2017, Vol. 38
厌氧氨氧化(ANAMMOX)是一种新型生物脱氮工艺.厌氧氨氧化过程是指在厌氧条件下以NO2--N为最终电子受体来氧化NH4+-N, 最终生成N2和少量NO3-, 其最终实现两种主要氮素污染物的同时脱除[1].厌氧氨氧化工艺无需外加有机碳源、运行成本低、污泥量少, 克服了传统硝化-反硝化脱氮工艺的缺点.然而厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长速度缓慢, 倍增时间长达11~19 d, 导致厌氧氨氧化工艺启动周期相当长[2].世界上第一座ANAMMOX工程在荷兰鹿特丹, 启动时间长达42个月[3].另外, AnAOB还对温度、pH值、氧气、生长基质、有机物等环境条件异常敏感, 致使厌氧氨氧化工艺启动时容易失稳、失稳后难以恢复[4~8].所以通过接种厌氧氨氧化污泥来缩短启动时间和使其稳定运行成为近些年来的研究热点.有研究表明, 部分或全部接种厌氧氨氧化污泥能够快速启动厌氧氨氧化工艺[9], 因此对已富集成功的厌氧氨氧化污泥进行储存, 并能在短期内使其活性快速恢复, 这对厌氧氨氧化工程化广泛应用非常重要.
关于厌氧氨氧化污泥储存方式主要包括储存温度、储存时间、添加基质和活性恢复等方面的研究.在储存温度上, 主要集中在低温保存, 如在液氮(-200℃)条件下冷冻储存4个月后, 厌氧氨氧化的活性有可能再度复活[10]; 4℃不添加硝酸盐的情况下厌氧氨氧化污泥至少可以储存5个月[11].储存时间也会影响菌种储存效果, 有研究发现常温下储存时间对厌氧氨氧化污泥活性影响显著, 随着储存时间的延长污泥活性会大幅度降低, 甚至消失[12].也有学者指出4℃以(NH4)2SO4为保藏基质的方法保藏AnAOB混合培养物最有效[13].同样厌氧氨氧化污泥储存后如何进行活性恢复也是十分重要的, 有研究认为常温储存有利于AnAOB活性恢复, 低温下储存的菌种活性会随着储存时间的延长而越难恢复[14].综上所述, 常温条件下的无基质供给的饥饿储存在经济成本与储存效果相对平衡, 比较具有应用前景.
本研究在室温(室温14~30℃)下, 分别选择了15、30、45、60、75和100 d的储存时间, 研究了无外加基质条件下, 厌氧氨氧化污泥SAA的变化情况及储存时间对厌氧氨氧化污泥活性恢复的影响, 成功找到了简单快速有效的AnAOB储存及恢复方法, 以期为厌氧氨氧化工艺的工业化广泛应用提供理论依据和技术指导.
1 材料与方法 1.1 接种污泥接种厌氧氨氧化污泥取自本课题组长期运行的EGSB反应器(有效容积3 L).该反应器整个培养过程中厌氧氨氧化效果较好, NH4+-N消耗量ΔNH4+-N、NO2--N消耗量ΔNO2--N和NO3--N产生量ΔNO3--N的化学计量比为1:1.1:0.23, 与理论比值(1:1.32:0.26) 相近[1]. NH4+-N和NO2--N的去除率均保持在90%左右, 反应器体积去除负荷为8.21 kg·(m3·d)-1, 比厌氧氨氧化活性(SAA, 以N/VSS计, 下同)为0.266 g·(g·d)-1.污泥呈现红褐色, 以颗粒为主.
1.2 试验用水本试验采用人工配水方式, 分别由(NH4)2SO4和NaNO2提供NH4+-N和NO2--N.其它成分包括KHCO3 1500 mg·L-1、KH2PO4 25 mg·L-1、CaCl2·2H2O 140 mg·L-1和MgSO4·7H2O 200 mg·L-1、微量元素储备液1 mL·L-1.微量元素储备液成分为EDTA 5000 mg·L-1, FeSO4 5000 mg·L-1, ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1, CoCl2·6H2O 240 mg·L-1, MnCl2·4H2O 990 mg·L-1, CuSO4·5H2O 250 mg·L-1, NaMoO4·2H2O 220 mg·L-1, NiCl2·6H2O 190 mg·L-1, NaSeO4·10H2O 210 mg·L-1, H3BO4 14 mg·L-1.配水通过高纯氮气进行30 min的曝气处理以去除水中的溶解氧.
