2017, Vol. 38
2. 南京工业大学生物能源研究所, 南京 211816;
3. 中国科学院成都生物研究所, 成都 610041
, GE Ming-min1,2 , LIU Yong-di1,2 , JIA Hong-hua1,2 , YAN Zhi-ying3 , YONG Xiao-yu1,2 , WU Xia-yuan1,2 , ZHOU Jun1,2
2. Bioenergy Research Institute, Nanjing Technology University, Nanjing 211816, China;
3. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China
我国是农业大国, 每年秸秆产量约8亿t[1], 其中, 玉米秸秆产量占35%左右, 大量秸秆随地堆弃和任意焚烧, 既污染环境, 又造成了资源的浪费.玉米秸秆的资源化利用已成为大家关注的问题, 已有许多专家提出玉米秸秆还田、气化等解决方法[2], 但这些方法成本较高, 很难大范围推广.厌氧消化技术是一种有效地利用玉米秸秆的途径, 不仅可以缓解我国的能源危机, 也有利于保护生态环境.
玉米秸秆厌氧发酵过程中存在诸多问题, 如玉米秸秆分解慢、降解率低、产气率低、能耗高等[3], 其原因是由于玉米秸秆中木质纤维素含量高, 表面有一层蜡质影响厌氧发酵效率.通过了解国内外的研究现状可知, 利用不同手段, 如物理预处理、化学、生物预处理、不同生物质混合发酵等方法, 都可以提高发酵效率[4, 5], 但秸秆中木质纤维素转化为沼气的效率仍然较低, 因此, 秸秆厌氧发酵产沼气过程中存在的问题有待人们更进一步的研究, Eskicioglu等[6]通过中温发酵(20~40℃)和高温发酵(45~60℃)比较研究得出中温厌氧发酵中原料转化率低, 通过提高温度可提高原料的转化率和沼气产率.王阳等[7]研究玉米秸秆发酵中添加菌体蛋白和尿素, 可抑制秸秆体积的漂浮膨胀, 进而提高玉米秸秆的厌氧发酵效率.玉米秸秆厌氧发酵体系中添加外源添加剂能提高厌氧发酵的效率, 是一种新途径. Liu等[8]将活性炭添加到厌氧发酵系统中, 发现可提高废弃物厌氧消化产甲烷的含量. Zhao等[9]将活性炭添加到活性污泥厌氧发酵体系, 研究发现可以提高甲烷产量以及提高生物质降解率.活性炭的优点是具有多孔结构, 比表面积高达500~1 700 m2·g-1, 还具有一定的导热和导电能力, 以及一定的机械强度和耐磨性[10].活性炭中的大孔是微生物的繁殖和栖息之地, 可用来富集微生物, 不仅是一种添加剂, 而且可以作为生物载体促进厌氧发酵.与此相关研究越来越多, 然而分析外源添加活性炭提高产气的微生物学机制相对较少.为此, 本试验选择活性炭作为添加剂, 研究其在玉米秸秆厌氧发酵中的作用, 并通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析活性炭上和发酵液中的细菌和古菌群落结构的差异, 以探讨中温(38℃)、高温(50℃)条件下活性炭加入提高秸秆厌氧发酵产甲烷的效果及微生物学机制.
1 材料与方法 1.1 试验原料玉米秸秆取自连云港, 自然风干后剪切成3~5 cm, 玉米秸秆总固体含量(total solid, TS)为91.32%, 挥发性固体含量(volatile solid, VS)为90.28%, 碳氮比42:1.活性炭(溧阳竹溪活性炭有限公司)比表面积为600 m2·g-1, 颗粒活性炭40目.接种物取自南京工业大学生物能源研究所沼气罐, 经38℃驯化至甲烷含量达到60%后得到的菌液作为接种物, 接种物的TS为6.3%, VS为99.3%, 碳氮比25:1.
