2017, Vol. 38
壬基酚(nonylphenol，NP)是一种持久性有机污染物，属于典型的酚类内分泌干扰物，具有毒性，难降解性，生物累积性和雌激素活性[1, 2]. NP是壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)较为稳定的降解产物之一，后者是目前全球广泛应用的一类非离子表面活性剂[3]. 每年约有50万t的NPEOs通过生活与工业废水的排放、 污泥处置、 农田灌溉和施肥进入到环境中，它们经过微生物降解，生成了比母体毒性更大、 疏水性更强、 更难生物降解的NP[4, 5]. 因此，修复NP污染的环境介质已成为环境工作者关注的热点问题.
微生物降解在NP等毒害性有机物污染环境修复中一直扮演着重要的角色，是该类污染环境的一个重要修复手段. Tanghe等[6]于1999年分离到1株可以降解具有支链烷烃结构NP的细菌Sphingomonas sp.，此后相继有人发现能够降解NP的细菌[7~9]. 董涵等[10]从污染严重的李村河口底泥中分离到1株能降解NP的真菌菌株Trichoderma asperellum，一定环境条件下其对5 mg·L-1 NP的降解率达到了71.4%； 郭玥等[11]在活性污泥中筛选出了1株能降解NP的菌株Serratia sp. LJ，该菌株在以NP为唯一碳源的无机盐培养基中，能够使NP得到较为迅速的降解. 在NP浓度为10~150 mg·L-1，温度为30℃的条件下，菌株对NP的降解遵循一级动力学方程.
微生物对污染物的降解作用可受多种因素影响，如共代谢底物、 有毒物质等[12, 13]. 其中，重金属由于具有生物毒性，可影响微生物菌株生长繁殖能力，进而影响污染物的降解作用[14]. 目前，已有学者开展了重金属对有机污染物生物降解影响的研究[15, 16]，而关于重金属对NP生物降解影响的研究报道还较少. 本研究选取1株课题组前期工作中分离得到的NP好氧降解菌——铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为实验菌株，考察Cd2+存在时菌株吸附/降解NP的效果. 对其胞内酶进行提取，分析了不同浓度Cd2+对菌和酶降解的动力学影响，以期为重金属共存下NP类污染物的微生物修复提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验试剂与材料 1.1.1 实验试剂NP(纯度98%)、 HPLC级甲醇购于Sigma Aldrich公司； 储备液：用色谱纯甲醇溶解，配制成1 000 mg·L-1的储备液，4℃保存待用. 牛肉膏、 蛋白胨、 NaCl、 Cd(NO3)2等购自上海化学试剂厂，均为AR级. 1 000 mg·L-1Cd2+母液由Cd(NO3)2溶于高纯水得到.
1.1.2 菌株与培养基菌株：由本课题团队从受重金属-有机物复合污染严重的苏州市原江苏化工农药集团地块土壤中筛选得到，经16S rDNA序列比对，鉴定为铜绿假单胞菌，菌株编号为SH1. 预实验结果表明，在降解48 h，菌浓度为1 g·L-1，pH为7.0且初始NP浓度小于10 mg·L-1时，降解率在50% 左右，表明其对NP有较好的降解效果.
营养培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g蒸馏水1 000 mL，pH值为7.2~7.4.
无机盐培养基(MSM)：1 g NH4NO3，1.5 g KH2PO4，3 g K2HPO4溶于1 000 mL去离子双蒸水.
所有培养基分装后在121℃下灭菌30 min.
1.2 实验方法 1.2.1 菌株培养接种P. aeruginosa SH1于培养液中，于30℃，150 r·min-1摇床中振荡培养24 h. 取菌液按1%体积比接种于新鲜培养液中，在上述条件下培养24 h，6 000 r·min-1离心10 min获取菌体，用0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 7.3)清洗菌体3次，备用.
1.2.2 Cd浓度测定把处理体系转入离心管，于6 000 r·min-1离心10 min，取上清液测定Cd含量. Cd浓度利用火焰原子吸收分析仪进行分析.
1.2.3 NP的萃取与检测采用超声波辅助萃取法对体系中的NP进行提取. 具体步骤如下：用5 mol·L-1的HCl调节培养液pH为2.0，加入等体积的乙酸乙酯，超声萃取2次，移出有机相，过无水硫酸钠脱水，后经旋转蒸发器40℃蒸发至干. 再加入10 mL色谱级乙醇，置于漩涡振荡器上振荡60 s，将振荡后的溶液转移至色谱进样瓶. 样品采用GC-MS检测，色谱和质谱条件参照文献[17]的方法，由于样品浓度较低，进样时不进行分流处理.
