铅(Pb)作为重要的无机重金属污染物之一，广泛存在于耕地、 工业废弃地、 工业园区、 固废集中处置区、 采矿区和干线公路两侧^[1]. 全国有1.5%的土壤总Pb超过了国家土壤环境质量二级标准，仅工业废水排放Pb在2012年就接近100 t^[2]. 而Pb属于环境激素之一，其能够在生物体内蓄积，干扰生物体的内分泌系统，并对人体尤其是儿童的神经系统产生影响，引发神经行为紊乱^[3]. 小分子有机酸(LMWOAs)是普遍存在于湖泊水体及根际土壤中的一类分子量小于250的有机酸^[4]，主要是植物根系分泌物、 土壤有机质分解以及微生物代谢的产物^[5]. 其不仅能够影响土壤中有机污染物的迁移转化过程^[6]，还能够通过酸化或络合作用，改变金属在土壤中的赋存形态^[7]，加速金属元素的矿物风化，使其在环境介质中结合/释放^[8]，并可能增加有毒重金属的生物有效性^[9]，促进其进入生物组织，引起生物体响应^[10].

近几年来，关于LMWOAs对于重金属元素影响作用的研究主要集中在机制层面的土壤矿质元素风化流失^{[11, 12]}、 土壤有害金属离子生物有效性改变^{[13, 14]}、 重金属离子迁移转化活性增强的动力学^[15]与影响因素^[16]； 土地污染修复工程中应用层面的化学淋洗修复^[17]、 螯合诱导植物修复^{[18, 19]}及对重金属钝化的影响^{[20, 21]}. 关于LMWOAs与重金属Pb作用研究除生物有效性改变和土壤污染修复的研究外，还涉及Pb胁迫下植物根系分泌LMWOAs的特征^[22]，LMWOAs与Pb结合后的生物降解性^[23].

其中对于LMWOAs作用下土壤及其土壤溶液中Pb形态的研究，有助于了解LMWOAs存在下土壤Pb的生物地球化学循环，其为Pb污染土地的植物修复提供依据； 为可食用作物吸收过量Pb产生的人体积累提供风险预测； 对使用LMWOAs淋洗污染土地提供作用机制支撑. 目前已经有学者对LMWOAs作用下土壤中重金属的形态有所研究，然而对土壤溶液中的形态还涉及较少. 土壤溶液较土壤固相更容易与土壤生物或植物发生物质交换^[24]，重金属在土壤溶液中的形态对重金属的生物有效性有最为直接的关系.

本研究以紫色土为对象，利用3种外源添加的小分子有机酸对模拟污染紫色土中的Pb增溶作用，并利用土壤重金属形态的连续提取法和Visual MINTEQ地球化学平衡软件分别研究了经过活化后紫色土及土壤溶液中Pb形态的分布特征，以期为Pb潜在的环境风险研究提供科学依据.

1.1 试验材料

供试土壤为中性紫色土，采自重庆西南大学后山(106°25′E，29°49′N). 土壤经风干后，根据土壤Pb污染现状^[25]，按1 000 mg ·kg^-1添加外源Pb[Pb(NO₃)₂粉末]，制成含Pb的模拟污染土壤，按60%田间持水量加水，老化15d后风干，过60目筛网，备用. 培养后测定土壤pH(水土比5 ∶1)为7.78±0.08，阳离子交换量(CEC)(17.50±0.31) cmol ·L^-1，有机质为(13.43±0.99) g ·kg^-1，大于0.25 mm粒径占0.08%，0.02-0.25 mm粒径占45.52%，小于0.02 mm粒径占54.40%. 供试土壤的总Pb本底值(47.96±3.21) mg ·kg^-1，模拟污染土壤总Pb为(922.51±29.80) mg ·kg^-1.

选取的柠檬酸、 酒石酸、 乙酸均为常见的小分子有机酸，广泛分布于植物的根际环境中^[26]. 试验所用化学试剂均为成都科龙公司产的分析纯试剂.

采用一步提取方法，称取(1±0.004) g模拟污染土样于50 mL离心管中，添加10 mL不同浓度有机酸(5、 10、 15、 20 mmol ·L^-1)，在25℃，以220r ·min^-1避光振荡提取2 h. 室温静置平衡2 h后测定pH值并离心过滤，采用火焰原子吸收分光光度法测定重金属Pb质量浓度，得到Pb的释放量. 背景电解质为0.01 mol ·L^-1 NaNO₃. 试验共设14个处理，即不含任何有机酸活化处理的模拟污染土壤对照(SPS)，5、 10、 15、 20mmol ·L^-1的乙酸(AC5，AC10，AC15，AC20)，酒石酸(TA5，TA10，TA15，TA20)，柠檬酸(CA5，CA10，CA15，CA20). 每个处理均包括3次重复和添加背景电解质的空白.