1.2 厌氧发酵试验采用500 mL的厌氧发酵瓶, 有效容积为400 mL, 接种量为50%(质量分数), 活性炭的加入量为5 g·L-1[9].设置4个处理, 处理1(中温对照组R1)：38℃, 玉米秸秆+接种物; 处理2(中温试验组R2)：38℃, 玉米秸秆+接种物+活性炭; 处理3(高温对照组R3)：50℃, 玉米秸秆+接种物; 处理4(高温试验组R4)：50℃, 玉米秸秆+接种物+活性炭.每个处理设置3个重复, 通入氮气, 密封瓶口, 保证整个体系处于无氧状态, 厌氧发酵浓度为8%, 周期为20 d, 测量产气量以及气体成分, 每日摇晃发酵瓶3~4次, 每隔3天取样一次, 用于测定各项指标.
1.3 测定方法测定指标：总固体及挥发性固体含量根据美国能源部NREL原料成分分析方案测定[11], 采用的仪器为箱式炉(KSL-1100X, 合肥科晶材料技术有限公司); 接种物中总氮采用全自动凯氏定氮仪(海能K9860) 测定, 接种物中总碳采用TOC仪(SHIMADZU TOC-V CSN)测定; 秸秆碳氮比(C/N)由元素分析仪测定(Vario Max CNS, Elementar Americas, Mt.Laurel, NJUSA); 纤维素(cellulose)、半纤维素(hemicellulose)和木质素(lignin)含量采用范式法(Van Soest)测定[12]; 挥发性有机酸(volatile fatty acid, VFA)采用紫外可见分光光度计(UV-3000, 上海美谱达有限公司)进行测定; 日产气量采用排水法测定[13]; 气体成分采用气相色谱仪测定(SP6800A, 山东鲁南瑞虹化仪器有限公司, TCD检测器, HayeSep Q多孔高聚物类不锈钢填充柱ϕ 3 mm×2 m, 氦气为载气, 流速52.72 mL·min-1, 柱温45℃, 检测器温度120℃, 气化室温度120℃, 进样量400 μL)[14].
活性炭扫描电镜分析：将发酵液中活性炭取出后, 用pH值为6.8的0.1 mol·L-1磷酸缓冲溶液冲洗3次, 每次10 min.然后分别用浓度为50%、70%、80%、90%的乙醇进行脱水, 接着用HCP-2(HITACHI)型临界点干燥仪对样品进行干燥、粘样、喷金, 最后采用IB-5(Giko)型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层1500 nm的金属膜, 扫描电子显微镜(S-3400N3, 日本Hitachi公司)观察样品[10, 15].
DNA提取、PCR扩增和DGGE分析：使用UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit(Mo Bio Laboratories, USA)从0.5 g发酵液中提取总DNA.引物用338F-GC(CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG), PCR采用50 μL体系, 各组分分别为：10×PCR Buffer 5 μL; dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL; Genomic DNA 10 ng; Bar-PCR primer F(50 μmol·L-1)0.5 μL; Primer R(50 μmol·L-1)0.5 μL; Plantium Taq(5 U·μL-1) 0.5 μL; 最后加入灭菌后的双蒸水至50 μL. PCR扩增细菌16S rDNA V3区[16].
古菌产甲烷菌16S rDNA片段扩增选用古菌引物PRA46f(5′-YTAAGCCATGCRAGT-3′), PREA110(5′-YGGGTCTCGCTCGTTRCC-3′)[17].采用的仪器包括电泳仪(DYY-6C), 北京市六一仪器厂; 变性梯度凝胶电泳系统(Hercules)BIO-RAD.
2 结果与讨论 2.1 中高温条件下添加活性炭对玉米秸秆厌氧发酵产气的影响厌氧发酵产气的变化见图 1, 图 1(a)为累计沼气产量, 图 1(b)为累计甲烷产量, 图 1(c)为甲烷体积分数.从中可以看出, 在进料固含物质量相等的情况下, 中温对照组、中温试验组、高温对照组以及高温试验组的累计沼气产量分别为3 510、5 555、3 800及6 480 mL, 本试验发酵瓶有效容积400 mL, 发酵物浓度为8%, 接种物50%, 即每个发酵瓶内添加的秸秆干物质量约为16 g, 折算到单位干物质产气量, 其中中温对照组、中温试验组、高温对照组以及高温试验组的累计沼气产量(以TS计)分别为219、347、238以及405 mL·g-1; 中温对照组、中温试验组、高温对照组以及高温试验组的累计甲烷产量分别为1 628、2 900、1 780以及3 480 mL; 中温对照组、中温试验组、高温对照组以及高温试验组沼气中最高甲烷浓度分别为58.06%、62.54%、58.51%、65.54%.