1.3 储存方式和恢复方法厌氧氨氧化污泥经过洗涤后分别放置在去离子水中, 室温条件下避光密封保存.期间室内环境最高温度为30℃, 最低温度为14℃, 具体变化如图 1所示.
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图 1 污泥储存期间室内温度变化情况 Fig. 1 Indoor temperature changes during sludge storage |
在储存后的第15、30、45、60、75和100 d, 取3组平行样来分别测定厌氧氨氧化污泥的SAA, 并在经过活性恢复后测定恢复后的SAA.恢复策略为：初始以70 mg·L-1 NH4+-N和92 mg·L-1 NO2--N开始进行恢复, 并在恢复过程中, 保持出水的NH4+-N和NO2--N浓度在很低水平的前提下, 不断提高其进水基质浓度, 当活性达到储存前污泥的SAA水平并进行一段时间的稳定运行后即可停止恢复过程.
活性恢复过程同样设置3组平行的序批式厌氧瓶, 每组厌氧瓶放置3 g储存后的厌氧氨氧化污泥, 培养于140 r·min-1摇床中, 恒温于35℃, 水力停留时间(HRT)恒定为12 h.通过测定进出水氮素浓度的变化来调整配水的进水氮容积负荷.整个更换配水的操作都在厌氧操作台中完成.
1.4 SAA测定SAA测定采用相同的试验配水, 初始NH4+-N和NO2--N浓度分别为70 mg·L-1和92 mg·L-1.初始pH值在7.7~8.1之间.测定过程采用100 mL配水和3 g(湿重)厌氧氨氧化污泥, 通过高纯氮气曝气20 min以保证配水的厌氧环境.然后避光培养于35℃、140 r·min-1的水浴摇床, 每隔1 h取水样测定NH4+-N和NO2--N浓度.由基质浓度降解曲线, 计算出污泥的SAA.每个样品设置3个平行样.
1.5 测定项目与方法挥发性固体浓度(VSS)、NH4+-N、NO2--N和NO3--N分别采用恒重法、纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘)-乙二胺分光光度法和麝香草酚法测定[15]. pH值通过WTW便携式多参数测试仪(Multi 3430) 测定.
2 结果与讨论 2.1 储存时间对SAA和污泥颜色的影响 2.1.1 储存时间对SAA的影响分别将常温储存下15、30、45、60、75、100 d的厌氧氨氧化污泥取出, SAA的测定结果如图 2所示.从中可知, SAA分别为0.242、0.171、0.164、0.115、0.069和0.051 g·(g·d)-1, 是储存前SAA的90.9%、64.3%、61.7%、43.2%、25.8%和19.3%.经过15 d的储存后厌氧氨氧化污泥仍然保持较高活性, 说明15 d的储存时间对厌氧氨氧化的活性影响较小, AnAOB的代谢能力仍然十分旺盛, 污泥开始储存时残留基质的存在对初期活性的保持有积极作用. 15~100 d的时间内, 厌氧氨氧化活性几乎以线性下降(R2为0.978).经过100 d的储存后, 污泥SAA只有初始活性的19.3%, 说明此时厌氧氨氧化污泥经过内源消化几乎完全消耗[16].总体而言, 从整个100 d的储存期的SAA变化可以看出, 随着储存时间的延长厌氧氨氧化活性也在逐渐下降, 储存前期(储存前15 d)活性下降较缓, 随后厌氧氨氧化污泥活性呈线性下降.
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图 2 不同储存时间下SAA的变化情况 Fig. 2 Variations of the SAA after storage under different storage durations |
本研究发现污泥在不同时间下储存后, 形状和颜色有了很大的变化.储存过程中, 厌氧氨氧化污泥颜色随时间的变化如图 3所示.从中可知, 随着储存时间的延长, 厌氧氨氧化污泥逐渐变黑, 颗粒结构逐渐变细碎.主要原因为血红素是AnAOB胞内血红蛋白的重要辅基, 其含量影响厌氧氨氧化污泥外观颜色[17, 18].在无基质添加的厌氧氨氧化污泥储存过程中, AnAOB胞内血红素逐渐降解, 使厌氧氨氧化污泥外观颜色发生一定变化.这与汪彩华等[19]研究发现硫化物随储存时间的延长而增加, 颜色也随硫化物的增加而逐渐变黑, 并最终完全覆盖厌氧氨氧化污泥因富含血红素c而呈现的红色的结果一致.而本试验是无添加基质的储存方式, 且储存前的污泥经过离子水的反复洗涤已经洗去了原配水中的硫酸盐, 说明储存过程中产生的硫化物并不是由硫酸盐还原产生的.再由汪彩华等[13]的研究可知储存过程中生成的硫化物主要来源于死亡菌体的水解.本试验储存前AnAOB的活性很高, 所以储存前期应该可以快速消耗这些矿物质化释放的无机氮源, 然后将逐渐利用自身体内的物质进行新陈代谢, 导致细菌逐步解体(污泥颗粒变小)且腐烂产生H2S, 使得污泥颜色变黑并发出难闻的臭味.
