溶解性有机质(dissolved organic matter，DOM)广泛存在于自然界，其化学组成与结构十分复杂，相对分子质量(M_r)分布从几千到几十万不等. 因活跃的地球化学特性而广泛参与到污染物的环境行为中，同时也是全球碳循环的重要基础^{[1, 2]}. 一直以来，DOM的不同分子量组分，被认为是决定其光化学性质和生物可利用性的关键^{[3, 4, 5, 6]}，还影响着环境污染物的迁移、 转化甚至是生物毒性^{[7, 8, 9]}. 在加拿大湖泊、 河流和湿地系统中，甲基汞与DOM的结合主要集中在低分子量组分^[10]； 而长江口滨岸及近海水体中，胶体态DOM是控制金属元素分布的重要影响因子之一^[11]. 由此可见，对DOM不同分子量分级研究，对于进一步了解天然有机质在地球系统中扮演的环境角色，具有十分重要的意义.

近年来，对DOM分子量进行分级包括正向超滤、 场流超滤、 切向超滤等技术. 与红外光谱、 核磁共振、 质谱、 荧光光谱等技术联用可进一步分析分级后DOM的结构组成. 其中三维荧光光谱已成为分析DOM结构性质及溯源的经典手段^[12]，该技术也常用于判断城市水体水质情况^{[13, 14]}. 因此，当超滤技术结合荧光光谱分析时，可以对DOM不同分子量进行分级及定性分析，操作简便且不易破坏样品结构^{[15, 16]}.

三峡库区消落带作为全球最大的消落区，以其独特的 “干湿交替” 特征受到广泛关注，尤其因水位消涨导致的DOM输入、 输出，不但对库区生态环境质量起着重要作用，而且对库区内营养元素、 重金属及温室气体等地球化学过程发挥着重要影响^[17]. 基于此，作者所在课题组对该区域DOM的地化特征进行了初步探索^{[18, 19, 20]}. 但目前，有关该区域水体中不同分子量DOM组分的性质研究，鲜有报道. 因此有必要开展针对该区域水体中不同分子量DOM组分的定性分析.

本研究选取了三峡库区4个典型消落区采集水样，采用正向将超滤技术与三维荧光技术结合的方法，通过前者对DOM进行分子量分级，利用后者获得三维荧光光谱，旨在探讨该区域内水体DOM不同分子量组分性质结构和来源，以期为进一步揭示DOM在三峡库区水环境中的环境角色提供理论依据，同时也有助于进一步解释该消落带区域内重金属(例如汞^{[21, 22]})、 有机污染物^[23]迁移转化和温室气体排放^{[24, 25]}的相关机制.

2014年9月分别在位于三峡库区消落带的4个采样点(图 1)：处于上游地区的涪陵(FL)、 中游的忠县涂井乡(TJ)、 忠县石宝寨(SB)和下游地区的开县汉丰湖(KX)进行水样采集. 采用HDPE材质水样瓶采集水样，采样瓶预先用稀硝酸浸泡24 h以上，Millipore^® 超纯水(18.2 MΩ·cm)冲洗3次. 各采样点采集表层水样4~5 L于采样瓶中. 利用HANNA多参数水质分析仪(HI98130)现场测定pH、 EC和TDS等指标后，样品放入4℃保温箱内保存立即送回实验室冷藏备用. 为避免微生物影响，利用0.22 μm孔径醋酸纤维滤膜对水样过滤，滤液储存于1 L的棕色试剂瓶中用于超滤分级.

图 1

Fig. 1

图 1 三峡库区消落带采样地点 Fig. 1 Sampling locations in the water-level fluctuation zones of Three Gorges Reservoir areas

本研究选定膜截留量(M_r)分别为30×10³、 10×10³和1×10³超滤膜对样品进行分级处理. 参照文献[10, 16, 26]，将DOM样品划分为4个级份： ①30×10³~0.22 μm，为高分子量组分； ②10×10³~30×10³，为中分子量组分； ③1×10³~10×10³，为低分子量组分； ④<1×10³，为真溶态. 超滤膜用75%乙醇溶液浸泡20 min，然后用Millipore^® 水洗涤3次，Millipore^® 水中浸泡2~3 h直至无残留乙醇，最后再将超滤膜安置在超滤装置内进行操作. 为防止滤膜对水样干扰，在正式超滤前先超滤约100 mL超纯水，出水DOM浓度(DOC)无检出.