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图 1 厌氧发酵产气变化 Fig. 1 Changes of biogas yield during anaerobic fermentation |
随着发酵的进行, 产甲烷菌不断富集, 累积产气量随之升高[7].在玉米秸秆厌氧发酵过程中, 高温对照组的单日甲烷浓度均略高于中温对照组, 高温试验组的单日甲烷浓度均高于中温试验组, 高温空白组的累积产甲烷量略高于中温空白组, 高温试验组的累积产甲烷量比中温试验组提高了20%, 相较中温条件, 高温条件下更加有利于秸秆厌氧发酵的甲烷浓度的提高以及产甲烷量的提高, 且活性炭在高温条件下对秸秆厌氧发酵体系发挥的作用更为显著; 在第4 d至第16 d, 中、高温试验组的甲烷浓度均在50%以上, 最高浓度均超过60%, 第8 d至第14 d, 中、高温对照组的甲烷浓度均在50%以上, 最高浓度并未达到60%, 高温试验组的累计甲烷产量比高温空白组提高了96%;中温试验组的累计甲烷产量比中温空白组提高了63%, 可见, 添加活性炭在中温和高温条件下均可显著提高秸秆厌氧发酵产甲烷的量及沼气中甲烷的浓度, 且高温条件下添加活性炭的甲烷浓度以及累计产甲烷的量提高更为明显.
2.2 玉米秸秆厌氧发酵过程中pH值和VFAs的变化厌氧发酵过程中pH值的变化如图 2所示, 可以看出在厌氧发酵初始时pH值下降, 至第4 d降至最低, 其中, 中温对照组、中温试验组、高温对照组以及高温试验组的pH值分别低至5.810、6.095、6.345和7.055.随着有机酸的利用消耗, 5 d以后pH值开始回升, 最终发酵液的pH值维持在7.500~8.000之间.不同处理厌氧发酵过程中有机酸浓度的变化如图 3, 其中图 3(a)为乙酸, 图 3(b)为甲酸, 图 3(c)为丙酸, 从中可以看出, 整个厌氧发酵周期中, 乙酸浓度峰值出现在第1 d, 随后处于逐渐下降的状态, 在第4 d, 中温空白组的乙酸浓度最高, 高温对照组和中温试验组次之, 高温试验组最低.整个发酵周期中高温试验组乙酸浓度均低于高温空白组的乙酸浓度, 中温条件下的乙酸浓度也均高于高温下的乙酸浓度, 且在中温试验组和中温对照组在第11 d会出现一个小幅度的上升; 甲酸的浓度在整个厌氧发酵周期中, 高温试验组与高温空白组趋势一致, 处于一直下降直至平稳的状态, 而中温试验组与中温空白组趋势一致, 最高峰值在第1 d然后下降, 在第11 d存在第二个峰值, 然后下降直至平稳; 而在整个厌氧发酵过程中, 丙酸的浓度均呈现先升后降的趋势, 第4 d达到最大, 在第8 d以后均降至0 mg·L-1.
