2017, Vol. 38
2. 江苏省环境厌氧生物技术重点实验室, 无锡 214122
, XU Zhi-yang1,2 , ZHAO Ming-xing1,2 , SHI Wan-sheng1,2 , HUANG Zhen-xing1,2 , HE Di1,2 , RUAN Wen-quan1,2
2. Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Wuxi 214122, China
醋糟是大米、高粱、玉米等发酵主料与大量的麸皮和稻壳等添加物进行醋酸发酵后的剩余物[1], 属于食品加工行业废弃物.发酵主料中的营养物质经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵而实现醋的生产, 而麸皮和稻壳等添加物的主要成分为木质纤维素, 这些物质在产醋过程中是难以被分解转化的, 最终会与发酵主料的残渣一起形成醋糟[2], 因此木质纤维素是醋糟的主要成分.有资料显示, 每生产1t食醋, 就会产生600~700 kg的醋糟[2], 而我国产醋量大, 2013年我国食醋产量超过125万t[3], 相应地醋糟的年产量高达75~87.5万t.为了更好地利用醋糟, 人们从各个角度做了广泛的研究, 常见的处理方式有做饲料、食用菌培养基质、植物无土栽培基质[4].醋糟做饲料通常有两种形式, 一是不处理直接做饲料, 二是醋糟进行发酵后再做饲料[5], 但醋糟的高纤维含量使得其作饲料存在动物消化率低的问题, 难以满足动物的营养需求, 往往需要再添加其他营养物混合饲喂, 因而处理量十分有限.食用菌具有一定降解纤维的能力, 因此醋糟可以用来培养食用菌[6], 但这种处理方法对醋糟的需求量较少, 无法满足醋糟的大规模处理.由于醋糟中的稻壳和麸皮使其具有结构松散、空隙率大的特点, 有研究将醋糟用来做植物培养基, 但需要加入药剂来调节醋糟的理化性质[7], 且植物无法直接吸收木质纤维素, 对醋糟的利用率不高.综上所述, 目前常见的处理方法虽然具有一定效果, 但是由于醋糟中含有大量的木质纤维素成分, 其难降解特性使得醋糟的利用始终存在利用率低、处理量有限、使用范围窄, 难以规模化等问题.
大量研究表明厌氧消化是有机废弃物资源化和减量化的有效途径[8~10], 并在实际工程上已经有广泛的应用.在厌氧消化的水解阶段, 结构复杂的大分子有机物降解为可溶性小分子物质, 随后被产甲烷微生物利用产生沼气.经厌氧消化过程产生的沼渣含有丰富的氮、磷, 是很好的有机肥料, 可用于农业生产.由此可见, 利用厌氧消化技术处置有机废弃物具有良好的经济效益和环境效益.作为有机固体废弃物的醋糟同样具备厌氧消化处置的潜力.侯雨等[11]和陈智远等[12]通过批次实验研究醋糟的产甲烷潜力.在低固体浓度厌氧消化体系中, 醋糟中的纤维素类残渣上浮现象明显, 无法与微生物充分接触, 严重影响底物的利用效率.一些研究为提高醋糟中纤维素利用效率, 采用酸碱浸泡的方式对醋糟进行预处理[2].虽然预处理可以提升醋糟的产气效率, 但是预处理成本较高, 在实际应用中很难推广, 且易形成有毒副产物, 会影响沼渣有机肥的品质.戴晓虎等[13]进行序批实验研究不同有机负荷下的醋糟厌氧消化性能, 结果表明当有机负荷大于3.56g·(L·d)-1时, 产甲烷活性被严重抑制.如何打破木质纤维素的特殊结构是实现醋糟高效资源化利用的关键.
本研究为高固态连续式厌氧消化体系, 采用全混式搅拌以提高反应体系均质性、强化底物利用率, 并通过控制沼液回流富集高效的木质纤维素降解菌群, 强化反应体系的木质纤维素水解功能.体系在不进行预处理的条件下提高了醋糟处理能力, 构建了高效稳定的醋糟高固态厌氧消化体系, 实现了醋糟的高效资源化利用.本实验通过逐步提升负荷的方式分析在负荷提升过程中醋糟的降解和转化规律, 以期为醋糟厌氧消化的工程化应用提供数据和理论支撑.
