2016, Vol. 37
2.中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛 266071
2.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
氮素污染物的过量排放导致水体富营养化问题日益突出，因此，加强废水脱氮研究尤为迫切[1]. 目前，废水的脱氮处理主要有生物法和物理化学法，而生物脱氮被认为是去除污水中氮素最经济有效的方式[2]. 近20年来，国内外研究者陆续发现了一些新型的脱氮菌株[3~5]，这些菌株既可以进行异养硝化，同时又能进行好氧反硝化，被称为异养硝化-好氧反硝化细菌. 这类细菌能同时去除C和N的污染，在硝化前不用去除COD，不用为反硝化额外添加C源，硝化反硝化各自产生的酸碱能部分相互中和，减少缓冲剂的投加. 这些发现和研究突破了人们对传统脱氮理论的认识，使得氨化、 硝化和反硝化同时在好氧条件下进行成为可能，对在污水处理中构建同步脱氮体系具重要意义，逐渐成为生物脱氮领域研究的热点[6~10]. 近年来，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究尚处于起步阶段，已报道的该类菌株主要有假单胞菌属(Pseudomonas)[11]、 盐单胞菌属(Halomonas)[4]、 芽孢杆菌属(Bacillus)[12]、 不动杆菌属(Acinetobacter)[13]和产碱菌属(Alcaligenes)[14]等，但因大多数菌不耐高盐或高氮，能成功应用于海水养殖废水和高盐高氮工业废水处理中的报道尚不多. 为此，本文报道从刺参养殖环境中分离筛选出的同时具备硝化和反硝化功能的菌株SLWX2，及针对该菌株做的鉴定和脱氮性能研究工作，以期进一步丰富生物脱氮理论，并为异养硝化-好氧反硝化菌在污水处理工程中的实际应用提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 样品来源试验样品于2014年7月采自山东省青岛市红岛刺参养殖池塘的水体和沉积环境. 水样和泥样低温保存，及时带回实验室.
1.2 培养基分离培养基[4]： KNO2 1 g，(NH4)2SO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 30 g，CaCO3 1 g，FeSO4 0.1 g，葡萄糖0.3 g，NH4Cl 0.5 g，酵母膏0.03 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 8.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min.
筛选培养基： KNO2 6 mg、 KNO37.14 mg或(NH4)2SO4 4.67 mg，葡萄糖0.6 g(孔径0.22 μm滤膜过滤灭菌)，陈海水600 mL(121℃灭菌20 min).
组合测试培养基： MgSO4·7H2O 0.06 g、 NaH2PO4 0.12 g、 K2HPO4 0.3 g、 NaCl 18 g，CaCO3 0.6 g，FeSO4 0.06 g、 蒸馏水600 mL(121℃灭菌20 min)，KNO2 6 mg、 KNO3 7.14 mg或(NH4)2SO4 4.67 mg及葡萄糖0.6 g(孔径0.22 μm滤膜过滤灭菌).
氮负荷耐受测试培养基： MgSO4·7H2O 0.06 g、 NaH2PO4 0.12 g、 K2HPO4 0.3 g、 NaCl 18 g，CaCO3 0.6 g，FeSO4 0.06 g、 蒸馏水600 mL(121℃灭菌20 min)和最终质量浓度为1 g·L-1的葡萄糖(孔径0.22 μm滤膜过滤灭菌)为基液. 分别添加氮质量浓度为10~500 mg·L-1的系列硫酸铵、 亚硝酸钠或硝酸钾.
上述试剂均为分析纯，采购自国药集团.
1.3 菌株的分离与筛选 1.3.1 富集与分离带回实验室的水样和泥样经充分搅拌后，无菌条件下取10 mL水样和10 g泥样，分别接入装有90 mL无菌生理盐水中，振荡10 min. 分别吸取10 mL上清液接种于液体异养硝化培养基中，28℃、 150 r·min-1振荡培养2~3 d. 重复接种培养3次后，取10 mL富集液适当稀释后，取100 μL均匀涂布于异养硝化菌培养基平板，置入恒温培养箱，28℃培养2~3 d. 挑选不同形态的单菌落进行平板划线分离，重复2~3次，直至得到纯的单菌落. 再接种于异养硝化菌分离培养基斜面，培养后4℃和-80℃冰箱保存.