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图 2 不同处理厌氧发酵过程中pH值的变化 Fig. 2 Changes of pH during anaerobic fermentation in different treatments |
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图 3 不同处理厌氧发酵过程中有机酸浓度的变化 Fig. 3 Changes of VFAs concentration during anaerobic fermentation in different treatments |
综合分析厌氧发酵过程的产气变化(图 1)、pH值的变化(图 2)及有机酸浓度的变化(图 3)可以看出, 在第1 d到第4 d是产气的启动阶段, 该阶段产气量以及甲烷浓度均不高, 且丙酸的浓度快速提升, 在第4 d达到最大值, 同时pH值在第4 d达到最低值, 表明在发酵初期玉米秸秆快速水解成有机酸[18], 而厌氧发酵水解阶段甲烷菌的数量不足, 水解酸化所产生的酸物质和甲烷菌数量未达到平衡[7], 因此这个阶段是最容易造成酸化的阶段, 而pH值过低又会明显抑制产甲烷菌的活性, 因此在这个阶段维持厌氧发酵体系快速分解有机物又不引起酸化是很重要的.在启动阶段, 高温试验组分解有机物使丙酸快速提升达到峰值, 且该阶段利用乙酸的速度较快, 体系维持中性的范围, 产甲烷菌的活动没有被抑制, 而高温空白组利用乙酸的速率低于高温试验组, 第4 d的pH值低至6.35, 体系酸化不利于产甲烷菌的生长, 此阶段高温试验组的产气量是最高且最稳定的; 在启动阶段, 中温试验组利用乙酸的速率与高温空白组差异不大, 第4 d的pH值低至6.09, 而中温空白组乙酸浓度还有些许上升, 第4 d的pH值低至5.81, 可见, 中温的试验组和空白组的体系均酸化是不利于产甲烷的, 但是添加活性炭在一定程度上缓解了体系的酸化, 中温试验组的累计甲烷产气量高于中温空白组.在启动阶段, 高温条件下秸秆厌氧发酵体系酸化趋势会缓和一些, 且添加活性炭能够缓解秸秆厌氧发酵体系酸化的趋势, 更加有利于厌氧发酵产甲烷的进行.启动阶段过后, 当发酵液中的乙酸降解到一定程度时, 微生物开始利用丙酸, 丙酸开始下降, 通过系统中的微生物将丙酸转化为产甲烷菌可利用的乙酸和H2/CO2[19].
2.3 添加活性炭对玉米秸秆厌氧发酵前后化学组分影响厌氧发酵前后玉米秸秆中半纤维素、纤维素、木质素的变化如表 1所示, 中、高温对照组秸秆半纤维素的含量较发酵前分别降低了12%和18%, 纤维素含量分别降低了26%和31%;中高温试验组秸秆半纤维素的含量较发酵前的样品分别降低了63%和64%, 纤维素的含量分别降低了47%和57%;中温试验组较中温对照组半纤维素、纤维素降解率分别提高了42%和38%;高温试验组较高温对照组厌氧发酵后秸秆的半纤维素、纤维素降解率分别提高了56%和63%.
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表 1 厌氧发酵前后玉米秸秆中半纤维素、纤维素、木质素含量变化/% Table 1 Hemicellulose, cellulose, and lignin contents of corn straw before and after anaerobic fermentation/% |
综合分析厌氧发酵过程中产气的变化(图 1)及厌氧发酵前后玉米秸秆中半纤维素、纤维素、木质素含量变化(表 1)可知, 在进料含固物质量相等的情况下, 高温试验组的累计甲烷产量较中温试验组提高了20%, 且高温试验组的甲烷浓度均高于中温试验组, 且中、高温试验组秸秆半纤维素的含量较发酵前的样品分别降低了63%和64%, 纤维素的含量分别降低了47%和57%, 可见温度的提高更由利于微生分解利用秸秆中的纤维素、半纤维素, 提高沼气产量及原料利用率, 因此高温比中温更有利于玉米秸秆的厌氧发酵, 但是差异并不是特别显著, 这与文献[20]的结论一致.另外, 添加活性炭后, 中、高温试验组的累计甲烷产量分别比中高温对照组提高了63%和96%, 中、高温试验组的甲烷浓度均高于中、高温对照组, 中温试验组厌氧发酵后秸秆的半纤维素、纤维素降解率分别比中温对照组提高了42%和38%, 高温试验组厌氧发酵后秸秆的半纤维素、纤维素降解率分别比高温对照组提高了56%和63%.可见, 添加活性炭可提高厌氧发酵对玉米秸秆中纤维素、半纤维素的降解率, 可能是由于活性炭吸附菌群后, 改变菌群数量和种类, 富集强化产甲烷菌, 促进产气, 提高厌氧发酵体系的累计产气量以及厌氧发酵过程中沼气中甲烷的浓度[20].