1 材料与方法 1.1 底物与接种物实验中使用的厌氧消化底物为食醋生产企业的醋糟, 主要包含稻壳类填充物和酿醋原料残渣, 其中溶解性物质占6.83%.接种物为实验室处理餐厨垃圾产气效果良好的厌氧消化污泥.底物和接种物的主要参数见表 1.
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表 1 底物和接种物的性质 Table 1 Characteristics of the substrate and inoculum |
1.2 反应装置与实验设计
实验采用全混式反应器, 反应器容积为10 L, 有效体积为8 L, 装置示意图见图 1.反应器的出气口连接湿式气体流量计测量产气体积, 用集气袋保存气体用于测产气成分, 消化过程中醋糟从反应器顶部的进料口加入, 沼渣通过反应器底部的出料口取出, 经固液分离后, 沼液部分回流.本实验采用中温消化, 反应器温度控制在37℃±1℃, 实验过程进行连续搅拌, 搅拌速率通过控制柜调节.
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图 1 醋糟厌氧消化反应器 Fig. 1 Vinegar residue anaerobic digestion reactor |
实验通过逐步提高反应体系物料负荷的方式, 分5个阶段运行, 各阶段的进料量分别为50、100、130、150和170 g·d-1, 对应的物料负荷(干物质)分别为2.05、4.1、5.33、6.15和6.97 g·(L·d)-1, 依次以P1、P2、P3、P4、P5表示.反应器运行期间, 定时取样, 检测相关指标, 监控反应器的运行状况, 提供物料负荷提升依据.
1.3 测定参数与方法(1) 总固体(TS)采用105℃烘干法[14]; 挥发性固体(VS)采用600℃灼烧法[14].
(2) 蛋白质采用凯氏定氮仪(KDN-520, 杭州绿博仪器有限公司)测定的凯氏氮乘以6.25得到[15].
(3) 纤维素、半纤维素与木质素采用Van Soest洗涤法[16], 利用全自动纤维分析仪(ANKOM 2000i, 美国ANKOM科技公司)测定.
(4) 挥发性脂肪酸(VFA)采用总量比色测定法[17]; 氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定[14]; pH值采用Mettler-Toledo Delta320型pH计测定.
(5) 沼气成分采用便携红外沼气分析仪(GAS-BOARD 3200L, 武汉四方光电科技公司)测定[18].
(6) 木聚糖酶酶活力定义为每分钟每毫升酶液催化水解木聚糖生成1μg木糖的酶量为1个酶活力单位[U·(mL·min)-1]; CMC酶活力定义为每分钟每毫升酶液催化水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)生成1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位[U·(mL·min)-1], 以上酶都采用DNS显色法测定, 以含有发酵液上清, 但不含底物的反应体系作为比色对照[19].
2 结果与讨论 2.1 产气变化情况反应器运行过程中的产气情况如图 2所示.反应器总共运行时间为195d, 分5个阶段逐渐提高物料负荷, 依次以P1、P2、P3、P4、P5表示. 5个阶段稳定状态下的单位干物料产沼气量分别为426、366、352、396和347mL·g-1, 单位干物料产甲烷量分别为232、181、173、211和173mL·g-1.各个阶段的单位干物料产沼气量均与戴晓虎等[13]研究中最适有机负荷下的产气量结果相符.反应器运行过程中, 单位干物料产甲烷量的变化趋势与单位干物料产沼气量的变化趋势相一致.在P2阶段运行的第13d时单位干物料产沼气量从366mL·g-1下降至274mL·g-1, 此时系统内的氨氮已经积累到2 700 mg·L-1, 推测体系产甲烷活性下降由氨氮积累导致[20], 因而采取沼液部分回流的方式解除氨氮抑制, 随后体系的产甲烷活性快速恢复. P1、P2、P3阶段由于物料负荷的提升使得物料停留时间减少, 单位干物料产沼气量有一定程度的下降, 而P4阶段的单位干物料产沼气量又有明显回升.表明通过反应器连续运行和负荷提升, 体系对物料的适应性明显提高, 在较短的物料停留时间下仍然表现良好的产甲烷活性.在物料负荷提升的节点, 由于物料对反应体系的冲击作用会出现单位干物料产气量的明显下降, 随着反应体系逐步适应新物料负荷, 单位干物料产气量逐步回升并保持稳定. P2、P3、P4阶段运行至单位干物料产气量稳定所需的时间分别为5、8、22 d, 表明随着物料负荷的提升, 反应体系所需的适应期逐渐增加.物料负荷继续提升至P5阶段, 单位干物料产沼气量和单位干物料产甲烷量分别下降至347mL·g-1和173mL·g-1, 在此负荷阶段下运行满45 d(此物料负荷下物料停留时间为45 d), 单位干物料产沼气量和单位干物料产甲烷量稳定在较低水平, 表明P5阶段下的物料负荷已超出体系的处理极限, 体系内微生物的水解能力已经饱和, 无法充分降解醋糟.