超滤装置采用MSC300型直流正向超滤杯进行(图 2)，超滤过程中将高纯氮气(0.1~0.2 MPa压力)通过超滤杯，且开启磁力搅拌器，收集膜上浓缩液和膜下滤液，浓缩因子取10. 按照不同分组，分别收集45~80 mL样本于100 mL棕色试剂瓶中待分析. 试验过程中用铝箔纸包裹超滤装置，避光影响. 通过该超滤装置，超滤系统DOC回收率在94.38%~100.15%之间.

图 2

Fig. 2

图 2 正向超滤装置和超滤分级步骤 Fig. 2 Ultrafiltration setups and operation procedures

溶解性有机质的三维荧光光谱的检测以Millipore^® 超纯水(18.2 MΩ·cm)作为空白，采用Horiba公司Aqualog^® 荧光光谱仪进行测定. 激发波长Ex为230~450 nm，扫描间隔5 nm； 发射波长Em为250~620 nm； 激发光源为150 W无臭氧氙弧灯； 扫描信号积分时间为3s. 样品分析中Aqualog^® 系统自动扣除瑞利和拉曼散射. 荧光峰利用Origin 8.0软件寻峰功能进行识别. DOM浓度采用GE InnovOx^® Laboratory TOC分析仪测定，以溶解性有机碳(DOC)表示，单位mg·L^-1.

根据文献[27]对荧光峰定位，分别为：激发波长/发射波长(λ_Ex/λ_Em)=250~260/380~480 nm处紫外区类腐殖质峰(A)，λ_Ex/λ_Em=330~350/420~480 nm处可见光区类富里酸峰(C)； λ_Ex/λ_Em=230/300~320 nm处短波处类络氨酸峰(B)和λ_Ex/λ_Em=230/320~350 nm处类色氨酸峰(T). 类蛋白荧光组分是内源输入标志，主要由微生物、 藻类及浮游植物等内源作用产生； 对城市水体而言，也会受到污水排放影响^{[13, 14]}； 类腐殖质荧光组分与外部陆源腐殖物质，以及底泥中腐殖质的释放有关^{[28, 29]}.

r_(A/C)为荧光峰A和C的荧光强度比值，由于A峰主要来自高荧光效率的类腐殖组分，C峰则来自相对稳定的类腐殖组分； 因此r_(A/C)值可用来反映DOM中类腐殖组分相对组成，也常用来反映DOM受光照辐射影响的变化程度^{[27, 30]}. r_(T/C)为荧光峰T和C荧光强度比值，可用以评价内源贡献比重，近几年该值也用来评估水体污染情况，人为排放污染信号较强的水体，r_(T/C)值>2.0^{[14, 31]}.

荧光指数(fluorescence index，FI)^[32]：λ_Ex=370 nm时发射波长470 nm与520 nm处荧光强度比值(λ_Ex=370 nm，F_470/520)； 当FI＞1.9时DOM来源主要以微生物、 藻类活动(内源)为主，自生源特征明显； FI＜1.4时内源贡献相对较低，主要源于外源输入.

自生源指数(autochthonous index，BIX)^{[33, 34, 35]}：λ_Ex=310 nm时发射波长380 nm与430 nm处荧光强度比值(λ_Ex=310 nm，F_380/430),该值主要反映内源的相对贡献. 当BIX在0.6~0.8之间时，表明样品中自生源贡献较少； 在0.8~1.0之间时，表明存在较多新生的自生源DOM； 而当BIX＞1.0时，表明DOM主要源于自生源且有机质为新近产生.

腐殖化指数(humification index，HIX)^[36]：λ_Ex=254 nm时发射波长435~480 nm间区域积分值(∫_435-480)除以300~345 nm间区域积分值(∫_300-345)与435~480 nm间区域积分值(∫_435-480)之和，常用来表征DOM腐殖化程度，HIX值越高，说明DOM腐殖化程度越高.