2.4 活性炭表面菌群的扫描电镜(SEM)观察为进一步研究添加活性炭提高沼气产量的机制, 通过SEM观察发酵前后活性炭上菌群的形态.由图 4放大30 000倍条件下的中、高温试验组活性炭扫描电镜图中可发现, 中、高温条件下活性炭表面附着大量的类似菜花状的球菌; 对比相同放大倍数条件下的发酵前后的活性炭的扫描电镜图, 发现挂膜后活性炭表面空隙明显减小; 由中、高温试验组发酵后的活性炭的不同倍数下的扫描电镜图可以看到, 经过厌氧发酵后的活性炭表面及孔道里面附着大量的球状及杆状微生物; 观察图 4, 可发现中、高温条件下活性炭表面的微生物的形态也有一定的差异.
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(a)、(b)、(c)放大30 000倍; (d)、(e)、(f)放大10 000倍; (g)、(h)、(i)放大5 000倍; (a)、(d)、(g)为高温试验组发酵后活性炭; (b)、(e)、(h)中温试验组发酵后活性炭; (c)、(f)、(i)为发酵前活性炭 图 4 活性炭扫描电镜图片 Fig. 4 SEM pictures of activated carbon |
在中、高温条件下, 活性炭表面附着的大量形状如菜花状的球菌, 据文献报道可能是产甲烷球菌属[21].同时活性炭表面粗糙, 孔隙丰富, 其表面的大孔和中孔附着大量微生物生长繁殖, 是有利于更多的有机物转化为甲烷的[10, 21], 活性炭表面的微生物形态各样, 可见, 活性炭可作为生物载体材料增加厌氧反应系统中的微生物的数量以及种类, 为产气的提升提供可能性.添加活性炭能提高玉米秸秆产气效率的机制可能是由于产甲烷菌驻留在活性炭上形成生物势菌群, 进而提高系统的稳定性和效率[22, 23].
2.5 不同处理厌氧发酵前后细菌菌群结构的变化 2.5.1 不同处理发酵前后细菌多样性分析图 5为不同阶段样品中细菌的DGGE图谱, 从中可发现除原样样品外, 其余6个样品中条带的数目均较为丰富.由表 2可知, 原样样品中的香农指数偏小, 其余各样品中该数值差异不显著.同时, 由不同阶段样品中的细菌种群的相似性指数Cs(表 3)可知, 发酵后的6个样品与发酵前原样中的细菌种群相似性均较差, 高温试验组活性炭表面及发酵液中的细菌多样性均比中温试验组的低, 且中、高试验组的活性炭上的细菌多样性均比中、高试验组的发酵液中的低, 这可能由于温度升高改变了微生物体内酶的种类及活性, 特别是细胞膜上许多酶类的活力[24, 25].
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(a)高温对照组发酵液; (b)高温试验组发酵液; (c)高温试验组活性炭表面; (d)中温试验组发酵液; (e)中温试验组活性炭表面; (f)中温对照组发酵液; (g)接种物, 下同 图 5 不同阶段样品中细菌的DGGE图谱 Fig. 5 DGGE fingerprint of bacteria in samples of different anaerobic fermentation periods |
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表 2 不同阶段样品中细菌种群香农指数 Table 2 Shannon index of bacterial population in samples of different anaerobic fermentation periods |
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表 3 不同阶段样品中细菌种群相似性指数 Table 3 Comparability index of bacterial population in samples of different anaerobic fermentation periods |
2.5.2 不同处理发酵前后细菌测序性分析
经过序列比对分析后, 由图 5和表 4可以看出, 发酵前原样中Sporosarcina globispora strain可能是一种需氧的芽孢杆菌, 经发酵后消失了; Capnocytophaga canimorsus可能是一种厌氧菌, 经发酵后出现.高温对照组的发酵液中的优势菌种是Bacillus sp., 属于厚壁菌门, 高温试验组的发酵液中的优势菌种是Clostridiales bacterium, 属于拟杆菌门.中温对照组的发酵液和中温试验组的发酵液中均未发现明显优势细菌菌种. Porphyromonadaceae bacterium和Petrimonas sulfuriphila strain也是一类产酸菌, 既存在于高温试验组发酵液中也存在于中温试验组发酵液.