LMWOAs作用后土样、 无土空白以及对照(SPS)，经离心后取土壤残渣，采用改进的Tessier^[27]分步提取法，提取不同形态土壤Pb：交换态(F1)； 碳酸盐结合态(F2)； 铁锰氧化物结合态(F3)； 有机结合态(F4)； 残渣态(F5).

土壤溶液中的金属形态，采用地球化学模型Visual MINTEQ Ver. 3.0^[28]进行模拟计算. 溶液络合计算的平衡常数见表 1. 输入数据：有机酸作用下重金属的释放量； 反应后悬浮液pH值； 有机酸初始浓度； 背景电解质浓度. 数据模拟在CO₂平衡大气压下进行(38.50 Pa)，选择Davies方法进行离子活度校正，并且忽略表面络合模型^[29].

表 1 (Table 1)

表 1 重金属形态计算所需的热力学数据 1)(25℃) Table 1 Thermodynamic data used for speciation calculations at 25℃ 平衡反应 结合常数lgK25 文献 H2O OH-+H+ -13.993 [30] Pb2++H2O PbOH++H+ -7.597 [30] Pb2++NO3- Pb(NO3)+ 0.33 [31] Pb2++2NO3- Pb(NO3)2 0.4 [31] Pb32++CO2- PbCO3 6.478 [30] Pb32++CO2-+H+ PbHCO3+ 13.2 [30] Pb32++2CO2- Pb(CO3)22- 9.938 [30] Pb2++Acetate- Pb(Acetate)+ 2.4 [32] Pb2++2Acetate- Pb(Acetate)2 3.4 [32] Pb2++Tartaric2- Pb(Tartaric) 2.6 [31] Pb2++2Tartaric2- Pb(Tartaric)2- 4 [31] Pb2++H++Tartaric2- PbH(Tartaric)+ 1.76 [31] Pb2++H++2Tartaric2- PbH(Tartaric)2- 3.5 [31] Pb2++Citrate3- Pb(Citrate)- 5.4 [33] Pb2++H++Citrate3- PbH(Citrate) 2.98 [31] Pb2++2H++Citrate3- PbH2(Citrate)+ 1.7 [31] 1)Acetate-为乙酸根，Tartaric2-为酒石酸根，Citrate3-为柠檬酸根

表 1 重金属形态计算所需的热力学数据 1)(25℃) Table 1 Thermodynamic data used for speciation calculations at 25℃

土壤pH值测定参照标准ISO10390-1994，混合液和土壤pH值测定采用电位法； CEC参照国标GB 7863-87； 紫色土中有机质采用重铬酸钾氧化法； Pb的测定采用火焰原子吸收分光光度法(GB 15618-1995). 试验数据采用Excel 2007、 SPSS 19、 Origin 8.5软件处理分析.

不同浓度的柠檬酸、 酒石酸、 乙酸对紫色土中Pb增溶影响不同. 采用背景电解质(0.01 mol ·L^-1 NaNO₃)提取游离态Pb含量仅为(0.51±0.06) mg ·kg^-1，3种不同小分子有机酸均促进紫色土中Pb增溶(图 1)，在整个增溶过程中，3种有机酸的增溶能力大小为柠檬酸＞酒石酸＞乙酸，其中柠檬酸对Pb提取量在145.38-182.51 mg ·kg^-1之间，明显强于酒石酸(12.91-38.59 mg ·kg^-1)和乙酸(4.04-29.17 mg ·kg^-1). 酒石酸对Pb提取量高于乙酸，然而在低浓度(5 mmol ·L^-1)时差异不显著.

图 1

Fig. 1

同一浓度下，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)图 1 不同有机酸浓度下Pb的增溶量与混合液pH值 Fig. 1 Mobilized Pb and pH under different LMWOAs concentrations

背景电解质提取Pb时，土壤溶出液pH值为6.3，其提取量仅为0.51 mg ·kg^-1，而施加小分子有机酸后，pH值为2.51-5.29，均低于背景电解质提取后土壤溶出液pH值； 且随着有机酸浓度增加，pH值降低，其中当柠檬酸处理中pH值为2.9时，其对 Pb提取量较背景电解质增加了357.9倍，说明根际分泌的小分子有机酸作为土壤酸性的主要贡献者，增加了紫色土中游离Pb²⁺总量.