荧光峰定位采用Orgin 8.5 Peak Pick寻峰功能找峰，荧光图谱采用Origin 8.5绘制，相关数据处理及统计分析采用SPSS 17.0和Excel 2013进行.

采用溶解性有机碳含量(DOC)表示DOM浓度，DOM浓度的空间分布差异较大，变异系数达47.38%. 4个采样点水样平均DOC浓度以涪陵最高(11.57 mg·L^-1，见表 1)，这可能和该采样区域受周边农业小流域输入有关^[37]. 未分级前，各区域水体中DOC浓度(<0.22 μm)差异明显(P<0.05)，大小关系为：涪陵珍溪>开县汉丰湖>忠县石宝寨>忠县涂井. 各分子量等级DOC浓度也随地点变化遵循同样趋势：上游(涪陵)>下游(开县)>中游(忠县). 另外，各级分DOM浓度百分比(质量分数)中，真溶态(<1×10³)和胶体组分(1×10³~0.22 μm)所占比例相当，前者为41%~56%，后者为44%~59%(表 1). 而胶体组分中，又以中、 低分子量组分为主. 由此可知，对于消落带DOM而言，真溶态和胶体态DOM均对DOC总质量贡献相当.

表 1(Table 1)

表 1 三峡库区水样溶解性有机碳(DOC)分级浓度及对总DOC贡献比 Table 1 Concentration of DOC fractionation in the Three Gorges Reservoir Region and its contribution rate to total DOC 不同分子量组分 涪陵珍溪 忠县涂井 忠县石宝寨 开县汉丰湖 浓度/mg·L-1 贡献比/% 浓度/mg·L-1 贡献比/% 浓度/mg·L-1 贡献比/% 浓度/mg·L-1 贡献比/% <0.22 μm (总) 11.57 100 3.79 100 6.06 100 6.35 100 30×103~0.22μm (高) 1.54 13.31 1.04 27.44 1.24 20.46 1.40 22.05 10×103~30×103 (中) 1.42 12.27 0.55 14.51 0.92 15.18 1.10 17.32 1×103~10×103 (低) 2.08 17.98 0.51 13.46 0.98 16.17 1.24 19.53 <1×103 (真) 6.53 56.44 1.69 44.59 2.93 48.35 2.62 41.26

表 1 三峡库区水样溶解性有机碳(DOC)分级浓度及对总DOC贡献比 Table 1 Concentration of DOC fractionation in the Three Gorges Reservoir Region and its contribution rate to total DOC

有报道指出，加拿大东安大略省及西魁北克的湖泊、 河流及湿地水体中，高分子量组分(30×10³~0.2 μm)分别占总DOC的17.43%、 34.45%和26.74%^[10]，而消落带水体高分子组分所占比例13.31%~27.44%. 开县汉丰湖(22.05%)和忠县涂井(27.44%)，为消落带回水区，陆生植被茂盛，是DOM的主要贡献者，这与湿地情况类似，其值也较接近； 而涪陵珍溪和忠县石宝寨位点位于长江主航道，但值与文献[10]中湖泊报道近似. 将DOM简单分为胶体和真溶态两部分，与其他区域水体DOM比较见表 2. 与海洋相比，消落带水体中DOM胶体比例更大，与淡水系统类似. 这种差异与DOM输入来源有关，从淡水到海洋，输入来源逐渐单一化，尤其是深海远洋，“内源”(微生物及藻类活动)贡献明显，相对于陆源输入物质而言，胶体含量较低，而频繁的光化学反应，使得大分子降解为小分子，真溶态组分增加. 同时也进一步证明，陆源输入(尤其是径流)是水中有机胶体的主要来源.