1.3.2 菌株筛选在添加葡萄糖的条件下，将7株候选菌接种于添加氮源(亚硝酸钾、 硝酸钾或硫酸铵各含氮1.65 mg·L-1)的600 mL筛选培养基中，接种量控制在1.8~1.9×106 CFU·mL-1范围内，置于28℃、 150 r·min-1振荡培养. 每隔24 h取一次样，测定NH4＋-N、 NO2--N和NO3--N值. 选取对3种无机氮去除效果最佳的菌株.
1.4 菌种鉴定将-80℃冰箱中保存的菌株接到异养硝化培养基上，培养3d，再用无菌水从平板洗下，放入灭菌的菌种保存管，委托中国科学院微生物研究所通过形态观察、 革兰氏染色、 生理生化等试验及16S rRNA和rpoB基因测序进行菌种鉴定. 并将测序结果提交到NCBI核酸数据库，用Blast进行比对，获得同源性序列，通过MEGA 5.0 软件，以Neighbor-joining法构建系统发育树，对其进行系统发育分析.
1.5 多种氮源同时存在时的脱氮特性在添加葡萄糖的条件下，将菌株SLWX2接种于同时添加3种氮源(亚硝酸钾、 硝酸钾和硫酸铵，总含氮4.95 mg·L-1)的600 mL组合测试培养基中，接种量控制在1.8×106~1.9×106 CFU·mL-1范围内，置于28℃、 150 r·min-1振荡培养. 每隔24 h取一次样，测定NH4＋-N、 NO2--N和NO3--N值.
1.6 对不同浓度氮负荷的耐受性分别以硫酸铵、 亚硝酸钠、 硝酸钾为氮源，配制氮添加量为10、 50、 100、 200、 300、 400和500 mg·L-1的600 mL系列测试培养基，每个浓度设3个重复. 将菌种(菌液浓度控制在1.8×106~1.9×106 CFU·mL-1)接种于各系列测试培养基，置于28℃、 150 r·min-1振荡培养. 每隔24 h取一次样，测定NH4＋-N、 NO2--N和NO3--N值.
1.7 无机氮测定方法参照《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007) [4]，氨氮的测定采用次溴酸盐氧化法； 亚硝酸氮的测定采用盐酸萘乙二胺分光光度法； 硝酸氮的测定采用锌-镉还原法.
2 结果与分析 2.1 菌株分离与筛选经富集、 分离和纯化，从刺参养殖池塘水中获得3株候选异养硝化细菌，分别编号为SLWX1、 SLWX2和SLWX3，从底泥中分离到4株，编号为SLNX1、 SLNX2、 SLNX3和SLNX4.
将7株候选菌株在添加葡萄糖、 以硫酸铵为氮源的筛选培养基(氮添加量为1.65 mg·L-1)中连续培养72 h，如图 1所示，24 h，SLWX1、 SLWX2和SLNX2组氨氮基本均降到0； 其余组连续培养72 h后，氨氮变化不大，说明SLWX1、 SLWX2和SLNX2对氨氮去除效果较好.
|
图 1 7株候选菌对氨氮的去除效果 Fig. 1 NH4＋-N removal performance of 7 candidate strains |
将7株候选菌株分别在添加葡萄糖、 以亚硝酸钠为氮源的筛选培养基(氮添加量为1.65 mg·L-1)中连续培养72 h，如图 2所示，24 h，SLWX2组亚硝酸氮去除率达已达99.5%； SLWX1和SLNX2组72 h后亚硝酸氮去除率分别是16.5%和36.1%，明显较SLWX2差； 其余组亚硝酸氮并未见明显的降低，说明SLWX2对亚硝酸氮的去除效果最好.