1.2.4 Cd2+和NP对P. aeruginosa SH1生长的影响分别向含有1 mg·L-1、 10 mg·L-1 Cd2+和1、 10、 100 mg·L-1 NP的40 mL营养液体培养基中接入1%处于对数生长期的菌悬液. 置于30℃，150 r·min-1摇床培养，每间隔一定时间分别测定菌液的D600浓度，绘制生长曲线. 以不加污染物的营养液体系作为空白对照.
1.2.5 Cd2+对P. aeruginosa SH1吸附NP的影响(1) 活菌对NP的吸附
于pH 7.0的MSM培养基中，加入一定量菌悬液，使降解体系最终体积为20 mL，投菌量为1 g·L-1. 再向体系中加入一定量的NP和Cd(NO3)2溶液，使体系中NP浓度分别为10 mg·L-1，Cd2+浓度分别为0.5、 1、 5、 10 mg·L-1，(30±1)℃下置于150 r·min-1恒温摇床中，于8 h取样，置于玻璃离心管中4 000 r·min-1离心，取上清液分析NP含量.
(2) 戊二醛固定后P. aeruginosa SH1对NP的吸附
取菌体配制成菌液，用最终浓度为2.5% 的戊二醛固定24 h 后，用双蒸水清洗至pH中性. 吸附实验同(1)所述.
1.2.6 Cd2+对P. aeruginosa SH1降解NP的影响向含10.0 mg·L-1 NP、 pH值为7.0的MSM体系中，加入一定量的菌悬液，使降解体系最终体积为20 mL，投菌量为1 g·L-1. 再向体系中加入一定量的Cd(NO3)2溶液，使体系中Cd2+浓度分别为0.5、 1、 5、 10 mg·L-1，于(30±1)℃下反应，测定Cd2+浓度对降解反应速率的影响.
1.2.7 Cd2+对P. aeruginosa SH1胞内酶降解NP的影响取对数生长期的P. aeruginosa SH1用0.05 mol·L-1、 pH 7.2 的磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次后，加入一定量的PBS重悬，置于0℃的冰-水混合水浴中，用超声波细胞粉碎机(450 W)破碎处理150次，每次3 s，间隔3 s，4℃ 下8 000 r·min-1离心10 min，取上清液，得胞内粗酶液. 粗酶液中蛋白含量以牛血清蛋白作为标准蛋白采用Bradford法检测[18].
向含10.0 mg·L-1 NP、 pH值为7.0的MSM体系中，加入一定量的胞内粗酶液，使降解体系最终体积为20 mL. 再向体系中加入一定量的Cd(NO3)2溶液，使体系中Cd2+浓度分别为0.5、 1、 5、 10 mg·L-1，于(30±1)℃下反应，测定Cd2+浓度对降解反应速率的影响.
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图 1 NP和Cd2+对P. aeruginosa SH1生长的影响 Fig. 1 Effect of different concentrations of NP and Cd2+ on the growth of P. aeruginosa SH1 |
P. aeruginosa SH1在未添加污染物与NP和Cd2+抑制下的生长曲线如图 1所示. 菌SH1在营养培养基中的生长曲线规律表现为：0~6 h为停滞期，6~18 h为对数生长期，18 h后进入稳定期，36 h后步入衰亡期. 与正常生长曲线相比，污染物的加入对菌株的生长有一定程度的影响. 主要表现为：当培养基中添加100 mg·L-1 NP时，菌株生长的停滞期由0~6 h延长至0~12 h，对数期、 稳定期顺序后延，对数生长期为12~36 h，36 h后进入稳定期，但是总体生物量与正常生长时相比只是有较小的降低(8.2%). 当培养基中添加Cd2+时，P. aeruginosa SH1的生物量随着Cd2+浓度的增大有明显的降低，10 mg·L-1 Cd2+存在时SH1在24 h的生物量下降27.1%，但这一影响小于其它研究中Cd2+对微生物生长的影响. Hong等[19]的研究结果表明，10 mg·L-1 Cd2+对S. wittichii RW1的生长有抑制作用，生物量下降50%以上. 这说明P. aeruginosa SH1能在较高浓度NP和Cd2+存在下生长，主要原因是本实验使用的SH1来源于污染严重的化工农药生产企业搬迁地，因此对NP和Cd有一定的耐受性.
