2017, Vol. 38
微生物固碳是缓解温室气体过量排放所导致的温室效应的有效措施之一.主要的固碳微生物是自养微生物, 分为光能自养型和化能自养型[1], 它们利用光能或还原性无机物氧化时所产生的化学能同化CO2以构成细胞物质.
化能自养微生物通过氧化无机化合物, 即电子供体, 获得能量, 可将CO2还原为小分子有机碳之后再用于合成细胞骨架.根据提供能源的无机物类型不同, 化能自养微生物主要分为硝化细菌、硫化细菌、铁细菌和氨氧化细菌等类群, 以及某些分离于海洋的混合微生物菌群[2].排硫硫杆菌是一种重要且典型的专性化能自养菌, 属硫化细菌, 它能将S2-、S2O32-等低价态硫化物氧化成亚硫酸、连四硫酸及硫酸等, 并可在这一氧化过程中获得能量, 利用CO2为碳源进行生长繁殖, 并形成胞外单质硫[3], 因此具有脱硫和固碳的功能.目前其相关研究和应用主要集中于废水、废气脱硫处理方面[4], 而对于其固碳功能的研究相对较少.排硫硫杆菌通过卡尔文循环途径固定CO2, 核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶RubisCO是卡尔文途径的关键酶[5, 6], 按其结构、催化性能和对O2的敏感性来区分, 主要有RubisCOⅠ和RubisCOⅡ两种类型, cbbL和cbbM分别是其对应的大亚基编码基因, 而排硫硫杆菌同时拥有cbbL和cbbM编码基因[7].
化能自养菌的固碳速率主要取决于其内在因素, 如固碳途径的关键酶酶蛋白的表达量及其催化活性[8], 而外在因素主要是营养物质、能量物质的有效供给和适合的环境条件等.很多研究表明, 在化能自养菌的生长过程中, 其利用无机碳合成有机物需要消耗大量的能量和还原力, 因此电子供体是影响其生长的重要限制性因素[9, 10].此外, 有研究发现, 环境中的有机物会抑制化能自养菌的自养过程[11], 另有研究表明, 化能自养菌在无机环境下培养时都会在胞外积累自我产生的有机物[12], 而这些有机物是否会抑制其自养过程的相关研究目前较少.
还原性硫既是排硫硫杆菌硫化作用的底物, 又是细胞生长的硫源.但目前关于还原性硫化物Na2S2O3·5H2O在排硫硫杆菌固碳过程中的作用, 及其对固碳能力的影响和机制尚未见研究报道.本实验为探究Na2S2O3·5H2O对排硫硫杆菌固碳能力的影响及其作用机制, 测定了不同Na2S2O3·5H2O浓度下排硫硫杆菌的固碳能力, 并从固碳过程关键酶基因cbb的转录特性和胞外游离有机碳两方面分析了Na2S2O3·5H2O影响排硫硫杆菌固碳的作用机制.
1 材料与方法 1.1 菌种来源排硫硫杆菌DSM505购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ), 并由同济大学环境科学和工程学院环境生物实验室保存并培养.
1.2 培养方法与条件种子培养基(g·L-1)：(NH4)2SO4 0.10;K2HPO44.0;KH2PO4 4.0;MgSO4·7H2O 0.10;CaCl2 0.10;FeCl3·6H2O 0.02;MnSO4·H2O 0.02;Na2S2O3·5H2O 10;pH 6.6.
基础培养基(g·L-1)：(NH4)2SO4 0.10;K2HPO44.0;KH2PO4 4.0;MgSO4·7H2O 0.10;CaCl2 0.10;FeCl3·6H2O 0.02;MnSO4·H2O 0.02;pH 6.6.
种子培养：在100 mL血清瓶中装入40 mL种子培养基, 灭菌后(121℃, 20 min)接入菌种(购自DSMZ), 用硅胶塞密封后向瓶中注入21% O2及10% CO2, 采用封口膜封口后, 置于摇床避光振荡培养3 d(28℃, 160 r·min-1)后菌液用作后续接种.