|
图 2 7株候选菌对亚硝酸氮的去除效果 Fig. 2 NO2--N removal performance of 7 candidate strains |
将7株候选菌株分别在添加葡萄糖、 以硝酸钾为氮源的筛选培养基(氮添加量为1.65 mg·L-1)中连续培养72 h，如图 3所示，24 h，SLWX2组下降最明显，去除率达85.6%，SLWX1和SLNX2组72 h硝酸氮去除率才分别达26.7%和82.2%； 其余组培养基中硝酸氮没有明显降低，说明SLWX2对硝酸氮的去除能力最强.
|
图 3 7株候选菌对硝酸氮的去除效果 Fig. 3 NO3--N removal performance of 7 candidate strains |
综上，菌株SLWX2同时具备去除氨氮、 亚硝酸氮和硝酸氮这3种无机氮的能力，且24 h内脱氮效率最高，所以，后期对该菌株的分类地位和脱氮特性做进一步研究.
2.2 菌种鉴定 2.2.1 菌株SLWX2的形态特征和生理生化特性菌株在硝化细菌培养基平板上培养后观察其菌落形态呈圆形、 边缘不整齐，直径约为0.5 mm，表面平坦； 显微镜下细胞呈杆状，可形成芽孢，芽孢不膨大，不形成伴孢晶体，革兰氏染色呈阳性. 生理生化试验结果如表 1所示，β-半乳糖苷酶、 接触酶、 淀粉水解、 明胶水解、 酪素酶水解、 VP试验呈阳性； 氧化酶、 精氨酸双水解酶、 鸟氨酸脱羧酶、 赖氨酸脱酸酶、 脲酶、 甲基红、 产H2S试验呈阴性； 可利用碳源有乳酸钠、 D-果糖-6-磷酸、 果胶、 L-乳酸、 丁酸钠，8%NaCl中仍能生长，在pH 5条件下不能生长.
|
表 1 菌株SLWX2的生理生化特征 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain SLWX2 |
2.2.2 16S rRNA 基因测序和系统发育分析
对菌株SLWX2测序，得到长度为1460 bp的16S rRNA基因序列，GenBank序列登录号为KT952330，经Blast比对，发现该菌株与Bacillus hwajinpoensis同源性为99%以上，再结合菌株的形态学和生理学特征，确定分离的菌株SLWX2为花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis). 将该菌株与同源性高的细菌进行系统发育分析，得到系统进化发育树(图 4).
|
图 4 基于16S rRNA 基因序列同源性构建的菌株SLWX2的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of strain SLWX2 based on the sequence homology of 16S rRNA gene |
菌株SLWX2在添加葡萄糖，同时含亚硝酸钾、 硝酸钾和硫酸铵的组合测试培养基中连续振荡培养96 h，如图 5所示，24 h，氨氮首先有明显的下降，48 h之后亚硝酸氮和硝酸氮也持续下降； 说明菌株SLWX2优先利用氨氮，再利用亚硝酸氮和硝酸氮. 72 h，氨氮、 亚硝酸氮和硝酸氮去除率分别为100%、 98.3%和99.9%，证明菌株SLWX2有良好的硝化和反硝化性能，且此过程中并没有亚硝酸氮和硝酸氮的积累，表明该菌株能独立完成异养硝化和好氧反硝化过程，进行脱氮.
|
图 5 组合测试培养基中3种无机氮含量随时间的变化 Fig. 5 Changes of the concentrations of inorganic nitrogen in the combined test medium with time |
如图 6所示，菌株连续培养96 h，7组氨氮负荷测试培养基中NH4＋-N都呈持续下降趋势； 48 h，各组氨氮均有大幅度下降，去除速率达到最大，分别为0.21、 1.04、 1.80、 3.98、 4.07、 4.13、 4.09 mg·(L·h)-1，说明高浓度氨氮对该菌株的脱氮没有明显抑制作用； 72 h，10、 50和100 mg·L-1组氨氮降解完全，96 h，200～500 mg·L-1组氨氮分别降至5、 19、 114、 197 mg·L-1，可见，菌株SLWX2可耐受500 mg·L-1氨氮，最多可去除180 mg氨氮，比去除速率为3.13 mg·(L·h)-1.