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图 2 运行过程中单位干物料产沼气量和单位干物料产甲烷量 Fig. 2 Amount of methane produced per unit of dry matter and dry material in the process of operation |
随着物料负荷的提升, 反应器的处理能力逐渐提高, 但物料的停留时间随着物料负荷的提升而减少, 物料的停留时间从P1阶段的160d减少至P4阶段的50d, 大幅削减了底物与微生物的接触时间[21], 因此P2、P3、P4阶段的单位干物料产气量比P1阶段有所降低, 而P5阶段下的物料负荷已超出体系的处理极限, 醋糟没有被充分降解使得体系含固率上升, 弱化了体系的传质效果, 影响了酶和微生物的分布以及与底物的接触[22], 单位干物料产气量出现明显下降.现有研究中, 针对未预处理的醋糟厌氧消化体系, 无论底物运行负荷还是底物产气效率均低于本研究中结果. Li等[23]采用CSTR体系进行湿式厌氧消化, 在2.5g·(L·d)-1负荷下获得产气量为232.75mL·g-1.戴晓虎等[13]采用AMPTS系统进行实验, 在1.78g·(L·d)-1负荷下获得产气量为347.89mL·g-1.而本研究利用半连续全混式高固态厌氧消化技术处理醋糟在6.15 g·(L·d)-1负荷下得到稳定的产气量为396mL·g-1.综上分析可知：本体系运行的最佳物料负荷为P4阶段的6.15 g·(L·d)-1, 单位干物料产沼气量为396mL·g-1, 单位干物料产甲烷量为211 mL·g-1, 经过长时间连续运行和负荷提升, 在较短的物料停留时间下能表现良好的产气效率, 对醋糟进行了高效的资源化利用.
运行过程中沼气有效成分变化幅度比较小, 甲烷含量约为50%, 平均甲烷含量为52.34%, 微生物分解乙酸时, 产生甲烷和二氧化碳的比例为1:1[24], 由此初步推断系统以乙酸发酵为主.而乙酸是产甲烷过程的直接底物[25], 这也可以表明系统处于较稳定的状态.
2.2 pH、VFA和氨氮的变化情况反应体系pH值是厌氧消化体系运行的重要参数, 它能反映消化过程的稳定性以及影响体系中有害物质的毒性表达, 从而影响微生物的活性[26, 27].运行期间pH值保持在7.4~8.0之间, 没有出现酸化现象, 表明通过逐步提升物料负荷, 反应体系适应了底物特性, 对底物的利用能力持续增强.