由于土壤环境为偏碱性的环境，部分投加入模拟土壤的Pb²⁺以沉淀的形式存在，而这时有机酸的增溶量包含H⁺作用下溶解的Pb和以不同形式结合在土壤中被活化的Pb. 在之前的研究中，课题组采用全自动电位滴定辅助下，分别模拟H⁺和酸根离子对Pb的增溶试验发现，柠檬酸酸根的活化作用占总增溶量的19.55%-40.18%，酒石酸酸根活化量占自身增溶量的124.01%-212.81%，乙酸表现为强质子作用，酸根活化仅占0.99%-1.98%^[15]. 酒石酸配体活化量的增加，可能说明酒石酸分子有抑制金属离子释放的可能.

图 2为连续提取法测得的紫色土中Pb形态分布. 从中可知，不同有机酸处理下，紫色土中Pb形态发生明显变化. 与未经LMWOAs作用的模拟污染土(SPS)相比，添加不同有机酸处理浸提后，Pb形态分布与对照组(SPS处理)的变异系数最高可达93.87%，属中等变异性^[34]； 在5种形态Pb中，经有机酸处理后F1较对照组增加了81.44%-261.53%，F2显著减小，从对照组中占总Pb比例的37.65%下降到7.67%-25.06%，这是因为添加小分子有机酸后，质子作用溶解土壤中的碳酸盐，碳酸盐结合态Pb被释放后又以交换态的形式存在于土壤中. Tao等^[35]的研究表明，在根际分泌物作用下，土壤中重金属从相对稳定的形态，转变为可交换态.

图 2

Fig. 2

对照SPS：未经过任何活化处理的模拟污染土； F1：交换态； F2：碳酸盐结合态； F3：铁锰氧化物结合态； F4：有机结合态； F5：残留态 图 2 有机酸作用下紫色土中Pb的形态分布 Fig. 2 Effects of LMWOAs on the Pb speciation in purple soil

从图 2还可以看出，有机酸处理后的土壤中交换态Pb占总Pb的质量分数与有机酸浓度呈显著的相关性(柠檬酸r=0.93，P<0.05，酒石酸r=-0.98，P<0.01，乙酸r=0.96，P<0.05)，但变异幅度较对照处理减小. 柠檬酸作为三元羧酸，其分级解离系数分别为3.13、 4.76、 6.40^[36]，能够较其他LMWOAs释放更多H⁺与酸根离子，而释放出的H⁺一方面通过专性与非专性离子交换，把F2、 F4 转变为游离态Pb； 另一方面增加了土壤中可变电荷位点的正电荷，如铁锰氧化物结合位点，从而减少了F3含量^[37]，再加上经活化后的游离态Pb在H⁺消耗后，又能通过静电作用以交换态的形式吸附在土壤颗粒上，增加了F1分布. 在柠檬酸作用下，土壤中有机质(SOM)被活化，从而降低了土壤自身有机结合态Pb含量即土壤中F4减小，被活化的SOM能够释放溶解性有机碳(DOC)，这部分DOC可以作为有机配体，进一步活化其他形态的Pb^[38]. 其中一部分Pb以有机络合物的形式进入土壤溶液，还有一部分在土壤溶液与土壤颗粒的复杂界面反应下，以可交换态保留在土壤固相.

乙酸处理得到的Pb形态分布变化趋势与柠檬酸类似，但由于乙酸所能解离出的质子量少于柠檬酸，其相同浓度溶液pH都要比柠檬酸溶液pH值高一个单位以上(图 1)，所以其对F2的影响小于柠檬酸. 值得注意的是，乙酸处理不同于柠檬酸处理，其F4含量未发生明显变化. 而柠檬酸处理F4表现为降低的趋势，这可能说明乙酸虽然携带质子量较柠檬酸少，但在释放重金属反应中，乙酸质子相对乙酸配体对Pb释放的贡献大于柠檬酸的质子，即柠檬酸在释放反应中能够表现较强的配体活化作用，能够进一步通过竞争络合或螯合作用释放铁锰氧化物结合位点的Pb^[39]； 其中关于质子与配体释放Pb的作用的大小与之前的研究一致^[15].

