2016, Vol. 37
土壤微生物是土壤与植物的纽带，对土壤的形成和发育起着重要的作用，能够分解土壤中的有机质、矿物质，并释放出营养元素，供给植物利用，最终形成腐殖质，提高土壤的质量.土壤微生物还参与土壤中碳、氮循环，对于全球气候变化以及碳氮循环有着不容忽视的影响[1, 2].总之，土壤微生物在土壤的物质和能量的输入与输出中扮演重要角色，是物质循环生态链上的重要环节，具有不可替代的作用.由于土壤微生物的复杂性和固有特性，土壤微生物的研究工作十分艰巨，迄今为止仍在不断地发展和完善中.土壤中可培养微生物仅占到土壤整个微生物群落的1%~10%，传统的分离培养方法仅限于对环境中极少部分可培养微生物类群的研究，不能准确全面地反映土壤微生物多样性特征[3].随着生物化学和分子生物学地不断发展，研究土壤微生物多样性的手段也在不断地更新，从早期的微生物纯培养，土壤酶活、微生物量以及基础呼吸的测定到BIOLOG生理代谢图谱分析，磷脂脂肪酸生物标记以及分子生物学(核酸提取、 PCR特异性扩增和核酸探针)检测等，可以越来越准确全面地提供土壤中微生物的相关信息.高通量测序技术作为二代测序方法，无需构建克隆，耗时少，通量高，能够准确全面地反映土壤微生物群落分布特征[4]，目前已经被广泛用于陆地生态系统土壤微生物多样性研究[5~9].
黄土高原是中国乃至世界重大的侵蚀区，植被破坏严重，土壤肥力下降，生态系统稳定性低，已经对于人类的生存和发展产生了重要的影响.基于此，近年来开展了大规模的植树造林、退耕还林还草生态工程，土壤肥力和植被覆盖度得到了有效地改善[10]，而土壤微生物在这过程起着重要的作用.土壤微生物是土壤有机组分和生态系统中最活跃的部分，在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用，被认为是最敏感的土壤质量生物学指标.因此应用土壤微生物可以很好地表征土壤质量对植被恢复的响应.目前，在黄土高原关于植被恢复中土壤微生物的研究主要采用的是传统的分离培养法[11]、磷脂脂肪酸法[12, 13]和PCR-RFLP方法[14]，对于不同植被类型土壤中的微生物群落组成和多样性特征了解上不够全面真实.因此，本文选取黄土高原森林植被与草原植被区的土壤为研究对象，采用454焦磷酸高通量测序方法，分析其土壤微生物细菌多样性，探讨植被恢复对土壤微生物多样性的影响，以期为黄土高原植被恢复和生态系统构建提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况黄土高原森林植被区以处于黄土丘陵区腹地、跨陕西、甘肃两省的子午岭为代表.子午岭林区是目前保存较好的黄土丘陵区中部地带重要的次生原始森林天然植被区.子午岭地理坐标为107°30′~109°40′ E，33°50′~36°50′ N.地势南高北低，自西向东北倾斜，海拔为1 300~1 700 m，相对高差400 m，处于森林草原和半干旱草原的过渡区，气候温和湿润，其北小半部属陇中北部温带半干旱气候，南大半部属陇中南部温带半湿润气候，年平均气温为7.4~8.5℃，极端最低温度为-27.7℃，极端最高气温为36.7℃，≥10℃的活动积温2671.0℃，无霜期110~150 d，平均降水量548.3 mm，干燥度0.97，平均相对湿度63%~68%，地带性土壤以石灰性灰褐土为主.主要优势物种辽东栎(Quercus liaotungensis)、山杨(Populus davidiana)、侧柏(Biota orientalis)、油松(Pinus tabuliformis)、刺槐(Robinia pseucdoacacia)、白桦(Betula platyphylla)等.