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表 4 不同阶段样品中细菌的测序结果 Table 4 Sequencing results of bacteria in samples of different anaerobic fermentation periods |
细菌的DGGE图谱中条带数目均有增加, 原样样品中的香农指数偏小, 其余各样品中该数值差异不显著, 且发酵后的样品与发酵前原样中的细菌种群相似性均较差, 可见经过秸秆的厌氧发酵, 体系中的细菌菌群发生很大的变化, 发酵前原样存在的Sporosarcina globispora strain经发酵后消失了, 而Capnocytophaga canimorsus经发酵后出现, 说明经发酵后, 某些在接种物中并不占优势的细菌会逐渐占优势, 这也是造成发酵前后细菌菌群变化大的原因之一[26, 27].高温对照组和试验组的发酵液中的优势细菌菌群分别是Bacillus sp.和Clostridiales bacterium, 这两种细菌均为产酸菌, 可水解淀粉、蛋白质、纤维素等大分子物质, 利用发酵液中的营养物质产生有机酸, 参与厌氧发酵的第一阶段, 这可能是高温对照组和试验组的纤维素以及半纤维素的降解率分别高于中温的原因之一. Porphyromonadaceae bacterium和Petrimonas sulfuriphila strain存在于中、高温试验组发酵液中, 在中、高温对照组的发酵液中并不存在, 均属于产酸菌, 这一类产酸菌在发酵过程中分解葡萄糖产生乙酸、CO2和H2, 将S还原成H2S, 添加活性炭能促进秸秆厌氧发酵体系细菌菌群更为丰富, 是提高秸秆厌氧发酵体系的甲烷浓度以及产甲烷量的重要原因之一[28].
2.6 不同处理发酵前后古菌的菌群结构的变化 2.6.1 不同处理发酵前后古菌多样性分析对发酵前后的样品进行总DNA提取, PCR扩增及DGGE分析, 得到样品中古菌的DGGE图谱, 如图 6所示.可以看出：古菌的DGGE图谱上, 总体上条带的数目均较丰富, 2号条带存在于接种液、中温活性炭表面上、中温试验组液中的4号条带经过厌氧发酵后消失; 13号条带在中温条件下亮度有所增强, 在高温条件下不明显. 15号条带在接种液中及中温条件下不明显, 在高温条件下亮度增强.计算得到各个样品中古菌的香农指数如表 5所示, 可以看出香农指数没有显著差异.样品之间古菌种群的相似性指数Cs如表 6所示, 可以看出接种物与发酵后的样品中古菌种群相似性相对较差, 中、高温发酵体系中发酵液中的古菌种类差异不显著, 中、高温试验组中活性炭上的古菌多样性均低于中、高温试验组的发酵液中的古菌多样性.
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图 6 不同阶段样品中古菌的DGGE图谱 Fig. 6 DGGE fingerprint of archaea in samples of different anaerobic fermentation periods |
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表 5 不同阶段样品中古菌种群相似性指数 Table 5 Shannon index of archaea population in samples of different anaerobic fermentation periods |
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表 6 不同阶段样品中古菌种群香农指数 Table 6 Comparability index of archaea population in samples of different anaerobic fermentation periods |
2.6.2 不同处理发酵前后古菌测序分析
经过序列比对分析后, 由图 6和表 7可以看出, 随着发酵的进行, 样品中优势古菌菌群变化较大.接种物中的优势古菌菌群为Methanobacterium subterraneum sp., 且发酵后的样品中均未出现; 发酵后中温对照组的发酵液中优势古菌菌群主要为产甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.), 中温试验组的活性炭上的古菌菌群与中温试验组的发酵液中的古菌菌群差异不显著, 优势古菌菌群均主要为甲烷鬃毛菌(Methanosaeta concilii strain)和产甲烷八叠球菌属; 高温对照组的发酵液中优势菌群主要为甲烷囊菌属(Methanoculleus sp.), 高温试验组的活性炭上的古菌菌群与高温试验组的发酵液中的古菌菌群存在较大差异, 发酵后高温试验组的发酵液中优势古菌菌群主要为醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans strain)和甲烷囊菌属, 而高温试验组活性炭表面上富集的主要为甲烷八叠球菌嗜高温菌属(Methanosarcina thermophila strain)和甲烷八叠球菌.