不同Na2S2O3·5H2O浓度下排硫硫杆菌的培养：在100 mL血清瓶中装入40 mL基础培养基, 加入电子供体Na2S2O3·5H2O使其浓度分别为1、5、10、15、30和50 g·L-1, 灭菌后(121℃, 20 min)接种1 mL种子菌液, 用硅胶塞密封后向瓶中注入21% O2及10% CO2, 采用封口膜封口后, 置于摇床避光振荡培养3 d(28℃, 160 r·min-1).
1.3 分析方法 1.3.1 固碳能力及胞外游离有机碳测定测定固碳能力：采用岛津TOC-VCPH有机碳分析仪(Shimadzu Seisakusho Co.Ltd., Kyoto, Japan)测定培养后菌液的TOC值, 以反映微生物的固碳能力.测定TOC前需用浓盐酸将待测菌液的pH调至4.0左右, 以消除无机碳对测定结果的影响.
测定胞外游离有机碳浓度：将培养后的菌液通过0. 22 μm水相微孔滤膜, 以同样的方法测定滤液中的TOC值, 以反映胞外游离有机碳浓度.
1.3.2 cbb基因丰度及转录量DNA提取、RNA提取及反转录：取一定量培养后的菌液通过0.22 μm微孔滤膜获得排硫硫杆菌菌体, 采用DNA提取试剂盒(UltraClean® DNA Isolation Kit, MoBio USA)提取总细菌DNA.采用TRIzol® Plus RNA纯化试剂盒(Invitrogen, USA)提取总RNA, 通过核酸定量仪NanoDrop ND-2000(Thermo, USA)测定DNA样品和RNA样品的浓度及纯度.采用反转录法分析cbb基因转录量, 进行反转录前, 使用gDNA Eraser(Takara, Japan)处理样品(42℃, 2 min)以去除基因组DNA的干扰, 处理后的样品使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent kit (Takara)根据其操作手册进行反转录合成cDNA.
cbb基因丰度及转录量分析：采用定量PCR(qPCR)分析仪分别测定DNA和cDNA样品中的cbb基因拷贝数, 它们分别代表cbb基因丰度及cbb基因转录量.本研究采用绝对定量方法计算样品浓度, 根据含有不同目标基因(cbbL/cbbM)的质粒标准品构建相应的标准曲线, 每个标准曲线以10倍倍数逐步梯度稀释, 标准曲线浓度变化范围为102~108 copies·μL-1.标准曲线R2大于0.99, 且样品回收率在90%~110%. qPCR反应中所用的引物及扩增条件如表 1所示.所有qPCR的测定采用ABI 7500 Real-time PCR仪(Applied Biotechnologies)进行分析. qPCR反应体系采用SYBR Premix Ex TaqTM体系(20 μL), 其中DNA/cDNA为2 μL.在每个循环的最后一个阶段收集荧光, 溶解曲线温度变化为60~95℃, 根据样品循环阈值(Ct值)计算样品的基因拷贝数.
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表 1 qPCR所用引物和反应程序1) Table 1 Primers and experimental conditions for qPCR of cbb genes |
1.4 数据处理与统计分析
采用SPSS 20.0统计分析软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)和LSD多重比较(Duncan法), 分析Na2S2O3·5H2O浓度不同时各指标的差异显著性; 采用SPSS 20.0统计分析软件对各指标进行皮尔森相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下排硫硫杆菌固碳能力将排硫硫杆菌按1.2节的方法在不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下进行培养, 经过一个培养周期后测定净固碳量(TOC), 所得结果如图 1所示.
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固碳能力以净固碳量衡量, 净固碳量(mg·L-1)=培养3 d后菌液TOC值-培养前菌液初始TOC值 图 1 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下排硫硫杆菌的固碳能力 Fig. 1 Variation of carbon fixation capability of Thiobacillus thioparus with the concentrations of Na2S2O3·5H2O |
可以看出, Na2S2O3·5H2O的浓度显著影响排硫硫杆菌的固碳能力.当Na2S2O3·5H2O浓度为1~15 g·L-1时, 固碳量随Na2S2O3·5H2O浓度的升高而升高, 而当Na2S2O3·5H2O浓度升高至30 g·L-1时, 固碳量开始大幅下降并随Na2S2O3·5H2O浓度的升高而降低.可能原因是盐度增加导致渗透压过高使细胞失活, 抑制其生长繁殖[15].