草原植被区位于陕西省安塞县镰刀湾，属典型的大陆性半干旱季风气候，夏秋多雨，冬季干寒.年日照时数2 415.5 h，辐射总量480.06 kJ ·cm-2，无霜期160~180 d，平均气温10.3℃，≥10℃活动积温3 177.4℃，多年平均降水量499.2 mm.土壤类型以黄绵土为主，约占总面积的95%，在黄土母质上发育的黄绵土，土壤瘠薄，保水保肥和抗侵蚀性差，有机质含量低，其有机质含量一般不足1％.主要优势物种有长芒草(Stipa bungeana)、铁杆蒿(Artemisia vestita)、猪毛蒿(Artemisia scoparia)、阿尔泰狗娃花(Heteropappu saltaicus)、达乌里胡枝子(Lespedeza davurica)等.
1.2 样品采集2013年8月分别在草原植被区与森林植被区选择四种典型的优势物种为研究对象.样地基本信息见表 1.每种植被群落，都选择不同位置的3块样地作为野外重复，在各个样地内设置3个20 m×20 m的样方，在每一个样方内用直径5 cm的土钻按S形布点法选5个采样点，在每个点采集0~5 cm的土样，混匀后作为1个样方的土样.土壤采集后挑出石块、根系等杂物，分成3份，一份立即放入-80℃的冰箱里保存用于DNA的提取，一份存储于4℃冰箱中，用于测定土壤的微生物量碳，另一份风干过筛用于测定土壤的基本性质(pH、总氮、总磷).
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表 1 不同植被类型下土壤样地的基本信息 Table 1 Description of sampling sites under different vegetation types |
1.3 土壤基本特性分析
土壤有机质、全氮、总磷、含水率、 pH均按标准方法进行测定[15].土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸0.5 mol ·L-1 K2SO4浸提法[16, 17].其中浸提液中的溶解性碳(DOC)采用总有机碳分析仪(Phoenix 8000，美国)测定，由熏蒸与未熏蒸土样的DOC差值计算得到微生物生物量碳(MBC)，转换系数为0.45[18].所有指标每份土样测定3个平行.
1.4 土壤DNA的提取土壤样品DNA提取后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA.按指定测序区域(V1~V3)，合成带有“5′454 A、 B接头-特异引物3′”的融合引物[19].为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足以下两个条件： ①尽可能使用低循环数扩增；②保证每个样品扩增的循环数一致.随机选取具有代表性的样品进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样品能够扩增出浓度合适的产物. PCR采用TransGen AP221-02： TransStartFastpfu DNA Polymerase；PCR仪： ABI GeneAmp 9700型；全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测.参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合.最后用Roche GS FLX+Sequencing Method Manual_XLR70 kit进行上机测序.
1.5 数据处理 1.5.1 基本数据处理所有数据经过Excel 2013处理，利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较，各个指标之间采用Pearson相关系数法进行相关性分析.土壤因子与细菌种群分布特征之间的关系利用Canoco 5.0进行冗余分析(RDA)，研究土壤性质对细菌分布特征的影响.
1.5.2 测序数据的分析与处理首先对有效序列进行去杂和修剪得到优化数据，使用软件Qiime(vsesion 1.17 http://qiime.org/)对数据去杂[20].通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU(operational taxonomic units).可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析.软件平台： Usearch(vsesion 7.1，http://drive5.com/uparse/).采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平： phylum(门)、 class(纲)、 order(目)统计各样本的群落组成.比对数据库： Silva(Release119，http://www.arb-silva.de)；RDP(Release 11.1，http://rdp.cme.msu.edu/)；Greengene(Release 13.5，http://greengenes.secondgenome.com/).基于OUT基础上计算微生物群落的丰度和多样性指数(Chao、 Ace、 Simpson、 Shannon、 Coverage).