2.2 Cd2+对P. aeruginosa SH1吸附NP的影响吸附是微生物与水体中污染物接触的第一步，也是微生物降解有机污染物的重要过程[20, 21]. 本文研究了不同浓度Cd2+存在下活菌与失活菌对NP的吸附效果，结果如图 2所示. 结果表明，P. aeruginosa SH1对于NP有较好的吸附效果，8 h时吸附率达到了69.7%. 活菌的吸附效果要远远好于失活菌，这说明菌体对于NP的吸附依赖于菌体活性. 有研究表明，生物吸附机制可分为代谢依赖型和非代谢依赖型[22]，P. aeruginosa SH1对于NP的吸附属于前者. Cd2+的加入对于菌体吸附NP有较大的影响. 对于活菌而言，低浓度的Cd2+(0.5 mg·L-1)能够促进P. aeruginosa SH1吸附NP. 这可能是由于Cd2+的加入能改变细胞表面的疏水性，从而增强菌体对于有机物的吸附[23]. 高浓度Cd2+(≥5 mg·L-1)的加入抑制菌体对NP的吸附. 主要原因是高浓度的Cd2+对于菌体有毒性作用，通过影响菌体的代谢而影响其对NP的吸附效果. 对于失活菌体而言，低浓度的Cd2+的加入对于P. aeruginosa SH1吸附NP无显著性影响，而高浓度的Cd2+促进菌体对NP的吸附. 这可能是因为Cd2+在P. aeruginosa SH1和NP之间起到了架桥作用[24]. 本课题组前期的研究结果表明，P. aeruginosa SH1对于Cd2+有较好的吸附效果，且失活菌体的吸附效果明显优于活菌. 当体系中同时存在Cd2+和NP时，失活菌体能有效大量地吸附Cd2+，从而改变菌体表面的化学特性，增强其吸附NP的能力. 高浓度Cd2+对于活菌吸附NP的影响结果同样可以佐证上述结论. Cd2+对P. aeruginosa SH1生长的影响实验表明，10 mg·L-1 的Cd2+存在时P. aeruginosa SH1生物量下降27.1%，而其吸附率仅下降17.6%. 这说明Cd2+的加入对于菌体的活性影响要大于其对吸附的影响，原因可能是Cd2+的加入在降低菌体活性的同样增加了菌体对于NP的吸附方式，从而减轻了由于活性造成吸附效果下降的影响.
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图 2 Cd2+对菌体吸附NP的影响 Fig. 2 Adsorption of NP by P. aeruginosa SH1 at different concentrations of Cd2+ |
微生物降解有机污染物的实质是其分泌的降解酶对污染物的催化作用，根据酶分泌的部位不同，可将其分为胞内酶降解和胞外酶降解[25, 26]. 本课题组前期的实验结果显示，P. aeruginosa SH1对NP有较好的降解能力，而起主要降解作用的酶属于胞内酶. 因此本实验考察Cd2+对P. aeruginosa SH1和胞内酶降解NP的影响.
图 3(a)和3(b)分别表示P. aeruginosa SH1和其胞内酶对NP降解随时间的变化趋势. 从中可以看出，胞内酶的降解速率要远远大于菌体. 降解初期，P. aeruginosa SH1几乎对NP没有降解作用，而胞内酶在12 h内对NP的降解率已经趋于稳定. 此外，当降解效果趋于平稳时(菌体系60 h，酶体系12 h)，胞内酶的降解率(79.9%)大于菌体(65.1%). 菌体降解NP初期，菌体将NP吸附在细胞表面，然后才能通过跨膜运输等过程进入到菌体内部被胞内酶降解，这一过程相较酶降解而言具有一定的阻碍作用，所以离体情况下的酶促反应速率更快、 反应时间更短，最终造成菌体对污染物的降解率低于胞内酶.
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(a) 84 h内P. aeruginosa SH1对NP的降解； (b)36 h内胞内酶对NP的降解；(c)不同浓度Cd2+对P. aeruginosa SH1和其胞内酶降解NP的影响 图 3 不同条件下NP的降解 Fig. 3 Degradation efficiency of NP under different conditions |
图 3(c)表示不同浓度的Cd2+分别对菌体和胞内酶降解NP的影响. 从中可知，不同浓度的Cd2+对菌体和胞内酶降解NP有着不同的影响结果. 低浓度的Cd2+(0.5 mg·L-1)对菌体降解NP有一定的促进作用(P＜0.05). 造成这一结果可能有以下三方面的原因：① 某些重金属离子(例如Cd2+)，当其浓度较低时有利于菌体的生长活性，特别是对于那些长期生长在重金属含量较高的环境中的菌体，从而能够增强菌体降解有机污染物的能力； ②低浓度的Cd2+有助于菌体降解NP功能酶的合成分泌； ③重金属的存在改变了菌体细胞表面的某些性质，使得微生物更容易与水溶性较低的有机污染物接触从而提高有机物的利用率[27]. 当体系中存在高浓度的Cd2+(≥5 mg·L-1)时，菌体对NP的降解受到抑制. 这主要是由于高浓度的Cd2+对菌体的毒害作用导致活性降低，进而造成对NP的降解能力变弱.
