环境科学  2017, Vol. 38 Issue (5): 2030-2035   PDF    
引用本文
徐伟超, 吴翠平, 张玉秀, 张琪, 张怡鸣. 喹啉降解菌Ochrobactrum sp.的好氧降解特性及其在焦化废水中的生物强化作用[J]. 环境科学, 2017, 38(5): 2030-2035.
XU Wei-chao, WU Cui-ping, ZHANG Yu-xiu, ZHANG Qi, ZHANG Yi-ming. Aerobic Degradation Characteristics of the Quinoline-Degrading strain Ochrobactrum sp. and Its Bioaugmentation in Coking Wastewater[J]. Environmental Science, 2017, 38(5): 2030-2035.
喹啉降解菌Ochrobactrum sp.的好氧降解特性及其在焦化废水中的生物强化作用
徐伟超 , 吴翠平 , 张玉秀 , 张琪 , 张怡鸣     
中国矿业大学 (北京) 化学与环境工程学院, 北京 100083
收稿日期: 2016-10-31; 修订日期: 2016-12-12
基金项目: 国家自然科学基金项目（31370281，U1632111）；中央高校基本科研业务费专项（2010YH05）；全国大学生创新训练计划项目（C201603062）
作者简介: 徐伟超 (1992~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为废水处理, E-mail:comeonaputo@163.com
通讯作者: 张玉秀, E-mail:zhangyuxiu@cumtb.edu.cn
摘要: 喹啉是焦化废水中的难降解有机物之一，以喹啉为唯一碳氮源从某焦化废水处理厂活性污泥中分离出1株喹啉降解菌KDQ3，16S rDNA序列分析表明KDQ3为Ochrobactrum sp.，其对喹啉降解的最适条件为37℃和初始pH 7.0~8.0，喹啉降解动力学符合Haldane模型.KDQ3能在10.4 mg·L-1 Cr（Ⅵ）存在时降解200 mg·L-1喹啉.此外，KDQ3能在实际好氧池焦化废水环境中降解喹啉和提高COD去除率，说明该菌具有生物强化焦化废水的应用潜力.
关键词: 焦化废水      苍白杆菌      喹啉      降解动力学      生物强化     
Aerobic Degradation Characteristics of the Quinoline-Degrading strain Ochrobactrum sp. and Its Bioaugmentation in Coking Wastewater
XU Wei-chao , WU Cui-ping , ZHANG Yu-xiu , ZHANG Qi , ZHANG Yi-ming     
School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology (Beijing), Beijing 100083, China
Abstract: Quinoline is one of the common refractory organic pollutants in coking wastewater. An aerobic bacterial strain KDQ3 capable of utilizing quinoline as the sole source of carbon, nitrogen and energy was isolated from activated sludge of a coking wastewater treatment plant. The morphological properties and the 16S rDNA sequence identified KDQ3 as Ochrobactrum sp.. The optimized temperature and initial pH for quinoline degradation were 37℃ and 7.0-8.0, and the degradation kinetics fit with Haldane's model. KDQ3 could degrade 200 mg·L-1 quinoline in the presence of 10.4 mg·L-1 hexavalent chromium. In addition, KDQ3 was able to degrade quinoline in real coking wastewater of aerobic tank and improve the removal of COD, indicating that KDQ3 had the potential of bioaugmentation for removal of quinoline from coking wastewater.
Key words: coking wastewater      Ochrobactrum sp.      quinoline      degradation kinetics      bioaugmentation     

焦化废水是煤高温干馏、煤气净化、副产品回收与精制过程中产生的一种有机废水，可生化性差，其中的难降解有机污染物主要有酚类化合物、氮杂环化合物和多环芳烃等[1].喹啉及其衍生物是焦化废水中主要的多环芳香含氮杂环化合物，其毒性大，致畸性和致癌性作用强[2~4]，因此，分离鉴定高效的喹啉降解菌对于生物法去除焦化废水中喹啉及其衍生物具有广泛的应用前景.