对OTU列表中获得的分类信息与丰度进行整理，在门与纲分类水平下对各样品进行物种丰度统计、 RDA分析，可得到样品中群落组成结构以及群落结构与环境因子的关系.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质不同植被区土壤的基本理化性质见表 2.森林植被区与草原植被区土壤均为弱碱性，草原植被区土壤碱性更强，草原植被土壤pH显著高于森林植被土壤(P < 0.05).土壤有机质在草原植被区的变化范围为7.78~12.18 g ·kg-1，均值为9.36 g ·kg-1；在森林植被区的变化范围为18.34~44.77 g ·kg-1，均值为34.82g ·kg-1.土壤全氮在草原植被区的变化范围为0.42~0.88 g ·kg-1，均值为0.61 g ·kg-1；在森林植被区的变化范围为1.13~2.55 g ·kg-1，均值为1.81 g ·kg-1.土壤全磷在草原植被区变化范围为0.35~0.53 g ·kg-1，均值为0.49 g ·kg-1；在森林植被区变化范围为0.51~0.62 g ·kg-1，均值为0.55 g ·kg-1.土壤微生物生物量碳在草原植被区变化范围为83.02~257.38mg ·kg-1，均值为185.30 mg ·kg-1；在森林植被区变化范围为350.83~612.18 mg ·kg-1，均值为519.71 mg ·kg-1.土壤碳磷比在草原植被区变化范围为9.96~13.35，均值为11.05；在森林植被区变化范围为18.67~50.14，均值为36.49.除土壤全磷外，土壤含水率、土壤有机质、土壤全氮、土壤微生物量碳、碳磷比均表现为森林植被显著高于草原植被(P < 0.05).
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表 2 不同植被类型下土壤的基本特性1) Table 2 Soil biochemical properties under different vegetation types |
2.2 Alpha多样性分析结果
如表 3所示，所有样品的平均覆盖率为90%，且稀释曲线趋于平稳，表明该测序效果理想.在3%分类水平下，黄土高原不同植被类型下Chao、Ace、Simpson指数、Shannon指数、OTU数量有所差异. OUT数目、 Chao指数、 Ace指数、 Shannon指数均表现为：草原植被区>森林植被区，其中Shannon指数在不同植被类型下差异显著(P < 0.05)，表明草原植被区细菌多样性更为丰富；Simpson指数大小顺序为：草原植被区 < 森林植被区，二者之间差异不显著.
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表 3 不同植被类型下土壤细菌序列统计及多样性指数1) Table 3 Sequence statistics and diversity indexes of soil bacteria under different vegetation types |
2.3 群落结构组成分析
如图 1(a)所示，通过454高通量测序发现黄土高原不同植被类型下的土壤中检测到的主要门有：放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)等.变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门是土壤中占主导地位的微生物，约占到了所有微生物总数的80%~85%以上.在森林植被区Actinobacteria的变化范围为12.66%~19.15%，均值为15.83%；Proteobacteria的变化范围为29.40%~37.90%，均值为33.86%；Chloroflexi的变化范围为9.25%~14.67%，均值为11.25%；Acidobacteria的变化范围为8.51%~20.21%，均值为13.19%；Planctomycetes的变化范围为7.99%~10.02%，均值为8.89%.草原植被区Actinobacteria的变化范围为25.02%~29.15%，均值为27.41%；Proteobacteria的变化范围为23.72%~30.57%，均值为27.19%；Chloroflexi的变化范围为9.49%~13.43%，均值为11.55%；Acidobacteria的变化范围为5.66%~8.54%，均值为7.33%；Planctomycetes的变化范围为8.33%~9.71%，均值为9.01%.
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*表示不同植被类型间差异显著 图 1 门和纲分类水平下的微生物群落组成 Fig. 1 Composition of bacterial community at phylum level and class level |
如图 1(b)所示，在纲分类水平上，两个植被区土壤主要的优势菌分别为放线杆菌纲(Actinobacteria)、 α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteria)、 β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetacia).放线杆菌纲(Actinobacteria)在森林植被区的变化范围为12.66%~19.15%，均值为15.83%；在草原植被区为25.02%~29.15%，均值为27.41%，草原植被区显著高于森林植被(P < 0.05). α-变形菌纲(α-Proteobacteria)在森林植被区的变化范围为15.00%~24.11%，均值为18.35%；在草原植被区为15.61%~22.06%，均值为17.80%，两个植被区差异不显著(P>0.05).酸杆菌(Acidobacteria)在森林植被区的变化范围为8.51%~20.21%，均值为13.19%；在草原植被区为5.66%~8.54%，均值为7.33%，草原植被区与森林植被差异不显著(P>0.05). β-变形菌纲(β-Proteobacteria)在森林植被区的变化范围为4.61%~11.68%，均值为7.20%；在草原植被区为4.00%~8.45%，均值为5.61%，草原植被区与森林植被差异不显著(P>0.05).浮霉菌纲(Planctomycetacia)在森林植被区的变化范围为4.38%~5.36%，均值为4.96%；在草原植被区为3.71%~4.66%，均值为4.11%，草原植被区显著低于森林植被差异(P < 0.05).