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表 7 不同阶段样品中古菌的测序结果 Table 7 Sequencing results of archaea in samples of different anaerobic fermentation periods |
古菌的DGGE图谱上条带的数目均较丰富, 香农指数没有显著差异.随着发酵的进行, 接种物中优势菌群会发生变化, 接种物中的优势菌群Methanobacterium subterraneum经发酵后发酵液中和活性炭上不存在, 可能由于底物(H2/CO2和甲酸盐)缺乏, 导致甲烷杆菌消失, 这个可能是导致厌氧发酵体系前后菌群相似性差异较大的原因之一[29].中温对照组发酵后的优势古菌菌群主要为产甲烷八叠球菌属, 中温试验组发酵后的活性炭上的优势古菌菌群和发酵液中的优势古菌菌群均为甲烷鬃毛菌和产甲烷八叠球菌属, 可见, 中温条件下添加活性炭有利于氢营养型甲烷鬃毛菌在秸秆厌氧发酵体系中形成优势古菌群落, 促进提高秸秆厌氧发酵的甲烷浓度以及甲烷产量.高温对照组发酵后的发酵液中的优势古菌菌群主要为甲烷囊菌属, 高温试验组发酵后的发酵液中优势菌群主要为醋酸甲烷八叠球菌和甲烷囊菌属, 可见, 高温条件下添加活性炭有利于乙酸营养型的醋酸甲烷八叠球菌在秸秆厌氧发酵体系中形成优势古菌群落, 促进有机物的分解, 提高产气甲烷.高温试验组发酵后的活性炭上的优势古菌菌群与发酵液中的优势古菌菌群存在较大差异的, 在高温条件下活性炭表面上富集的主要为甲烷八叠球菌嗜高温菌属和甲烷八叠球菌, 八叠球菌嗜高温菌属在低的pH值或乙酸积累的情况下仍能够生存[30], 可能是高温条件酸化趋势较为缓和, 高温启动阶段产气优于中温的原因.
3 结论(1) 对比中高温秸秆厌氧发酵体系, 高温比中温更有利于秸秆的厌氧发酵产沼气.添加活性炭的秸秆厌氧发酵体系气体产量均有显著的提高, 整个周期甲烷浓度有提升, 玉米秸秆中纤维素、半纤维素的降解率也均有显著提高.添加活性炭可有效缓解厌氧发酵系统的酸化, 促进厌氧发酵纤维素及半纤维素的降解, 活性炭表面能富集大量微生物, 形成生物膜, 尤其是其对产甲烷菌的驻留作用能提高玉米秸秆的产气效率, 添加活性炭对高温秸秆厌氧发酵体系中的甲烷浓度以及甲烷产量的提升最优.
(2) 在秸秆厌氧发酵体系中, 经过厌氧发酵, 中温对照组和试验组的发酵液中均未出现明显优势细菌菌群, 高温对照组和试验组发酵液中的优势细菌菌种分别为Bacillus和Clostridiales bacterium, 均属于产酸菌, 能促进水解大分子物质产生有机酸, 从而提高纤维素、半纤维素的降解率, 这些优势细菌菌群是高温秸秆厌氧发酵体系的产气优于中温的重要原因之一; 中温试验组的活性炭上的古菌菌群和发酵液中的古菌菌群差异不显著, 中温条件下添加活性炭有利于氢营养型甲烷鬃毛菌在发酵液中以及活性炭上形成优势古菌群落, 能促进中温条件下甲烷浓度的提高以及甲烷产量的提高.添加活性炭对高温秸秆厌氧发酵体系的古菌菌群的影响更为明显, 使古菌优势群落更为丰富多样, 高温试验组的活性炭上的古菌菌群和发酵液中的古菌菌群存在明显的差异, 高温条件下添加活性炭有利于乙酸营养型的醋酸甲烷八叠球菌在秸秆厌氧发酵体系的发酵液中形成优势古菌群落, 而高温试验组中活性炭表面上富集的主要古菌群落为甲烷八叠球菌嗜高温菌和甲烷八叠球菌, 能缓和酸化趋势, 提高气体产量, 促进高温条件下产甲烷, 这也是高温试验组的累计气体产量优于其他处理的重要原因之一.添加活性炭能促进秸秆厌氧发酵体系的古菌以及细菌菌群更为丰富多样, 从而促进有机物的分解, 促进甲烷浓度以及累计气体产量的提高, 且在高温体系中的促进作用更为显著.
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