焦化废水的处理主要包括脱酚、蒸氨、脱氰、除油、生化处理、混凝沉淀和高级氧化等过程，其中生化处理是焦化废水处理的主体和核心[5].近年来，一些喹啉降解菌已从工业废水污泥、煤和页岩液化地等分离出来，如红球菌 (Rhodococcus sp.)[6]、从毛单胞菌 (Comamonas sp.)[7]、脱硫杆菌 (Thiobacillus sp.)[8]、皮氏伯克霍尔德菌 (Burkholderia pickettii)[9]和假单胞菌 (Pseudomonas sp.)[10]等. 1988年Holmes等[11]首次报道鉴定了Ochrobactrum anthropi，现有的研究表明Ochrobactrum sp.能降解苯酚[12]及菲、芘和荧蒽等多环芳烃[13, 14]，此外，还具有Cr和Pb[15]及As[16]等重金属耐性，且能将Cr (Ⅵ) 还原为Cr (Ⅲ)[17].另外，在焦化废水反硝化生物反应器中分离鉴定的2株Ochrobactrum sp.具有降解喹啉的作用[18]，但其喹啉降解特性和生物强化作用的研究尚未见报道.

焦化废水中含有Cu、Hg、Cr和Zn等重金属污染物[19]，喹啉降解菌在Cr (Ⅵ) 存在下的降解作用未见报道，研究重金属离子存在下细菌对喹啉的降解作用对于处理含有重金属和有机污染物的工业废水具有重要意义.本文以某焦化厂的活性污泥为菌源，以喹啉为唯一碳氮源和能源分离鉴定喹啉降解菌，研究其好氧降解特性，并考察其在实际焦化废水中的喹啉去除作用，以期为焦化废水和重金属-有机物复合污染废水的生物处理提供理论依据与菌源.

1 材料与方法 1.1 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基[20]，用于喹啉降解菌的富集培养和鉴定.

无机盐培养基 (MSM)[6]，每升溶液中含有Na2HPO4 4.26 g，KH2PO4 2.65 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，CaCl2 0.006 g和微量元素溶液 (Na2MoO4·2H2O 0.12 g·L-1，CaCl2·2H2O 2 g·L-1，MnSO4·H2O 0.2 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.1 g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.2 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.09 g·L-1，H3BO3 0.006 g·L-1)1 mL，pH为7.0.

1.2 菌株的富集、分离与鉴定

取某焦化厂好氧池活性污泥20 mL，接入含有100 mL富集培养基的三角瓶中，在37℃、150 r·min-1转速条件下培养1 d，沉淀10 min后，取2 mL上清液转接到含200 mg·L-1喹啉的无机盐培养基中培养2~3 d，按照5%的接种量转接到含300 mg·L-1喹啉的无机盐培养基中培养，逐步提高喹啉浓度，驯化培养喹啉降解菌.将驯化培养的菌液稀释均匀涂在含200 mg·L-1喹啉的无机盐平板培养基上，在37℃生化培养箱中培养3~4 d，挑取单个菌落纯化培养，进行菌株鉴定以及喹啉降解特性研究.

菌种鉴定用形态观察和16S rDNA序列分析方法.形态观察用透射电子显微镜 (JEM-1400，日本电子JEDL) 观察. 16S rDNA序列扩增用通用引物：27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，在NCBI数据库用BLAST程序比对分析.

1.3 环境条件对菌株喹啉降解的影响

将菌株接至含有200 mg·L-1喹啉的牛肉膏蛋白胨培养基中震荡培养 (37℃、150 r·min-1) 至对数期，在4℃下12000 r·min-1离心10 min收集菌体，无菌水洗涤2次，用无机盐培养基将菌株生物量 (D600) 调至1.5，得到活化的种子菌悬液.将活化的菌悬液以5%接种量接入含300 mg·L-1喹啉的无机盐培养基中，分别在不同温度 (23、28、32、37和42℃) 下振荡培养，24 h时取样测定菌株生物量及剩余喹啉浓度，确定最适降解温度.在最适温度下，24 h时测定不同初始pH值 (4、5、6、7、8、9、10和11) 条件下菌株的生物量和剩余喹啉浓度，确定最适生长和喹啉降解pH.在最佳培养条件下，测定不同初始喹啉浓度 (30、60、100、150、200、250、300、400、500和600 mg·L-1) 对菌株生长和喹啉降解速率的影响；根据喹啉浓度和生物量随时间的变化关系计算比降解速率，用Matlab软件按照底物抑制型Haldane方程进行拟合.