2.2 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下排硫硫杆菌cbb基因转录特性固碳途径关键酶蛋白的表达量及其催化活性是影响排硫硫杆菌固碳的重要因素之一[8].由于RubisCO酶蛋白浓度太低难以检出, 而cbb的mRNA浓度变化与RubisCO酶的表达水平基本相一致, 故采用1.3.2节中的方法分析了不同Na2S2O3·5H2O浓度下cbb基因的转录特性, 以此间接表征酶的表达水平, 探究Na2S2O3·5H2O影响排硫硫杆菌固碳能力的作用机制.
结果如图 2(a)所示, cbb基因转录量与固碳能力变化规律基本一致, 二者呈显著正相关(r=0.837, P＜0.05), 但cbb基因总转录量受菌体数量的影响, TOC值越高的样品其排硫硫杆菌浓度也越高, 因此总的cbb基因转录量并不能代表单位菌体的cbb基因转录效率.为进一步阐明Na2S2O3·5H2O浓度对单个细胞cbb基因转录效率的影响, 本实验另测定了不同样品的cbb基因丰度.由图 2(b)可以看出, 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下, 样品的cbb基因丰度与固碳能力的变化规律基本一致, 呈显著正相关(r=0.963, P＜0.01).这表明随着Na2S2O3·5H2O浓度的增加(1~15 g·L-1以内), 细胞数量增加, 从而导致cbb基因丰度乃至总转录量随之增加.
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cbb基因转录效率=cbb基因转录量/cbb基因风度 图 2 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下排硫硫杆菌cbb基因转录量、cbb基因丰度及cbb基因转录效率 Fig. 2 Variation of cbb genes transcription level, cbb genes abundance and cbb genes transcription efficiency of Thiobacillus thioparus with the concentrations of Na2S2O3·5H2O |
由图 2(c)可见, 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下, cbb基因转录效率(即单位cbb基因拷贝的转录量)无显著性差异, 这说明Na2S2O3·5H2O对cbb基因转录效率无显著影响, 故Na2S2O3·5H2O影响排硫硫杆菌固碳的作用机制可能不是通过影响其cbb基因转录效率.当Na2S2O3·5H2O浓度为30 g·L-1、50 g·L-1时, 固碳量大幅下降, 但cbb基因转录效率较高, 这说明过高的Na2S2O3·5H2O浓度只是抑制了排硫硫杆菌的生长繁殖, 并没有抑制其cbb基因转录效率.
2.3 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下cbb基因表达模式cbbL和cbbM分别是RubisCOⅠ和RubisCOⅡ两种类型固碳关键酶所对应的大亚基编码基因, 不同类型RubisCO酶的催化比活性可能不同[16].大量研究表明, 某些环境条件对两种类型cbb基因的表达有重要的影响, 有报道指出了O2及CO2对cbb基因的表达模式, 表达效率和RubisCO酶的比催化活性有显著的影响[17, 18].如RubisCOⅡ在低氧和高二氧化碳浓度下有较高的表达, 而RubisCOⅠ则相反, 其能够在CO2较低的环境中有效表达[19, 20].
为进一步探究Na2S2O3·5H2O浓度变化是否也会影响cbb基因的表达模式, 从而影响催化活性, 本文以cbbL、cbbM基因的转录效率在总cbb基因转录效率中的所占比来表示不同Na2S2O3·5H2O浓度条件下排硫硫杆菌cbb基因的表达模式, 结果表明(见表 2), 排硫硫杆菌的固碳基因有两种形式, 即cbbL和cbbM, Na2S2O3·5H2O浓度的变化对cbb基因的表达模式基本无影响, 任何浓度下都是cbbL基因的表达占绝对优势.