表 2(Table 2)

表 2 文献及本研究中结果比较 Table 2 DOC comparison between this study and historic references 水体 国家 DOC/mg·L-1 胶体组分/% 真溶态组分/% 文献 长江口滨岸及近海 中国 0.23 18.8 81.21 [11] 长江口南支 中国 2.26~2.99 33.10~45.88 54.12~67.90 [38] 珠江口 中国 1.30~3.77 2.5~32.7 67.3~97.5 [4] 黄河洛口 中国 2.74 81.70 18.30 [39] 钱塘江盐官 中国 1.28 44.20 55.80 [39] 长江吴淞口 中国 3.97 59.80 40.20 [39] 黄南河 中国 0.36~1.50 6.80~56.60 43.40~93.20 [40] 夏威夷Oahu海域深海 美国 0.98(10 m)0.46(765 m)0.49(4 000 m) 33(10 m)25(765 m)22(4 000 m) 67(10 m)75(765 m)78(4 000 m) [41] 东安大略省及西魁北克 加拿大 6.8(湖泊)10.4(河流)17.5(湿地) 50.33(湖泊)51.56(河流)51.78(湿地) 49.67(湖泊)48.44(河流)48.22(湿地) [10] 缅因湾 美国 0.14~0.34 17.29~27.49 72.51~82.71 [42] 罗纳河三角洲 法国 0.09~0.53 8.19~30.43 69.57~91.81 [43] 三峡消落区涪陵珍溪 中国 11.57 43.56 56.44 本研究 三峡库区忠县涂井 3.79 55.41 44.59 本研究 三峡库区忠县石宝寨 6.06 51.65 48.35 本研究 三峡库区开县汉丰湖 6.35 58.74 41.26 本研究

表 2 文献及本研究中结果比较 Table 2 DOC comparison between this study and historic references

4个采样区域样本均出现类腐殖质A、 C峰和类蛋白B、 T峰(图 3)，这与长江河口研究结果类似^[38]. 有研究发现超滤可将原有难以显现的荧光峰进行区分^{[44, 45]}，使得未分级水样中荧光峰的“掩盖效应”降低； 但本研究中并未发现类似情况. 这可能是由于和近海^[44]及腐殖化程度较高的沼泽水体^[45]相比，消落带水体DOM分子量分布分散程度较高. 尤其在真溶态(<1×10³)，仍能发现两类荧光峰信号，根据天然有机质的“自组装理论”^[46]，进一步证明该区域DOM分子是由不同分子量的“亚单位”结构组装而成的连续体系，而非离散体系.

图 3

Fig. 3

图 3 DOM整体及不同分子量组分的三维荧光光谱 Fig. 3 3-D fluorescence spectra of bulk DOM and different molecular weight fractions

对不同区域水体而言，不同DOM分子量组分的r_(A/C)值变化趋势较为一致(表 3)：大多数r_(A/C)值随DOM分子量降低而减小，说明在高分子量部分，除较为稳定的C峰外； 相对“年轻”的类腐殖质A峰也是重要组成部分； 即具有较高降解潜能的DOM组分主要分布在大分子胶体中. 由于C峰对光敏感程度强于A峰，因此结构复杂的大分子组分更易被光降解成低分子量DOM，导致r_(A/C)值升高，该指标也常用以评估DOM光降解情况^[30]. 有研究也报道了高分子量DOM更易发生降解^[47]. 本研究中，高r_(A/C)值主要集中在高分子组分(表 3)，因此该组分具有较高光降解潜能，光化学行为也可能较为频繁.

表 3(Table 3)

表 3 不同分子量等级DOM的r(A/C)和r(T/C)值 Table 3 Fluorescence spectra parameters of different size fraction of DOM samples 分子量等级 涪陵珍溪 忠县涂井 忠县石宝寨 开县汉丰湖 r(A/C) r(T/C) r(A/C) r(T/C) r(A/C) r(T/C) r(A/C) r(T/C) <0.22 μm (总) 2.76 2.86 2.80 2.31 2.51 2.30 2.35 3.12 30×103~0.22 μm (高) 2.77 2.24 2.61 2.30 2.63 1.93 2.72 2.43 10×103~30×103 (中) 2.57 2.07 2.65 1.93 2.59 1.71 2.49 1.38 1×103~10×103 (低) 2.58 1.45 2.50 1.74 2.51 2.30 2.47 1.22 <1×103 (真) 2.51 3.42 2.43 2.96 2.33 2.01 2.55 2.58