2.4 环境因素对微生物群落的影响如表 4所示，相关性分析表明，Actinobacteria的相对丰富度与土壤pH值呈显著的正相关，与含水率、有机质、全氮呈显著的负相关. Proteobacteria与土壤全磷、全氮、有机质呈显著的正相关.土壤含水率与Acidobacteria的相对丰富度呈显著的负相关，与Actinobacteria、 Armatimonadetes、 Cyanobacteria的相对丰富度呈显著的正相关.土壤有机质、土壤全氮与Actinobacteria、 Armatimonadetes的相对丰富度呈显著的负相关.
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表 4 土壤基本性质与土壤细菌优势菌的相对丰富度的相关性分析1) Table 4 Correlation between soil properties and the relative abundance of soil bacteria phyla at the phylum level |
所有样品因环境因素的不同而聚类或分离的情况，从图 2中可看出，特征根的F=2.5，轴1、轴2、轴3和轴4的特征根的相关系数分别为0.94、 0.97、 0.87和0.99，到轴4的累计合理解释变量为86.2%.环境变量间夹角的余弦值表示二者的相关关系.森林植被区和草原植被区的微生物组成差异较大，森林植被区位于二、三象限，草原植被区位于一、四象限，G1与G4土壤的微生物差异较小. Actinobacteria、 Acidobacteria群落与pH显著正或负相关，Proteobacteria群落与TP、 SOM、 TN呈显著正相关.
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图 2 基于土壤细菌种群分布和环境因子的冗余分析 Fig. 2 Redundancy analysis (RDA) based on soil bacteria community at phylum level and environmental factors of the soil |
如图 3所示，不同的土壤微生物群落受土壤性质的影响不一致. Actinobacteria能够被土壤环境因子的解释率为90.4%，其中土壤水分的解释率最高，高达77.3%(P < 0.05). Proteobacteria能够被土壤环境因子的解释率为99.8%，其中土壤总磷的解释率最高，高达85.3%.其次为MBC(8.7%). Chloroflexi能够被土壤环境因子的解释率为62.3%，其中土壤pH和MBC是影响其分布的主要影响因子. Acidobacteria能够被土壤环境因子的解释率为99.4%，其中土壤水分的解释率最高，高达72.9%.其次为MBC(16.6%). Planctomycetes能够被土壤环境因子的解释率为63.5%，其中土壤pH与土壤总磷的解释率较高，分别为14.6%和25.5%. Bacteroidetes能够被土壤环境因子的解释率为73%，其中土壤水分与土壤总磷的解释率较高，分别为16.7%和27.6%. Gemmatimonadetes能够被土壤环境因子的解释率为97.4%，其中土壤水分、总氮、 MBC的解释率较高，分别为42.6%、 25.5%、 17.6%. Armatimonadetes能够被土壤环境因子的解释率为78.9%，其中土壤水分较高，高达69.4%. Cyanobacteria能够被土壤环境因子的解释率为99.2%，其中土壤水分、 pH、 SOM、 TN解释率较高，分别为58.3%、 10.4%、 9.6%、 9.1%.