在200 mg·L-1喹啉的无机盐培养基中加入K2Cr2O7，使Cr (Ⅵ) 浓度分别为2.6、5.2、7.8和10.4 mg·L-1，在37℃下、150 r·min-1振荡培养，定时取样，测定菌株的生物量和剩余喹啉浓度.

1.4 菌株对实际焦化废水中喹啉的降解作用

将取自某焦化废水处理厂的曝气池进水 (CW) 用双层滤膜过滤后，用二沉池污泥 (S) 将MLSS调至约4%，将活化的菌悬液以5%接种量接入含有150 mL焦化废水中的三角瓶中，在37℃下进行摇瓶实验，分析焦化废水中的喹啉、苯酚和COD的去除率.

1.5 分析方法

细菌生物量用可见光分光光度计在600 nm下测定的光密度 (D600) 表示[6]，喹啉浓度用紫外光分光光度计在313 nm波长下测定[21]，苯酚浓度测定用4-氨基安替比林法[22]. COD浓度测定用快速消解分光光度法[23].

2 结果与讨论 2.1 KDQ3菌株的分离和鉴定

某焦化废水处理厂活性污泥中的微生物菌群经富集、分离和驯化后，得到1株喹啉降解菌，命名为KDQ3，其在24 h内可将300 mg·L-1喹啉降解93.6%.在牛肉膏平板培养基上，KDQ3菌落为圆形，边缘光滑圆润，淡黄色，质地湿润.透射电子显微镜表明KDQ3菌为杆菌，有鞭毛 (图 1). BLAST比较分析显示KDQ3菌株与NCBI数据库中的Ochrobactrum sp.的同源性达到98%，表明该菌属于Ochrobactrum sp.(GenBank注册号：KY681806).

图 1 KDQ3菌株的透射电子显微镜图 Fig. 1 Transmission electron micrograph of KDQ3 strain

2.2 环境因素对KDQ3菌株生长和喹啉降解的影响

温度影响细胞膜的流动性和物质的溶解，也影响细胞生长和酶促反应速率. 图 2结果表明在23℃下，KDQ3的生物量D600和喹啉降解率 (24 h) 分别为0.15和12.4%，D600和喹啉降解率随温度升高而增大，37℃时均达到最大值；然后，其又随着温度的继续升高而急剧下降，当温度达到42℃时，D600几乎没有增加，KDQ3死亡，喹啉也没有降解.说明在23℃下细菌生长缓慢，喹啉降解能力减弱；而在42℃下，可能是由于高温引起蛋白质变性，致使细菌死亡，喹啉降解能力丧失.从焦化废水活性污泥中分离的Acidovorax sp. DQS-01的最适温度为35℃[24]，Rhodococcus sp. QL2最适温度为37℃[6]，而Pseudomonas sp. BW003[25]和BW004均为30℃[26].因此，在实际污水处理中，好氧池的温度应保持在30~37℃，以提高菌株的喹啉降解效率.

图 2 温度和pH对KDQ3菌株生长和喹啉降解的影响 Fig. 2 Effects of temperature and pH on the growth and quinoline degradation of KDQ3

pH影响微生物对营养物质的吸收和代谢过程. 图 2结果表明D600与喹啉降解率成正相关，在初始pH 7~8时，KDQ3菌株生长最快，生物活性最高，24 h时喹啉的降解率高达91.8%，说明KDQ3降解喹啉的最适初始pH为7~8. Acidovorax sp. DQS-01降解喹啉的最适pH为8~10[24]，Rhodococcus sp. QL2的最适pH为8~9[6]，Pseudomonas putida WS-5降解喹啉的最适pH为9[27]，而Pseudomonas sp. BW003和BW004的最适pH为7~8[25, 26].说明喹啉降解菌的最适pH为7~10，碱性环境可中和喹啉降解产生的酸性产物，促进微生物的代谢过程，增强微生物对喹啉的降解利用.同时，焦化废水中存在大量的氨氮，蒸氨后废水的pH约8~9，呈弱碱性，所以KDQ3可用于强化焦化废水的生物处理过程.