随酒石酸浓度增加，F3和F4所占比例增加，与柠檬酸和乙酸处理呈相反的趋势. 这说明酒石酸在释放Pb的过程中，一部分与酒石酸以络合物的形式被土壤固相吸附，并且主要的吸附位点为酒石酸破坏较小的铁锰氧化物结合位点，这一现象可以用来解释酒石酸提取Pb时的抑制作用. 除此之外，酒石酸、 柠檬酸和乙酸与Pb的一级络合稳定常数分别为3.69、 4.52和5.13^[29]，可见柠檬酸，乙酸与Pb的络合稳定度较酒石酸更高，也说明了酒石酸作用下F4会呈现出不同于柠檬酸和乙酸变化趋势的原因. 在整个试验过程中，各处理的土壤中F5变化均非常小，因为残渣态的Pb主要结合在硅酸盐、 原生和次生矿物等土壤晶格中，化学性质稳定^[40].

根据Pb的活化量以及土壤中Pb形态分布，运用Visual MINTEQ软件，模拟预测经一步提取法后土壤溶液中Pb的不同形态分布. 模拟过程中忽略LMWOAs降解. 由表 1可知，在不同种类和浓度LMWOAs处理下的土壤溶液中，Pb主要以有机络合态形式存在[Pb(Acetate)₂⁺、 Pb(Acetate)₂、 PbH(Tartrate)^2-、 PbH(Tartrate)⁺、 Pb(Tartrate)^2-、 Pb(Tartrate)、 PbH₂(Citrate)⁺、 PbH(Citrate)、 Pb(Citrate)^-]. 其次为游离态和无机络合态. 对比3种LMWOAs处理，有机络合态Pb在柠檬酸和酒石酸处理中随浓度上升而降低； 在乙酸处理中随浓度上升而增加. 这是因为柠檬酸和酒石酸为多元羧酸，在相同浓度下pH均低于乙酸； 且随浓度增加，土壤溶液中有机配体数量增加，但由于pH较乙酸低，故降低了有机酸络合能力，从而减少有机络合态Pb量； 根据LMWOAs形态分布计算(图 3)，当浓度从5 mmol ·L^-1增加到20 mmol ·L^-1时，柠檬酸和酒石酸pH分别从3.86和3.55下降至2.90和2.51，而乙酸pH从5.29下降至4.26. 在pH值为2.9时，柠檬酸主要以H₃-Citrate和部分H₂-Citrate^-存在，在pH值2.51时，酒石酸以H₂-Tartrate和H-Tartrate^-存在，可见二者释放的配体数量相对有限. 而当pH值在4.26时，乙酸处理中Acetate^-已经大量存在，在浓度为20 mmol ·L^-1时，较柠檬酸和酒石酸有更多的有机配体，因此随浓度增加，乙酸处理中的有机络合态Pb增加，而柠檬酸和酒石酸处理中的有机络合态Pb下降.

图 3

Fig. 3

图 3 柠檬酸、 酒石酸、 乙酸的形态分布 Fig. 3 Species distribution of citric acid,tartaric acid and acetic acid

有研究指出^[41]，长期污染的土壤溶液中游离态Pb含量非常少，仅占总Pb含量的0.6%-10%，本研究发现，不同浓度LMWOAs处理下游离态Pb含量显著增加，如表 2所示，在柠檬酸和酒石酸处理中，土壤溶液中游离态Pb含量随有机酸浓度增加而增加，分别从24.87%和22.71%增加至43.71%和50.25%，而乙酸处理的游离态Pb含量从45.78%下降至39.01%，这与Sauvé等^[42]的结论一致，这是因为乙酸处理中，游离态Pb含量减少，同时在其对应pH下，有机配体大量解离出来有关.

表 2 (Table 2)

表 2 小分子有机酸作用下土壤溶液中Pb的形态模拟 Table 2 Modeling of the percentage of Pb speciation in soil solution using different concentrations of LMWOAs 处理 游离Pb2+/% 无机络合态Pb/% 有机络合态Pb/% CA5 24.88 2.46 72.65 CA10 37.89 3.75 58.36 CA15 42.14 4.17 53.69 CA20 43.71 4.32 51.97 TA5 22.71 2.25 75.05 TA10 44.05 4.36 51.59 TA15 49.90 4.94 45.16 TA20 50.25 4.97 44.78 AC5 45.78 4.71 49.52 AC10 41.33 4.12 54.55 AC15 40.88 4.06 55.06 AC20 39.01 3.87 57.12

表 2 小分子有机酸作用下土壤溶液中Pb的形态模拟 Table 2 Modeling of the percentage of Pb speciation in soil solution using different concentrations of LMWOAs