|
图 6 菌株SLWX2对不同浓度氨氮的利用 Fig. 6 Utilization of different concentrations of ammonia-nitrogen by strain SLWX2 |
同时检测了各培养基中NO2--N的质量浓度，发现无论是低浓度还是高浓度氨氮负荷，其去除过程中几乎没有亚硝酸盐的积累(表 2).
|
|
表 2 菌株SLWX2对不同浓度氨氮利用过程中NO2--N的积累/mg·L-1 Table 2 Accumulation of NO2--N during ammonia-nitrogen utilization by strain SLWX2/mg·L-1 |
从图 7可以看出，48 h，各组亚硝酸氮均有明显下降，10 mg·L-1和 50 mg·L-1组降至0.03 mg·L-1以下，去除率达99%以上，其余组亚硝酸氮降解不完全，去除速率分别是0.96、 0.66、 0.65、 0.13和0.41 mg·(L·h)-1，之后各组NO2--N降解幅度减小； 96 h，100～500 mg·L-1组氨氮降至49、 155、 266、 377、 490 mg·L-1，可见，菌株SLWX2 可耐受300 mg·L-1亚硝酸氮，最多可去除30 mg亚硝酸氮，比去除速率为0.52 mg·(L·h)-1.
|
图 7 菌株SLWX2对不同浓度亚硝酸氮的利用 Fig. 7 Utilization of different concentrations of nitrite-nitrogen by strain SLWX2 |
如图 8所示，菌株连续培养96 h，7组硝酸氮负荷测试培养基中NO3--N都呈持续下降趋势，24 h，10 mg·L-1和50 mg·L-1组硝酸氮略有下降，去除速率为0.02 mg·(L·h)-1和0.31 mg·(L·h)-1，其余组硝酸氮有明显下降，去除速率分别为0.96、 0.31、 1.55、 2.74、 2.62 mg·(L·h)-1，说明该菌在高浓度含硝酸氮的培养基中其脱氮能力不受抑制； 72 h，10～200mg·L-1组培养基中硝酸氮基本降解完全，均在0.15 mg·L-1以下； 96 h时，其余组氨氮降至141、 255、 330 mg·L-1，可见，菌株SLWX2可耐受500 mg·L-1硝酸氮，最多可去除120 mg硝酸氮，比去除速率为2.08 mg·(L·h)-1.
|
图 8 菌株SLWX2对不同浓度硝酸氮的利用 Fig. 8 Utilization of different concentrations of nitrate-nitrogen by strain SLWX2 |
同时检测了各培养基中NO2--N质量浓度，发现硝酸氮负荷低于200 mg·L-1时，去除过程中基本没有NO2--N的积累，而负荷高于300 mg·L-1时，72 h后亚硝酸氮积累明显增加，约5~8 mg·L-1(表 3).
|
|
表 3 菌株SLWX2对不同浓度硝酸氮利用过程中NO2--N的积累/mg·L-1 Table 3 Accumulation of NO2--N during nitrate-nitrogen utilization by strain SLWX2/mg·L-1 |
3 讨论
在现有研究报道的异养硝化-好氧反硝化细菌中，有部分为芽孢杆菌，包括地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)[15]、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[16]、 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)[17]、 巨大芽孢杆菌(Bacillus megeterium)[18]以及弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)[19]等. 本研究从刺参养殖池塘水体中分离获得1株同时具备异养硝化和好氧反硝化性能的菌株(SLWX2)，经中国科学院微生物研究所鉴定为花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis)，为首次报道该种具有这种功能. 菌株SLWX2在1%～8% NaCl 条件下均能生长，对盐度有较好的适应能力. 本试验结果表明3%NaCl条件下，菌株SLWX2能高效去除培养基中的氨氮、 亚硝酸氮和硝酸氮，24 h的去除率分别是100%、 99.5%和85.6%(图 1~3). 与其他同类芽孢杆菌[20~22]相比，在脱氮能力相当的情况下，该菌株有明显的耐高盐优势，且能实现同步硝化和反硝化，这对海水养殖或高盐工业废水的脱氮有重要意义.