如图 3所示, 反应器运行的P1阶段, 观察到VFA浓度保持在6 000 mg·L-1以上, 并有一定幅度的上升, 最高达到9 537 mg·L-1, 但此期间pH值仍稳定在7.8以上, 并没有因为VFA浓度的升高而降低, 而氨氮浓度逐渐上升, 表明反应体系适量氨氮积累能缓解体系因VFA累积造成的酸化.当物料负荷提升至P2阶段, 运行至第13天时, 单位干物料产沼气量明显下降, 此时反应体系pH值处于正常范围, 氨氮浓度已上升至2 700 mg·L-1.推测造成反应体系产气量明显下降的原因是高浓度氨氮和VFA的双重积累已使系统处于抑制型稳态[28].遂采取沼液部分回流的方法使体系氨氮浓度逐渐下降并保持在2 000 mg·L-1左右.随着反应体系氨氮浓度的降低, VFA浓度从11 445 mg·L-1降至7 962 mg·L-1, 单位干物料产沼气量迅速回升至366mL·g-1.上述调整策略及结果表明：氨氮浓度保持在较低浓度是保证醋糟高固态厌氧消化体系高效稳定运行的必要条件, 推测氨氮抑制反应体系的浓度阈值为2 700 mg·L-1.继续提升反应体系物料负荷至5.33 g·(L·d)-1(P3阶段), 运行8 d后单位干物料产气量稳定至352mL·g-1.产甲烷效率相比上一阶段有所下降, 无法充分利用VFA.此阶段反应体系VFA浓度高达10 699 mg·L-1.随着物料负荷的提升, 反应体系的VFA浓度呈升高趋势, 表明体系在长期的运行下对VFA的耐受性也在不断提高.当物料负荷提升至P4阶段[6.15 g·(L·d)-1], 由于底物的冲击作用, 反应体系VFA浓度迅速上升, 并在第8 d达到峰值, 为12 440 mg·L-1.随着反应体系对该物料负荷条件的逐步适应, 产甲烷菌活性逐渐增强, 对VFA利用率逐渐提高, 反应体系VFA浓度逐渐下降并最终稳定在9 000 mg·L-1.表明此时体系内水解过程与产甲烷过程达到动态平衡, 系统处于稳定状态.当物料负荷提升至P5阶段, 由于物料负荷超过体系的处理极限(参见2.1节), 木质纤维素大量积累, 导致中间产物代谢紊乱, 因而VFA出现明显的波动.
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图 3 氨氮和VFA浓度变化情况 Fig. 3 Changes in ammonia and VFA concentrations |
综上所述, 在提升物料负荷的节点会出现VFA浓度积累, 随着体系逐步适应新物料负荷, 积累的VFA逐步被利用, VFA浓度保持稳定, 该结果与产气情况分析结果一致(参见2.1节).当物料负荷过高时, 中间产物代谢过程紊乱, VFA波动明显, 体系的产甲烷效能明显下降.醋糟中蛋白质降解产生氨氮, 氨氮浓度上升可以缓解VFA积累, 维持pH值在正常水平, 而当氨氮浓度积累到抑制浓度时会严重影响体系产甲烷活性, 沼液部分回流可以有效消除氨氮积累.
2.3 TS降解率各个运行阶段下底物的TS降解情况如图 4所示. P1、P2、P3、P4、P5阶段的TS降解率分别为47.03%、43.67%、44.72%、44.92%、41.7%. P1的TS降解率最高, 这是由于P1阶段的物料停留时间最长, 微生物和酶与底物接触更充分, 因而P1阶段也表现出较好的产甲烷活性.而进入P2阶段后, TS降解率出现了较明显的下降, 一方面是氨氮积累到较高浓度, 对消化过程产生抑制, 另一方面是进料负荷提高使得物料停留时间减少, 减少底物与微生物的接触时间.在P3、P4阶段, 观察到TS降解率又有一定的回升, 同时发现此时的木聚糖酶和CMC酶活都有所提高, 说明随着反应器的运行, 木质纤维素降解菌群进行了有效的增殖, 酶的分泌量提高, 在较短的物料停留时间下能高效水解底物.而P5阶段, 由于物料负荷过高, 体系的水解能力已饱和, TS降解率明显下降.
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图 4 各个运行阶段的TS降解率 Fig. 4 TS degradation rate for each operation phase |
由于纤维素、半纤维素、木质素在结构上存在很大差异, 使得其在厌氧消化过程中的生物降解难易程度也有较大差异, 图 5为反应器运行过程中各个阶段下的纤维素、半纤维素、木质素降解率. P1、P2、P3、P4、P5阶段的纤维素降解率分别为30.48%、26.69%、24.76%、21.46%、18.96%;半纤维素降解率分别为54.7%、57.14%、63.63%、63.66%、51.69%;木质素降解率分别为33.79%、26.73%、26.31%、24.43%、12.39%.在各个负荷下, 半纤维素降解率都最高, 这是因为半纤维素的分子量相比纤维素和木质素较小, 结构简单, 更易于被水解[29].从整个运行周期来看, 随着物料负荷的提升, 木质素的降解率呈下降趋势.这是因为木质素含有大量复杂的酚类聚合物, 机械强度大, 需要的降解酶系更复杂[30], 且有研究表明部分酚类化合物难以进行厌氧消化甚至严重抑制消化过程[31].半纤维素的降解率随着物料负荷的提升而增加, 在P4阶段, 半纤维素、纤维素、木质素的降解率分别达到63.66%、21.46%、24.43%, 表明通过反应器的连续运行成功构建了高效的木质纤维素降解体系.