表 3 不同分子量等级DOM的r(A/C)和r(T/C)值 Table 3 Fluorescence spectra parameters of different size fraction of DOM samples

同时结合表 1，对比4处样本，忠县涂井和开县汉丰湖胶体组分最多(55.41%和58.74%)，其中高分子组分(30×10³~0.22 μm)所占比例也最高，因此可以推测，在相近DOC浓度情况下，前两处DOM光化学活性较其他两处高，参与环境光化学过程(例如光降解及自由基形成)更为积极. 忠县石宝寨和涪陵珍溪相比，高分子组分比例较多(20.46%)，但r_(A/C)小于后者，表明该处DOM光反应程度较高、 潜能降低，这可以部分解释由于甲基汞光降解与DOM光化学活性密切相关，忠县甲基汞光降解年际通量[2.8 μg·(m²·a)^-1]显著高于涪陵珍溪[1.1 μg·(m²·a)^-1]^[48].

另外，所有样本中真溶液(<1×10³)和高分子组分(30×10³~0.22 μm)的r_(T/C)值均>2.0，部分点位在中分子量(10×10³~30×10³)和低分子量(1×10³~10×10³)中出现r_(T/C)>2.0. 由此可见，受排放方式和种类的影响，库区消落带DOM不同程度地受到人为排放污染影响，尤其是开县汉丰湖.

由于荧光强度间接代表荧光物质相对含量^[26]，参照文献[26, 44]，计算不同分子量单一荧光组分所占比重 (图 4). 不同采样点，类腐殖质及类蛋白组分在不同分子量等级中的分配均呈现出类似趋势：真溶态(<1×10³)>低分子量组分(1×10³~10×10³)>中分子量组分(10×10³~30×10³)>高分子量组分(30×10³~0.22 μm)，由此可知，两个组分主要以胶体态(1×10³~0.22 μm)存在，所占比例为64%~70%和51%~69%. 通过对比发现，中(10×10³~30×10³)和低分子量(1×10³~10×10³)部分又是这两类组分在胶体中主要分布范围. 与其是类蛋白组分，这和文献中Seine及Gironde海湾的研究结果类似^[44]. 在相应的荧光图谱中(图 3)，也可以看到中、 低分子量组分两类荧光峰信号明显增加.

图 4

Fig. 4

图 4 三峡库区水体中荧光物质在不同分子量等级的分配情况 Fig. 4 Distribution of fluorescence substances in different size fractions from the Three Gorges Reservoir Region

整体上(<0.22 μm)4个采样点FI值在1.4~1.9之间(表 4)，说明内源和外源输入对DOM的组成均有影响； 其中忠县石宝寨FI值最高，而BIX也反映出该点样本中存在较多新生自生源特征； 而高HIX值和低FI值表明涪陵珍溪样本腐殖化程度最高，内源贡献相对较小. 这种差异性和周边土地利用类型、 以及生态系统有关^{[20, 37]}. 涪陵珍溪采样点位于长江干流，为典型农业小流域集水区出口. 该流域内土地利用类型主要为人工林、 菜地及农田生态系统，由于长期使用腐熟肥料提高地力，土壤腐殖化程度较高，陆源输入发生时，直接导致相邻水体中陆源输入特征明显； 而忠县石宝寨，沿岸以农田坡耕地为主，大量种植经济作物，大量粪肥施用，土壤中营养物质积累，微生物活动较活跃，使得蛋白质含量增加，当径流发生时，直接导致相邻水体内源代谢活动增强，自生源特征明显； 而开县汉丰湖采样点为长江回水区且位于城区内，两岸次生植被生长繁茂，城市废水管网也途经该处，人为活动干扰明显，尽管“干-湿交替”会带来外源贡献，但是人为污染(例如污水排放等)使得该处内源信号同样明显. 另外，忠县涂井为回水区，沿岸以人工林和少量农用坡耕地为主，相对封闭，因此相比而言，陆源输入不及涪陵珍溪，内源输入和人为影响又不及忠县石宝寨和开县汉丰湖.