从图 3(c)中还可以看出，高浓度Cd2+对胞内酶降解NP的影响趋势与对菌体的相同，但胞内酶受到的抑制作用更为显著. 这主要是因为胞内酶与Cd2+直接接触造成的. 当菌体生长在含有高浓度Cd2+的环境中时，其可以通过自身调节而对外界污染物的毒害有一定自我保护，因此受到的危害相对较小，对NP降解的抑制也较小[28]. 与菌体细胞不同，当胞内酶降解体系中存在低浓度Cd2+时，NP的降解率变化不显著. 原因可能是低浓度Cd2+的加入并未改变降解NP功能酶的活性，而对菌体产生的促进作用仅仅是因为改变了菌体自身的性质.
2.4 Cd2+对P. aeruginosa SH1和胞内酶降解NP的动力学影响分别排除P. aeruginosa SH1和其胞内酶在5 d和12 h后对NP降解能力稳定的情况，用一级动力学模型lnc0/c=a+kt进行了降解动力学分析. 式中，c0为NP初始浓度，c为尚未反应的NP浓度，t为降解时间，k为一级反应速率常数. a为t=0时刻去除的反应物浓度，半衰期t1/2=(ln2-a)/k. 动力学分析结果如图 4所示. 从图 4(a)可以看出，菌体降解NP时，第12 h的降解速率几乎为零. 因此在对菌体降解NP进行动力学拟合时，应当排除这一延滞期，即将培养12 h后的降解体系看做是初始态. 表 1显示了P. aeruginosa SH1和其胞内酶降解NP的动力学参数的计算结果. 从中可知，胞内酶降解NP较好地符合一级反应动力学(R2=0.996)，而菌体降解NP则不能很好地通过一级动力学模型进行拟合. 造成这一结果的主要原因是菌体降解NP是一个较为复杂的过程，在降解初期，菌体将NP吸附在表面，然后才能通过细胞膜进入到菌体内部被胞内酶降解，因此菌体对NP的降解不仅仅与底物和酶浓度有关，还与其对NP的吸附和跨膜运输等能力有关，这就使得菌体降解NP不能很好地符合一级动力学模型. 从表 1还可以看出，Cd2+的加入对NP的降解有一定的影响. 高浓度的Cd2+抑制了酶的活性，从而使其降解速率下降较多. 而低浓度的Cd2+对降解NP的速率影响不太显著. 对于菌降解体系而言，低浓度Cd2+的加入对降解速率有一定的促进作用，但是由于菌体降解周期较长，这一促进作用并未能在速率常数上较明显地体现，但是从半衰期上可以充分地看到低浓度Cd2+的加入对降解速率有所提高.
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图 4 一级反应动力学线性拟合 Fig. 4 First-order rate relationship between ln[NP] and time |
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表 1 降解动力学参数 Table 1 Kinetic parameters of NP degradation |
3 结论
(1) P. aeruginosa SH1的生物量随着Cd2+浓度的增大有明显的降低，10 mg·L-1 Cd2+存在时菌株在24 h的生物量下降27.1%. 100 mg·L-1NP的加入会影响菌株生长周期，使其停滞期延长，但总体生物量降低仅8.2%.
(2) P. aeruginosa SH1对于NP有较好的吸附效果，8 h时吸附率达到69.7%. Cd2+的加入对于菌体吸附NP有较大影响. 对于活菌，低浓度Cd2+能够促进NP吸附，而高浓度Cd2+的加入抑制菌体对NP吸附. 对于失活菌体，低浓度的Cd2+的加入对于吸附无显著性影响，而高浓度的Cd2+能够促进菌体对NP的吸附.
(3) 胞内酶的降解速率要远远大于菌体. 不同浓度的Cd2+对菌体和胞内酶降解NP有着不同的影响结果. 低浓度的Cd2+对菌体降解NP有一定的促进作用. 当体系中存在高浓度的Cd2+时，菌体对NP的降解受到抑制. 高浓度Cd2+对胞内酶降解NP的影响趋势与对菌体的相似，但其受到的抑制作用更为显著. 与菌体细胞不同，当胞内酶降解体系中存在低浓度Cd2+时，NP的降解率变化不显著. 胞内酶对NP的降解过程符合一级动力学反应模型，Cd2+浓度为0.5 mg·L-1时降解速率最快，半衰期为5.5 h，而菌体降解NP则不能很好地通过一级动力学模型进行拟合.
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