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(a)15 d; (b)30 d; (c)45 d; (d)60 d; (e)75 d; (f)100 d 图 3 厌氧氨氧化污泥的颜色随储存时间的变化 Fig. 3 Changes of ANAMMOX sludge colors during storage |
常温下活性恢复试验是根据储存时间确定的, 恢复过程的脱氮效果如图 4所示.储存15 d的厌氧氨氧化污泥的活性恢复由图 4(a)可知, 当恢复到第24 h时, 出水NH4+-N和NO2--N浓度降低至1 mg·L-1以下, 继续稳定运行到第48 h时去除率达到99%以上.因为储存15 d后的厌氧氨氧化污泥的SAA较高, 该批次活性恢复试验仅用时2 d.
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图 4 常温下不同储存时间后厌氧氨氧化污泥的恢复效果 Fig. 4 Performance after different storage durations of ANAMMOX sludge under room temperature |
当储存时间由15 d延长到30 d的时候, 厌氧氨氧化污泥活性恢复过程如图 4(b)所示, 根据之前的恢复策略进行恢复.当反应进行到第72 h时, 出水NH4+-N浓度降至3.5 mg·L-1, 去除率为96.1%.而NO2--N浓度降低至3.1 mg·L-1, 去除率为97.5%, 去除效果非常好, 继续稳定运行到第108 h时两者的去除率均达到96%以上, 所以该批次活性恢复试验用时4.5 d.储存时间达到45 d时, 厌氧氨氧化污泥恢复情况如图 4(c), 当恢复到第108 h时NH4+-N和NO2--N的去除率分别为79.1%、81.5%, 该批次活性恢复试验也用时4.5 d.
继续储存到60 d后, 厌氧氨氧化污泥恢复情况如图 4(d), 恢复反应进行的前60 h, 出水NH4+-N和NO2--N浓度逐渐降低, 去除率均在80%以上, 保持较好的去除效果.然而在第72 h时出水NH4+-N和NO2--N的去除率分别只有22.8%和47.1%.此时反应器效果骤降的原因是因为厌氧操作台出现故障, 换水过程没能保持严格厌氧条件.溶解氧水平达到0.5%的空气饱和度即对厌氧氨氧化反应产生抑制[20, 21].仪器恢复后, 继续恢复稳定到第144 h时NH4+-N和NO2--N的浓度降至12.1 mg·L-1和14.9 mg·L-1, 去除效果良好, 活性恢复试验结束.因为在恢复过程中出现仪器故障导致恢复期出现异常波动, 虽然试验是在第6 d结束, 但按照储存30 d和45 d均用时4.5 d来推测该批次试验用时小于6 d.储存时间从60 d延长到75 d时厌氧氨氧化污泥恢复情况如图 4(e), 恢复方式与前面基本一致, 稳定恢复到第144 h时NH4+-N和NO2--N的去除率均在85%以上, 去除效果良好, 活性恢复试验结束.该批次活性恢复试验用时6 d.
进一步延长储存时间到100 d时厌氧氨氧化污泥恢复情况如图 4(f), 此时污泥的SAA仅为0.0513 g·(g·d)-1, 活性已很低.反应进行的前84 h, 出水NH4+-N和NO2--N浓度波动较大, NH4+-N和NO2--N的去除率基本保持在30%以下.之后改变进水基质浓度使n(NH4+-N)和n(NO2--N)的量比为1:1, 以降低亚硝酸盐对AnAOB的抑制效果[22].继续恢复稳定至228 h, 出水NH4+-N和NO2--N的浓度逐渐降至23.5 mg·L-1和15.0 mg·L-1, 去除率分别为67.7%和80.8%.该批次活性恢复试验用时9.5 d.各批次恢复试验结束时NH4+-N和NO2--N的去除率相差很大, 但其厌氧氨氧化特征已十分明显, 且本研究是以SAA达到储存前的水平为依据进行的.所以当恢复到储存前SAA的水平时便终止了试验.