在研究异养硝化-好氧反硝化细菌的脱氮特性时，多数学者采用氨氮和硝酸氮为唯一氮源，以研究被测菌株的硝化和反硝化性能，陈茂霞等[23]、 黄廷林等[24]、 孙庆花等[25]采用了3种无机氮为唯一氮源，但每种氮源仅设置了一个初始浓度，难以确定测试菌株对各种氮的耐受限度，也不能确定菌株在特定培养条件下对不同浓度氮的去除效果，这部分数据的缺失不利于菌株在实际生产上的应用. 本试验分别以氨氮、 亚硝酸氮和硝酸氮为唯一氮源培养菌株SLWX2，且每种氮源设置了7个浓度梯度，测试菌株的脱氮效果，结果显示： 菌株SLWX2可耐受500 mg·L-1 的NH4＋-N和NO3--N，及300 mg·L-1的NO2--N负荷，高于很多同类菌株可耐受的氮负荷[26~28]，96 h最多可去除180 mg NH4＋-N，且该过程中没有亚硝酸盐的积累； 最多可去除30 mg NO2--N和120 mg NO3--N，亚硝酸盐仅在高浓度硝酸氮测试培养基后期有积累，最大积累量为8 mg·L-1，均低于张培玉等[29]分离的菌株 GYL 和石小彤等[30]筛选的耐盐反硝化细菌F1反硝化过程中亚硝酸盐的积累，说明该菌株在处理高浓度含氮废水的净化方面更具优势.
近年来，越来越多的异养硝化-好氧反硝化细菌从自然界或人工系统中被筛选出来，研究发现不同种类的菌株，其生长特性、 脱氮途径和酶学特征等都有较大的差异，目前Richardson等[31]提出的异养-好氧反硝化细菌“脱氮假想途径”获得了国内外学者的广泛认可. 本研究中多种无机氮源同时存在时，组合培养基中氨氮最先有明显的下降，而亚硝酸氮和硝酸氮没有明显增加，随后这3种无机氮均被降解完全，并且菌株SLWX2对7种不同氨氮负荷的利用过程中，NO2--N基本没有积累，而300～500 mg·L-1硝酸盐负荷测试培养基中72 h和96 h均能检测到亚硝酸氮，说明该菌株好氧反硝化过程中产生亚硝酸盐，但因试验过程中并未检测羟胺含量和气体组成，该菌的异养硝化和反硝化途径及机制有待进一步研究.
4 结论(1) 从刺参养殖环境中筛选出1株具有较强异养硝化和好氧反硝化能力的菌株SLWX2，该菌株24 h对氨氮、 亚硝酸氮和硝酸氮的去除率分别达到100%、 99.5%和85.6%，在1%～8% NaCl条件下均能生长. 经鉴定其为花津滩芽孢杆菌(Bacillus hwajinpoensis).
(2) 多种无机氮源同时存在时，菌株SLWX2优先利用氨氮，再利用亚硝酸盐和硝酸盐，并独立完成硝化和反硝化，72 h无机氮从4.95 mg·L-1可降至0.03 mg·L-1.
(3) 菌株SLWX2可耐受500 mg·L-1 的NH4＋-N和NO3--N，及300 mg·L-1的NO2--N，在氨氮负荷500 mg·L-1、 亚硝酸氮负荷100 mg·L-1和硝酸氮负荷200 mg·L-1范围内，该菌的脱氮能力不受明显抑制，对3种形态的氮均有良好去除效果，96 h最多可去除180 mg NH4＋-N、 30 mg NO2--N和120 mg NO3--N.