菜和小白菜光合作用的影响本研究中, 生菜的Gs和Tr在TCs处理下有不同程度的增加, 但Pn总体上被抑制.这可能是由于TCs能够影响光合电子传递速率以及光合色素的合成[24]. TCs进入植物体后存在于气孔细胞中, 也是其影响光合作用的可能原因之一[25]. 3种TCs中, TC对生菜Pn的抑制作用最强, 可能是同类抗生素下的不同抗生素含有的不同官能团, 而不同程度地抑制光合过程中某些关键酶的活性[12].本研究中生菜较小白菜的光合系统参数对TCs更敏感, 表明TCs对两种作物的光合作用影响不同, 这可能是因为小白菜光合特性与生菜的变化差异, 也可能是生菜生长受到抑制的原因.
3.1.3 TCs对生菜和小白菜的氧化胁迫植物受到胁迫时会产生过量的活性氧自由基(ROS)破坏细胞内氧化和抗氧化之间的平衡, 而损害其生理和生化功能, 导致膜脂质过氧化和MDA的产生[11, 26]. Xie等[27]的研究发现TCs浓度大于5 mg·L-1即会增加MDA含量, 并认为其是TCs胁迫的生物指标之一.本研究中, 生菜和小白菜MDA含量在150 mg·kg-1TCs时显著增加, 表明外源TCs胁迫下产生的ROS已经超过了两种蔬菜的抗氧化能力.植物在胁迫下的另一个指示指标为抗氧化酶活性, 其中SOD将ROS转化为H2O2和O2, POD和CAT等酶能够将H2O2分解为无害的H2O.本研究中, 生菜和小白菜的SOD活性均有不同程度的降低, 且与土壤TCs水平、植物的TCs含量呈(极)显著负相关, 进一步表明了土壤中TCs水平大于50 mg·kg-1时会对生菜和小白菜产生一定程度的毒害作用. Riaz等[8]研究发现高浓度的氟喹诺酮类抗生素(100和300 mg·L-1)使小麦的MDA含量和SOD活性显著增加, Ma等[11]也发现在土壤中添加的OTC浓度为25 mg·kg-1时, 空心菜根的SOD显著增加, 而Liu等[23]发现OTC溶液浓度大于1 μg·L-1时, 芦苇的SOD活性即显著受到抑制.这些研究在一定程度上表明植物对抗生素的敏感性因抗生素种类、浓度以及培养介质等因素的不同而异, 且植物抗氧化系统的作用具有一定的限度.本研究中TCs对生菜和小白菜不同部位的POD和CAT活性影响有差异, 可能是由于抗生素会损害呼吸电子传递链中的正常电子流等代谢过程[28], 也会诱导产生H2O2而干扰POD和CAT的活性.由此可见, TCs会对植物生长产生氧化胁迫, 但其作用机制和影响因素还需要进一步的研究.
3.2 四环素类抗生素在蔬菜体内的富集转运特征生菜和小白菜地下部对TCs的富集能力大于地上部, 这与对柳树和芦苇的研究结果一致[16, 23].而在蔬菜基地中, Hu等[15]发现作物中抗生素含量的分布为叶>茎>根.这种差异可能是由于在外源添加抗生素的营养液或土壤等培养介质中, 抗生素浓度(0~1 000 μg·L-1和10~200 mg·kg-1)远大于自然条件下农田中的抗生素浓度(0.1~2 683 μg·kg-1), 介质中的抗生素通过被动扩散到地下部.抗生素从地下部转运到地上部的能力有限, 从而过高浓度的抗生素在地下部累积, 也可能与植物培养和生长时间的不同有关[29].本研究中小白菜的富集能力大于生菜, 生菜和小白菜在50 mg·kg-1TCs的富集系数较高和对CTC的富集能力较强.这证明了作物对抗生素的吸收取决于抗生素的物理化学性质以及土壤中抗生素的浓度[30], 作物种类和生长阶段也会影响抗生素的积累和分布[17, 31].同时, Pan等[7]认为仅仅考虑抗生素母体化合物而忽略植物体中抗生素的代谢产物, 可能会导致对抗生素在植物中摄取和累积能力的低估.因此, 关于植物对抗生素的累积特征还需要更深入的研究.
小白菜对3种TCs的转运能力高于生菜, 其TF值是0.546~1.116, 与Pan等[32]的结果相似.在抗生素通过被动扩散被植物吸收时, 可以通过根系中的凯氏带运输, 然后通过木质部和韧皮部分别转运至茎叶和果实[33].因此, TF主要受作物蒸腾速率的影响, 蒸腾速率的增加会加速植物体对土壤中抗生素的吸收[15], 还与抗生素的浓度和物理化学性质(如疏水性)等因素有关[34, 35].本研究中, 添加TCs会增加生菜和小白菜的Tr(在CTC处理下显著增加), 这可能是小白菜转运系数大于生菜, 且CTC转运系数较高的原因之一.本研究还发现在收获期两种蔬菜中CTC含量最高, 而土壤中CTC残留量最低, 这可能是由于CTC较易被作物吸收转运而减少其在土壤中的残留量. OTC结构更稳定, 难以被吸收和降解[7], 可能是本研究的土壤中OTC残留量较高的原因.因此, OTC和CTC在土壤-植物系统中的风险较高.
4 结论(1) 3种四环素类抗生素提高了小白菜地上部和地下部鲜重, 但抑制了生菜的生长.
(2) 四环素类抗生素能够抑制生菜和小白菜的净光合速率(Pn)和SOD酶活性.生菜和小白菜的MDA含量在TCs为150 mg·kg-1时达到最大值.
(3) 供试两种蔬菜四环素类抗生素的含量以地下部>地上部; 小白菜对3种抗生素的富集和转运能力大于生菜.
(4) 在3种四环素类抗生素中, OTC在土壤中的残留量最高.
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