表 4(Table 4)

表 4 各采样地不同分子量等级溶解性有机质的荧光特征参数 Table 4 Fluorescence spectra parameters of different size fractions from four sampling sites 分子量等级 涪陵珍溪 忠县涂井 忠县石宝寨 开县汉丰湖 FI BIX HIX FI BIX HIX FI BIX HIX FI BIX HIX <0.22 μm (总) 1.52 0.72 1.18 1.53 0.76 0.96 1.62 0.96 1.19 1.55 0.68 0.99 30×103~0.22 μm (高) 1.45 0.70 1.31 1.60 0.80 1.58 1.63 0.80 1.52 1.54 0.67 1.51 10×103~30×103 (中) 1.62 0.71 1.08 1.61 0.69 1.14 1.64 0.83 1.10 1.51 0.60 1.16 1×103~10×103 (低) 1.62 0.75 1.10 1.66 0.70 1.19 1.68 0.87 0.81 1.58 0.74 1.15 <1×103 (真) 1.73 0.84 0.98 1.85 0.88 0.46 1.87 1.18 1.08 1.72 0.81 0.60

表 4 各采样地不同分子量等级溶解性有机质的荧光特征参数 Table 4 Fluorescence spectra parameters of different size fractions from four sampling sites

对不同分子量组分的荧光特征值进行比较发现(表 4)，所有样本随分子量降低，FI和BIX值增加，HIX值降低，这与r_(A/C)趋势一致. 由此可知，陆源输入的腐殖质等物质主要影响DOM大分子组分构成，芳香性结构含量较高； 而内源输入和人为污染干扰，主要为类蛋白物质及随着分子量降低，影响越发显著(图 5).

图 5

Fig. 5

图 5 各采样地不同分子量等级DOM的FI-BIX分布 Fig. 5 BIX-FI distribution of different molecular size fractions of DOM from four sampling sites

研究表明，利用DOM荧光强度与DOC之间存在线性关系，可反演DOC含量^{[49, 50]}. 但本研究中，各分子量中荧光峰与DOC无明显相关(P>0.1)，仅未分级DOM(<0.22 μm)中类腐殖峰A、 C与DOC存在相关性(P=0.04; P=0.07)，多重线性回归分析显示，A、 C组分能解释该区域内74.03%的DOC变化，对DOC贡献起主要作用. 另外，类蛋白峰与DOC无明显相关，这可能由于类蛋白峰属于易降解组分，且来源较为复杂(包括水体内源活动和人为污染影响)，对于内陆水体而言，其含量波动较大，较难发现该荧光组分和DOC的明显相关性，这与海洋底泥间隙水DOM的研究发现不同^[50]. 后者类蛋白组分来源输入单一，降解和耗损途径简单，含量相对稳定.

(1)三峡库区消落带DOM中胶体和真溶态组分均对DOC总量的贡献相当. 不同分子量级分中均存在荧光峰A、 C、 B、 T，其分配均为：真溶态(<1×10³)>低分子量组分(1×10³~10×10³)>中分子量组分(10×10³~30×10³)>高分子量组分(30×10³~0.22μm). 大多数r_(A/C)值随DOM分子量降低而减小，而r_(T/C)显示人为污染来源主要集中在大分子组分和真溶态.

(2)该区域所有DOM样本，组成和结构较为“传统”，各分子量分组存在较连续的特征变化趋势. DOM随超滤分子量等级降低，FI和BIX值增加，“内源”输入特征增强； 腐殖化程度降低(HIX值下降). 陆源输入主要影响大分子组分，而内源输入主要影响低分子及真溶态部分.

(3)沿岸不同土地利用类型对水体DOM性质和组成影响明显. 土地利用类型多样性、 生态景观结构复杂程度越高，水体DOM不同分子量等级中各荧光组分也越复杂.

(4)本研究将超滤和三维荧光光谱联用，对不同分子量组分DOM进行了辨识和溯源. 作为库区DOM长期定位观测研究工作的一部分，下一步工作将集中在了解DOM不同分子量组分和污染物环境行为之间的关系上,而理清这些组分的不同输入来源，有助于进一步认识三峡库区消落带中污染物迁移转化行为的机制，同时也为该区域内环境污染的防控提供一定的研究基础和理论背景.