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图 5 各个运行阶段的纤维素、半纤维素、木质素降解率 Fig. 5 Cellulose, hemicellulose, and lignin degradation rate for each operation phase |
FTIR光谱技术适用于研究分子结构和化学基团, 为了深入探究醋糟厌氧消化过程中的降解机制, 分别对醋糟和各个运行阶段的沼渣进行了FTIR表征, 通过对各个样品的FTIR图谱的对比分析, 从而为进一步理解醋糟厌氧消化的降解机制提供依据.
结合文献[32~35], 对样品的红外扫描图谱的1 800~800 cm-1特征频率区进行归属, 光谱解析和对应基团列于表 2.将各个运行阶段沼渣与醋糟的红外图谱进行对比, 不同吸收峰的强度变化表现出很大的差异性(图 6).木质素相关谱峰位于1 628、1 504、1 313、1 232 cm-1, 位于1 504、1 313 cm-1的峰强度没有明显变化, 而1 628、1 232 cm-1处的峰强度变化较为明显, 这表明醋糟厌氧消化过程中木质素的降解主要发生在与苯环相连的支链上, 对苯环骨架的降解十分有限, 这也是木质素难降解的根本原因.纤维素和半纤维素相关谱峰位于1 708、1 150、1 076、1 024、900 cm-1, 相比其他位置, 1 708 cm-1处的峰强度变化不明显, 这是由于C＝O键比C—O键的结合能更大、更稳定, 难以被分解.纤维素和半纤维素相关谱峰的强度变化均比木质素相关谱峰的强度变化更为明显, 这表明纤维素和半纤维素的降解程度比木质素更大, 这与木质纤维素降解率的数据相一致.相对于醋糟原料, 不同物料负荷条件下沼渣中木质纤维素降解效果明显.其中, P4阶段沼渣与醋糟的红外图谱的差异性最大, 透过率最高.这表明P4阶段下醋糟中木质纤维素降解效率最高, 为本体系的最佳运行阶段.
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图 6 醋糟原料及各个运行阶段下沼渣的红外光谱图 Fig. 6 Infrared spectra of the raw material of the vinegar residue and the samples of each operation phase |
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表 2 样品的红外光谱图解析 Table 2 Analysis of the infrared spectrum of the sample |
2.4.3 酶活性变化情况
木质纤维素作为厌氧消化底物时, 水解阶段是其限速步骤[36].木质纤维素的水解是由一系列的木质纤维素酶来实现, 因此木质纤维素酶的活力决定了木质纤维素的水解速率.纤维素降解的第一步反应就是在内切葡聚糖酶的作用下切割纤维素链[37], 将纤维素小分子化, 因而内切葡聚糖酶是纤维素酶系中的最重要成分, 内切葡聚糖酶普遍采用CMC酶来表征.半纤维素的主要成分为木聚糖, 木聚糖酶是影响半纤维素降解的关键因素[30].因此本研究重点关注CMC酶和木聚糖酶的活性变化.