从以上的分析可以看出在常温无基质添加的条件下, 储存15、30、45、60、75和100 d的厌氧氨氧化污泥, 经过最多9.5 d的时间污泥SAA基本恢复到了储存前的水平.首先说明了常温储存过程中AnAOB并没有大量死亡, 很可能只是在缺乏基质的条件下进入的休眠状态.因为AnAOB的倍增时间长达11~19 d, 若储存过程中菌体大量死亡不可能在那么短的时间内厌氧氨氧化活性得到恢复.而与其他研究相比之所以取得如此好的恢复效果, 笔者认为主要在于恢复策略的不同.恢复策略方面主要是在保证严格厌氧的环境下, 进水氨氮和亚硝氮从低浓度开始进行恢复, 其目的是为了提供基质的同时防止游离氨和游离亚硝氮对厌氧氨氧化菌的抑制.之后随着氨氮和亚硝氮去除率的提高而逐渐提高它们的进水浓度, 以此逐步提高氮去除负荷, 使厌氧氨氧化污泥活性得到快速恢复.所以, 常温存储下, 厌氧氨氧化污泥的损伤小, 颗粒保持完整, 菌体无大量死亡, 再加上严格厌氧的恢复操作下逐渐提高基质浓度的方法, 是本研究较好效果的原因.而再深层次的原理, 是下一步的研究探索的工作目标.
从厌氧氨氧化污泥的常温储存后的恢复过程可知, 随着储存时间的延长, 活性恢复时间也在逐渐增加.目前从这方面的研究来看, Ali等[23]在室温条件下将AnAOB在添加3 mmol·L-1钼酸盐的营养液中储存90 d后, 需要长达35 d才能完全恢复AnAOB的活性; Ji等[24]在4℃的条件将厌氧氨氧化污泥储存了60 d后, 经过14 d的恢复培养, 恢复污泥的92.9%的活性; Xing等[25]的研究结果表明, 厌氧氨氧化污泥在4℃条件下储存50 d后, 需要经过8 d的时间来恢复污泥活性.本研究的污泥储存条件无需添加外源营养物质, 而且无需维持低温条件, 在自然常温条件下储存即可.同时, 储存后污泥活性的恢复时间很短, 即使是经过长达100 d的储存, 活性恢复的时间也仅为9.5 d, 与同行的研究结果相比恢复时间较短.本研究的储存条件简单, 活性恢复快速, 对于厌氧氨氧化污泥的快速储存和工程化应用有很大的参考价值.
2.2.2 活性恢复后的SAA分别将常温储存下15、30、45、60、75、100 d的厌氧氨氧化污泥进行恢复后测定SAA, 其结果如图 5所示.从中可知, 恢复后SAA分别为0.275、0.344、0.332、0.297、0.311和0.263 g·(g·d)-1, 是储存前SAA的103.4%、129.3%、124.8%、111.7%、116.9%和98.9%.除了100 d储存时间外, 其它储存时间的污泥恢复后的污泥活性都高于储存前的污泥活性, 分析认为储存前污泥在EGSB反应器中培养时其活性并没有达到最高水平, 所以经过恢复后的SAA能达到高于储存前SAA的水平.经试验得出该温度下储存的厌氧氨氧化污泥一旦给予合适的条件, AnAOB就会快速生长, 很快就达到了较高的脱氮效能[16].
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图 5 不同储存时间下恢复后污泥活性变化情况 Fig. 5 Reactivation after different storage durations of ANAMMOX sludge |
当厌氧氨氧化污泥活性较高时, 污泥一般呈现红褐色.本研究发现在厌氧氨氧化污泥储存不同时间后进行恢复的过程中, 污泥颜色逐渐由储存后的深褐色或黑色变为红棕色, 如图 6所示, 且刺鼻的臭味也在逐渐消散. 图 6(a)的颜色与储存前污泥颜色最为接近, 说明储存15 d时的污泥的活性很高, 恢复试验进行2 d污泥颜色也同时得到恢复.分析认为厌氧氨氧化污泥短期储存时只是在颗粒污泥的表面进行了氧化反应, 一旦进入恢复试验随着污泥表面的硫化物逐渐消散, 污泥颜色也会逐渐变红.