2.3 KDQ3降解动力学

在最佳的温度和pH条件下，分析KDQ3降解喹啉的动力学. 图 3结果表明在23.73~492.27 mg·L-1喹啉浓度范围内，初始喹啉浓度越高，KDQ3生长的适应期越长，喹啉对菌株生长的抑制作用越大，喹啉完全降解需要的时间也越长；当喹啉浓度达579.29 mg·L-1时，KDQ3的D600在48 h内不增反降，喹啉浓度降低甚微，表明高浓度喹啉具有抑制KDQ3生长和喹啉降解的作用.

图 3 不同喹啉浓度对KDQ3菌株生物量和喹啉降解率的影响 Fig. 3 Effects of quinoline concentrations on biomass and quinoline degradation of KDQ3

根据KDQ3降解喹啉的比降解速率与底物浓度的实验数据，通过Matlab软件按照Haldane方程对比降解速率进行非线性最小二乘曲线拟合，拟合的喹啉降解动力学曲线和实验数据结果如图 4，得出KDQ3降解喹啉的动力学参数为：qmax=0.18 h-1、Ks=16. 6 mg·L-1和Ki=241.7 mg·L-1. Ks为半饱和常数，Ki为抑制系数，Ki值越高，底物对微生物毒性越低，而微生物对底物的耐受性越高. Acidovorax sp. DQS-01降解喹啉的动力学参数为qmax=0.64 h-1、Ks=164 mg·L-1和Ki=253 mg·L-1[24], Rhodococcus sp. QL2降解喹啉的动力学参数为qmax=0.49 h-1、Ks=68.7 mg·L-1和Ki=387.1 mg·L-1[6]，Burkholderia pickettii降解喹啉的动力学参数为qmax=0.44 h-1、Ks=166.7 mg·L-1和Ki=650 mg·L-1[9]；与之相比，KDQ3的最大比降解速率 (0.18 h-1) 和抑制系数 (241.7 mg·L-1) 均较小，然而，在好氧池中喹啉浓度一般在50~150 mg·L-1，远低于抑制系数Ki，所以，KDQ3作为活性污泥微生物菌群中的一员可能在降解喹啉过程中发挥了重要作用.