土壤及土壤溶液中重金属形态对重金属的生物有效性有重要影响. 在土壤中，交换态重金属作为较为活跃的重金属，能够在其他阳离子存在环境下，被释放出来，从而被植物与土壤生物吸收并累积^[43]. 弱酸根际环境的pH值比非根际土壤低1-2个单位^[44]，另外周围变化的氧化还原电势(Eh)，都会直接影响土壤环境中微量金属元素的迁移、 转化. 本研究中，LMWOAs作为主要根系分泌物，能够增溶土壤Pb，增加了Pb在根际土壤中迁移转化活性，其中柠檬酸对于Pb释放量远大于酒石酸和乙酸，且在柠檬酸作用下，土壤中交换态Pb增加幅度最大，增加了生物有效Pb含量.

土壤溶液中的游离态Pb能通过生物膜，直接进入生物体，而部分有机结合态Pb则只能在植物根系处沿内表层破裂处，通过非原质体进入生物体内^[45]. 普遍认为土壤溶液中，游离态金属的环境风险大于有机结合态，有学者报道游离态重金属对植物体内金属总量的贡献大于有机结合态或土壤固相中重金属的贡献^[46]，并且生物自身能降解部分结构相对简单的有机结合态金属(如单齿状络合物)，进而减小有机结合态重金属生物毒性. Renella等^[47]研究表明，土壤溶液中重金属对土壤微生物的毒性作用，主要来自于游离态金属的活性，可见降低土壤溶液中游离态金属活性，对控制重金属毒害作用有重要意义. 本研究结果表明，3种LMWOAs不同程度上活化了紫色土中稳定结合的Pb，并增加土壤溶液中游离与有机结合态Pb，且有机结合态和游离态的Pb可以通过扩散和色散等作用，改变土壤溶液的饱和状态，促进土壤中Pb的进一步活化^[48]，说明LMWOAs的释放作用增加了植物吸收重金属的可能与重金属在人体内累积的风险. 根据Irving-Williams序列^[49]，土壤结合重金属的亲和力顺序为Pb²⁺>Cu²⁺>Zn²⁺>Cd²⁺，这表明LMWOAs在释放Pb²⁺的同时，同样可能释放比Pb²⁺与土壤亲和力小的其他重金属元素，从而增加了重金属元素的生物有效性. 由于重金属污染土地通常不是单一金属污染，因此LMWOAs对于复合重金属污染土壤的环境行为作用及其影响机制应该进一步研究.

在降雨等自然扰动下，土壤中不稳定结合的重金属离子有向地下水迁移的风险，从而污染地下水. 重金属在土壤中的固液平衡分配系数(K_d)，能够间接反映重金属元素迁移的环境风险：

在计算K_d时，需要作出以下假设^[50]：①固液两相的分配反应是快速可逆的. ②吸附在固体上的浓度与溶液中的浓度呈线性关系. ③K_d值独立于其他物理化学条件(pH、 离子强度、 碱度). 基于以上三条假设得出的K_d可以用来计算对流-弥散方程中的延迟系数(R)，其值越大，表明重金属在土壤中迁移转化的潜力越小^[51]：

表 3 (Table 3)

表 3 不同小分子有机酸处理的延迟系数 Table 3 Retardation factors of different LMWOAs treatments 浓度/mmol ·L-1 柠檬酸处理 酒石酸处理 乙酸处理 5 137.01 1 883.61 6 981.91 10 149.11 1 034.47 1 713.43 15 127.28 817.32 1 333.05 20 110.14 621.10 794.99

表 3 不同小分子有机酸处理的延迟系数 Table 3 Retardation factors of different LMWOAs treatments

由表 3可知，柠檬酸的延迟系数远低于酒石酸和乙酸，且随各LMWOAs浓度增加，其R值表现出降低，各有机酸的淋溶风险表现为柠檬酸$ \gg $酒石酸>乙酸，高浓度LMWOAs>低浓度LMWOAs.

柠檬酸，酒石酸，乙酸均能够释放紫色土中稳定与不稳定结合态的Pb，且柠檬酸释放能力远大于酒石酸和乙酸. 小分子有机酸作用后，紫色土中铅赋存形态发生变化，生物有效性增强； 小分子有机酸作用下，Pb的环境风险表现为柠檬酸>酒石酸>乙酸，且随浓度升高而增加. 交换态与碳酸盐结合态Pb为质子敏感型形态，铁锰氧化物结合态与有机结合态Pb为配体敏感型形态. 紫色土溶液中Pb分布由有机酸配体与体系pH值决定，分别表现为络合态和游离态的分配.