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(a)15 d; (b)30 d; (c)45 d; (d)60 d; (e)75 d; (f)100 d 图 6 厌氧氨氧化污泥的颜色随恢复时间的变化 Fig. 6 Changes of ANAMMOX sludge colors during restoration |
对比图 3可以看出, 储存后与恢复后污泥颜色变化十分明显, 尤其是储存60、75和100 d的污泥恢复后[图 6(d)~6(f)], 污泥颜色由储存后的黑色变为红色, 说明污泥的活性随恢复时间在逐渐升高, 也标志着厌氧氨氧化反应的成功进行.但有少量的黑色颗粒, 笔者认为可能是由于储存过程中有部分AnAOB死亡造成的.由图 6也可以看出随着储存时间的延长, 虽然恢复时间也在逐渐增加, 但恢复后污泥颜色越来越不容易恢复到储存前鲜亮的红褐色.与厌氧氨氧化污泥活性恢复也越来越困难一致.
2.3 恢复期间厌氧氨氧化反应的化学计量关系厌氧氨氧化过程中, 理论上ΔNH4+-N、ΔNO2--N和ΔNO3--N的化学计量比为1:1.32:0.26[1].不同储存时间后进行的恢复过程中的化学计量比(量比)变化如图 7所示.
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图 7 常温下不同储存时间后厌氧氨氧化污泥的恢复过程中的化学计量比变化 Fig. 7 Variations of stoichiometric ratios after different storage durations under room temperature in the restoration stage of ANAMMOX sludge |
从储存15 d后恢复到储存60 d后恢复过程可以看出, ΔNO2--N/ΔNH4+-N比值在恢复前期基本高于理论值1.32, 而ΔNO3--N/ΔNH4+-N的比值基本低于理论值0.26.有研究表明, 厌氧氨氧化反应器中, AnAOB与反硝化菌、好氧氨氧化菌具有基于空间利用的协同作用[26], 反应器中存在着部分反硝化菌[27].反硝化菌和AnAOB都能以亚硝酸盐作为基质, 同时反硝化菌还需要有机物作为电子供体才能进行反应.在污泥储存过程中以及接种到新的环境中, 由于菌体死亡裂解, 新环境的菌群的适应过程或胞外聚合物等原因会使污泥中存在有机物质, 所以恢复前期除了AnAOB消耗NH4+-N和NO2--N生成NO3--N, 反硝化菌也会消耗NO2--N和NO3--N, 导致ΔNO2--N/ΔNH4+-N高于厌氧氨氧化理论比值1.32, 而ΔNO3--N/ΔNH4+-N低于理论比值0.26[11].随着恢复时间的增加, ΔNH4+-N、ΔNO2--N、ΔNO3--N的量比逐渐接近1:1.32:0.26.主要原因即随着恢复过程的进行, 污泥开始适应新的环境, 同时有机物的量越来越少, 而且反应过程中厌氧条件和pH的控制都十分严格, 各个批次试验经过一段时间的恢复培养后, 厌氧氨氧化现象越来越显著, 之后进入稳定运行阶段.虽然稳定期内厌氧氨氧化过程明显, 但由图 4可以看出厌氧氨氧化活性并没有达到储存前污泥SAA的水平, 所以每个批次试验的稳定运行时间不同, 其目的是为了恢复至储存前水平.
如图 7(e)和7(f)所示, 储存75 d和100 d后的污泥进行恢复时, ΔNO2--N/ΔNH4+-N和ΔNO3--N/ΔNH4+-N在恢复前期均低于理论值, 之后随着恢复时间的延长逐渐趋近于理论值.分析认为是少量的AOB能利用反应器不够严密而进入的氧气存活下来, 以此氧化更多的NH4+-N[28].本试验储存前的污泥取自EGSB反应器, 污泥为厌氧氨氧化混合培养物.储存时也没有对污泥和溶液进行有效除氧, 所以储存过程中有少量溶解氧, 导致厌氧氨氧化污泥中有部分AOB存活下来.并且随着储存时间的增加AOB比反硝化菌可能更占优势, 所以恢复初期NH4+-N被氧化更多.之后由于一直保持严格厌氧条件进行恢复, 随着恢复时间的延长AOB逐渐被AnAOB取代.
3 结论(1) 常温密封无外源基质添加的储存条件下, 储存时间对AnAOB活性影响很大, 100 d的储存后, 污泥剩余SAA仅为储存前初始SAA的19.3%.污泥剩余SAA随储存时间呈近乎线性下降(R2为0.978).
(2) 储存时间在15~100 d内的厌氧氨氧化污泥可以在2~9.5 d的恢复过程中恢复全部的污泥SAA活性.污泥储存100 d并恢复后的SAA略低于初始SAA, 而其它储存时间的污泥恢复后的活性均高于初始污泥SAA.因此, 常温密封无外源基质添加的储存方法有利于厌氧氨氧化污泥的短期储存及快速恢复.
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