如图 7所示, 在P1和P2阶段, 发现CMC酶活性从40.00 U·(mL·min)-1逐渐升高至57.84 U·(mL·min)-1, 而当从P2阶段进入P3阶段时, CMC酶活性出现了一次波动, 可能是提升物料负荷时, 底物水解产生的VFA未能被甲烷微生物及时利用, 体系VFA逐渐积累从而抑制了CMC酶活性.木聚糖酶活性在P1和P2阶段时较低, 而且也存在较大波动, 可能的原因是此时氨氮持续积累到了2 700 mg·L-1, 对产酶微生物产生了较大毒性, 强烈抑制了木聚糖酶的分泌, 随着高浓度氨氮的持续抑制, 最终在P2阶段下运行的第13天体现为产气量的降低, 随后经过沼液部分回流的方式使系统恢复, 同时观察到木聚糖酶活升高到50.35 U·(mL·min)-1.可以看到CMC酶在高浓度氨氮下并没有出现酶活性下降, 这说明了产CMC酶的微生物和CMC酶对氨氮有更好的耐受性.在P3阶段时, 木聚糖酶活性逐渐上升, 最高达到66.16 U·(mL·min)-1, 表明体系对半纤维素的降解能力在提高, 这与半纤维素降解率的增大相一致, 而当从P3阶段进入P4阶段时, 木聚糖酶活性出现了较大幅度的降低, 降到36.30 U·(mL·min)-1, 这可能是由于底物的冲击负荷导致的, 继续在P4阶段下连续运行, 木聚糖酶活性又迅速回升至59.87 U·(mL·min)-1, 微生物适应了新物料负荷.而当反应器运行至P5阶段时, 木聚糖酶活性和CMC酶活性都有一定程度下降, 可能是在过高的物料负荷下, 体系中积累的大量木质素致使酶蛋白沉淀[38].
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图 7 木聚糖酶和CMC酶的活性变化情况 Fig. 7 Changes in the activity of xylanase and CMCase |
底物中的木质纤维素降解主要依赖CMC酶和木聚糖酶的水解作用, 而降解过程的中间代谢产物(VFA、氨氮)过多积累会反馈抑制CMC酶和木聚糖酶活性, 本反应体系中木聚糖酶活性受VFA和氨氮浓度变化的影响更大.随着物料负荷的提升, CMC酶和木聚糖酶活性尽管存在波动, 但整体呈上升趋势, 表明本体系降解木质纤维素的能力在不断提高.在P4阶段下的木聚糖酶活和CMC酶活都比P1阶段的高, 这说明经过反应器的连续运行, 在底物的连续刺激以及体系内微生物的自我进化, 构建了高效的木质纤维素降解体系.
综上分析可知, 经过反应器连续运行构建了高效的木质纤维素降解体系, 可以高效地降解半纤维素, 但纤维素的降解效率是本体系的短板, 纤维素的降解率逐渐降低, 与CMC酶活的增加趋势相矛盾, 这是由于纤维素和木质素结构的相互交联, 木质素中的苯环骨架结构难以降解(参见2.4.2节), 对纤维素降解酶和微生物产生了较强的屏蔽作用, 从而弱化了CMC酶的作用, 木质素的积累影响到纤维素的降解效率.从本研究来看, 纤维素和木质素的降解率呈下降趋势, 可以预见的是, 随着木质素的积累, 势必会严重影响纤维素的降解, 从而影响到体系的产气效率和处理效率, 因此为了对醋糟实现更好的资源化效果, 提升纤维素降解率的关键在于解除木质素对纤维素降解酶的屏蔽作用.
3 结论(1) 在最佳运行负荷下[6.15 g·(L·d)-1], 醋糟的单位干物料产沼气量为396mL·g-1, 单位干物料产甲烷量为211 mL·g-1, 木质纤维素降解率为36.40%, 表明醋糟有良好的厌氧消化产甲烷潜力, 也表明反应器中的微生物产甲烷活性良好, 成功建立了稳定的醋糟厌氧消化体系.
(2) 经过反应器的长期运行建立了高效木质纤维素降解体系, 在6.15 g·(L·d)-1负荷下半纤维素、纤维素、木质素的降解率分别为63.66%、21.46%、24.43%, 相比纤维素和木质素, 半纤维素更易被降解.木质素中的苯环结构是难降解的主要原因, 纤维素与木质素相互交联, 木质素的积累进一步影响纤维素的降解.
(3) 反应器连续运行下会出现氨氮的缓慢积累, 使系统处于抑制型稳态, 本系统的氨氮抑制浓度约为2 700 mg·L-1, 当氨氮浓度达到抑制浓度会严重影响微生物的产甲烷活性、木聚糖酶和CMC酶的活性, 从而进一步影响到木质纤维素的降解, 沼液部分回流可以消除氨氮积累, 平衡体系内的氨氮浓度.
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