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表 2 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下cbb基因不同表达模式所占比 Table 2 Transcription pattern of cbb genes under different Na2S2O3·5H2O concentrations |
2.4 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下胞外游离有机碳浓度及其与固碳能力的相关性
有研究发现, 环境中的有机物会抑制化能自养菌的自养过程, 如环境中的丙酮酸能抑制氧化硫硫杆菌固定CO2, 当丙酮酸浓度达到1 mmol·L-1时, 其对于氧化硫硫杆菌固定CO2的抑制率可达84%[21], Silver等[22]研究发现葡萄糖的存在会抑制微生物的自养代谢过程.另有研究表明, 化能自养菌在无机环境下培养时都会在胞外积累自我产生的有机物[12], 除了培养后期细胞死亡和裂解释放大量有机碳外, 细菌细胞代谢过程中也会透过细胞膜扩散释放部分有机碳到胞外环境中, 有机碳的存在会抑制其自养过程[23].而Na2S2O3·5H2O是否会影响胞外有机碳的浓度, 进而影响化能自养菌的固碳能力, 目前尚未见研究报道.
如图 3(a)所示, 在排硫硫杆菌固碳过程中会产生并积累胞外游离有机碳, 且Na2S2O3·5H2O的浓度显著影响EFOC/TOC比率[图 3(b)].当Na2S2O3·5H2O浓度为5、10、15 g·L-1时, EFOC/TOC比率约为25%~35%, 而当Na2S2O3·5H2O浓度为1、30、50 g·L-1时, EFOC/TOC比率约为45%.相关性分析发现, EFOC/TOC比率与TOC呈显著负相关(r=-0.970, P＜0.01), EFOC/TOC比率越低, 固碳能力越强.
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图 3 不同浓度Na2S2O3·5H2O条件下排硫硫杆菌的胞外游离有机碳浓度及EFOC/TOC比率 Fig. 3 Extracellular free organic carbon concentrations and EFOC/TOC ratio of Thiobacillus thioparus under different Na2S2O3·5H2O concentrations |
在自养菌同化CO2的过程中会产生大量的糖类以供合成蛋白及细胞骨架[24], 当细胞骨架合成速率不能与CO2同化速率相匹配时, CO2同化产生的有机物可能会透过细胞膜释放到胞外成为胞外游离有机碳(EFOC)[25].当Na2S2O3·5H2O浓度为5、10、15 g·L-1时, Na2S2O3·5H2O作为电子供体供应充足, 可以提供足够的能量以促进细胞骨架合成, 此时EFOC/TOC比率能保持较低水平, 反馈抑制效应可能也较弱.而当Na2S2O3·5H2O浓度为1 g·L-1时, 能量供应不足, 细胞骨架合成速率可能较低, 固碳过程中产生的有机物释放到胞外成为胞外游离有机碳.当Na2S2O3·5H2O浓度为30 g·L-1、50 g·L-1时, 盐度增加导致渗透压过高使细胞失活[15], 细胞骨架合成速率会受到抑制, 导致较高的胞外有机碳浓度和较低的总固碳量.
这些结果表明排硫硫杆菌自我产生的胞外游离有机碳会抑制其自养过程, 通过供给适当浓度的电子供体Na2S2O3·5H2O(5~15 g·L-1以内), 可以有效提高细胞骨架合成速率, 使CO2同化速率与细胞骨架合成速率相匹配, 将固碳产生的有机碳转变为细胞骨架, 从而削弱胞外游离有机碳对排硫硫杆菌自养过程的抑制作用, 增强其固碳能力.
3 结论(1) 排硫硫杆菌固碳能力随电子供体Na2S2O3·5H2O浓度的增加而增强(1~15 g·L-1范围内), Na2S2O3·5H2O浓度为15 g·L-1时固碳能力最强, 浓度继续增加会使固碳能力大幅下降.
(2) Na2S2O3·5H2O浓度对固碳关键酶基因cbb的转录效率和表达模式均无显著影响, 但能显著影响胞外游离有机碳在总有机碳中所占比EFOC/TOC.胞外游离有机碳对排硫硫杆菌的自养固碳过程有抑制阻遏作用, 通过提供充足的Na2S2O3·5H2O可以促进细胞骨架合成, 进而降低胞外游离有机碳所占比, 削弱胞外有机碳的抑制阻遏作用, 增强固碳能力.
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