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图 3 在门水平上不同土壤性质对不同细菌群落的影响 Fig. 3 Individual contribution of each significant parameter to the proportion of variation explained in soil bacteria communities |
黄土高原植被恢复已经对土壤的基本特性产生了显著的影响.大量的研究表明，植被恢复能有效地提高土壤的碳氮磷含量[21]，影响土壤微生物区系的组成[22]，促进土壤的团聚体的形成，提高土壤的稳定性[23]，在生态服务功能方面起着重要的作用.土壤微生物的生长又主要受土壤的基本特性与环境因子的影响.经过多年的植被恢复，植被组成、盖度均已经发生了重要的变化.土壤表层已经累积大量的枯枝落叶，微生物通过分解枯枝落叶对土壤养分循环与其自身多样性具有影响[9]. Actinobacteria能够降解复杂的木质素[24]与纤维素[25]，为土壤提供养分.森林植被区4种乔木林土壤Actinobacteria所占比例范围在12.66%~19.15%之间，与杨树人工林土壤较为一致[8].在Proteobacteria门中，α-Proteobacteria是最主要的亚门，其次是β-Proteobacteria亚门，森林植被与草原植被区所占比例分别为43%~64%、 13%~34%，这与韩亚飞等[8]对杨树人工林等的研究一致，而Roesch等[6]和Zhang等[7]采用高通量测序方法等研究发现β-Proteobacteria的丰富度大于α-Proteobacteria.李新等[26]研究发现变形菌门(α-变形菌纲、 β-变形菌纲、 γ-变形菌纲和δ-变形菌纲)是盐碱土壤的主要类群.本研究中，变型菌门是最主要的优势菌门，而该地区土壤呈弱碱性，也验证了变型菌门为碱性土壤中的主要优势群落.而4种草本植被土壤中分布最多的是放线菌门(Actinobacteria)，其相对丰度显著高于森林植被区(P < 0.05).很多研究发现pH是影响微生物群落的主要影响因素[27, 28]，这与本研究一致. pH主要影响Chloroflexi门与Planctomycetes的分布. Liu等[4]运用高通量测序研究发现影响东北黑土土壤细菌生物地理学分布的关键因子是pH.
此外，土壤肥力及土壤环境状况的不同，土壤微生物种群数量也会存在某种程度的差别.森林植被土壤有机质、总氮、总磷、微生物生物量碳氮显著高于草原植被土壤，而Acidobacteria、 Bacteroidetes的相对丰富度也显著高于草原植被土壤，可能是养分差异所导致的.本研究中，土壤全磷是影响Proteobacteria分布的主要因子，解释率高达85.3%. Liu等[29]研究发现在年龄较老的森林土壤中，土壤磷含量是影响土壤微生物种群结构的一个重要的环境因子，但是不是影响松树林里土壤微生物群落的主要因素. Cleveland等[30]在热带雨林里也发现土壤磷含量是影响土壤微生物群落结构的主要因子.也有研究发现土壤有机碳浓度是驱动土壤微生物生物地理学分布的主要原因[4].尽管不同植被类型下土壤的有机碳差异显著(P < 0.05)，但是RDA分析结果表明有机碳并不是影响该区域土壤细菌群落分布的主要因素.而土壤水分是影响黄土高原土壤细菌种群分布的主要原因，这与Zhang等[31]的研究一致.本研究中，土壤水分对Acidobacteria的解释率高达77.3%，对Acidobacteria的解释率为72.9%，此外土壤水分也是影响Gemmatimonadetes、 Armatimonadetes、 Cyanobacteria分布的最主要的环境因子.表明在半干旱地区土壤水分是影响细菌分布的主要环境因子.
目前，很多学者应用测序研究土壤微生物的生物地理学分布[4, 5, 27]，探究土壤微生物是否像动物、植物那样随着纬度的差异而变化.有学者认为纬度是影响土壤微生物分布的重要因素[32, 33]，也有学者认为纬度不是影响土壤微生物的主要因素[18].本研究中由于区域较小，纬度变化不是影响土壤细菌分布的主要因素.黄土高原作为退化生态系统的典型代表，植被生态系统变异性大，是否会对土壤微生物群落分布造成影响，目前还缺乏对其土壤微生物生物学地理分布的研究，探明退化生态系统下土壤微生物的地理分布，对评估黄土高原的生态恢复效益与土壤肥力的保育具有非常重要的意义.
4 结论(1) 454高通量测序技术测序结果能够全面的反映土壤样品细菌群落的组成及结构.多样性指数表明草原植被土壤多样性高于森林植被土壤.
(2) 两个植被区土壤中的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)，主要的优势菌纲为放线杆菌纲(Actinobacteria)、 α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、酸杆菌纲(Acidobacteria)、 β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetacia).
(3) 不同细菌群落受土壤环境因子的影响不一致，土壤水分是影响Acidobacteria和Actinobacteria分布的主要影响因子，土壤全磷是影响Proteobacteria分布的关键因子.总体来看，土壤水分是影响黄土高原土壤细菌群落分布的主要因素.
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