图 4 实验数据与回归曲线 Fig. 4 Measured values and regression curve

2.4 KDQ3在Cr (Ⅵ) 存在时的喹啉降解作用

焦化废水中含有重金属Cr污染物[19]，在2.6、5.2、7.8或10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 浓度下，以200 mg·L-1喹啉为唯一碳氮源，分析Cr (Ⅵ) 对喹啉的降解作用.结果表明在接种48 h内， KDQ3的生物量随时间的增加而增加，喹啉降解率的变化趋势与生物量一致 (图 5)；48 h时KDQ3的生物量达到最大值 (0.26~0.31)，喹啉降解率也达到最大值 (88.1%~92.7%)，表明喹啉的降解是由于KDQ3的生长所致.在细菌的快速生长阶段 (16~48 h)，KDQ3的生物量随着Cr (Ⅵ) 浓度升高而降低，24 h差异较大；同样，喹啉降解率也随着Cr (Ⅵ) 浓度升高而降低，24 h差异较大，表明Cr (Ⅵ) 具有抑制KDQ3生长和喹啉降解的作用.虽然10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 对KDQ3生长具有一定的抑制作用，但在其稳定生长期，喹啉的降解率也能达到88.1%，表明KDQ3在2.6~10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 存在下能有效地降解喹啉.水体中的Cr (Ⅵ) 多溶于水中，而Cr (Ⅲ) 可吸附在固体物质上而存在于沉积物 (底泥) 中，Cr (Ⅵ) 对微生物的毒性远高于Cr (Ⅲ)[28].皮革厂污水是重金属和有机物复合污染废水，Sultan等[17]从皮革厂污水中分离的Ochrobactrum intermedium STCr-5能高效还原100~1 000 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，在72 h内其能完全还原200 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，96 h对1000 mg·L-1Cr (Ⅵ) 的还原率为50%.从制革废水中分离的Ochrobactrum intermedium CrT-1在24 h对100、500和1 000 mg·L-1的Cr (Ⅵ) 的还原率分别达82%、28%和16%[29].从铬污染填埋场分离的Ochrobactrum sp. CSCr-3能高效还原100~800 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，在30 h内能将282.7 mg·L-1的Cr (Ⅵ) 还原90%[30]，表明Ochrobactrum sp.具有较高的Cr (Ⅵ) 耐受和还原能力.同时，由于Ochrobactrum sp.具有广谱的有机物利用范围，可降解苯酚、菲、芘、荧蒽、甲基对硫磷和硝基酚等多种难降解有机物[12~14].本研究首次报道KDQ3具有在Cr (Ⅵ) 存在下的降解喹啉能力.所以Ochrobactrum sp.可能在制革和焦化企业产生的重金属-有机物复合污染的工业废水处理领域拥有潜在的应用前景.

图 5 Cr (Ⅵ) 浓度对KDQ3生长和喹啉降解的影响 Fig. 5 Effects of Cr (Ⅵ) concentrations on the growth and quinoline degradation of KDQ3

2.5 KDQ3在实际焦化废水中的降解作用

某焦化废水处理厂曝气池进水的COD为650~750 mg·L-1、苯酚为50~150 mg·L-1和喹啉为80~120 mg·L-1，pH 7~8. 图 6结果表明在未接种的对照焦化废水 (CW+S) 中，喹啉浓度在12~24 h有上升趋势，而在接种KDQ3的焦化废水 (CW+S+KDQ3) 中，喹啉浓度在18 h开始下降，24 h时喹啉降解率达23.3%.活性污泥中含有苯酚降解菌，对照和接种焦化废水中的苯酚均在12 h内迅速降解，然后稳定在71 mg·L-1. COD分析表明在16 h内对照与接种焦化废水的COD均呈下降趋势，对照和接种的COD去除率 (分别为20.7%和25.9%) 相似，这可能是由于苯酚降解导致COD降低所致；16 h后苯酚不再降解，对照的COD也停止下降，而接种的COD由于喹啉的开始降解而降低；在24 h时接种的COD去除率达到31.4%，高于对照的COD去除率 (20.9%).表明KDQ3能在含有高浓度酚类和难降解有机物的焦化废水中降解喹啉，且能与污泥中微生物协同作用降低COD，表明KDQ3具有生物强化处理焦化废水的潜力.

图 6 KDQ3对焦化废水中喹啉、苯酚和COD的去除 Fig. 6 Removal of quinoline, phenol and COD from coking wastewater by strain KDQ3

3 结论

(1) 经富集驯化培养从某焦化废水处理厂好氧池污泥中筛选出1株喹啉降解菌Ochrobactrum sp. KDQ3，其降解喹啉的最适条件为37℃和pH 7.0~8.0；喹啉降解动力学符合Haldane方程，动力学参数为：qmax=0.179 h-1、Ks=16. 6 mg·L-1和Ki=241.7 mg·L-1.

(2) KDQ3能在10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 存在下降解200 mg·L-1喹啉，并能在实际焦化废水中降解喹啉和去除COD，所以，KDQ3具有焦化废水生物强化的应用潜力.

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喹啉降解菌Ochrobactrum sp.的好氧降解特性及其在焦化废水中的生物强化作用
徐伟超 , 吴翠平 , 张玉秀 , 张琪 , 张怡鸣