免疫传感器由于具有灵敏度高、 特异性强、 检测速度快、 无需或仅需简单样品预处理等特点，已发展成为分析微量/痕量环境特征污染物的前沿技术^[1]. 现有大多数的免疫分析都是在水溶液中进行的，这主要是由于抗体等生物大分子在水溶液中能保持较好的反应活性，有利于免疫反应的进行^[2]. 然而，环境中内分泌干扰物(EDCs)和持久性有机污染物(POPs)等特征污染物在水中的溶解度是非常有限的，如双酚A(bisphenol A，BPA)、 多氯联苯和芳香烃等. 特别是在检测土壤、 污泥和食品中的该类污染物时，无论是使用传统的方法还是免疫传感器，常常需要使用有机溶剂对待测样品进行适当的预处理，包括萃取分离与富集等^{[3, 4, 5, 6]}. 为运用免疫传感器直接快速分析此类样品，就需要考察有机溶剂对免疫传感分析的影响. 目前，该方面的研究极为有限，一般认为低浓度的有机溶剂对免疫分析的影响不大^[2]，且不同有机溶剂对免疫反应的影响也不尽相同. 深入地研究并阐明有机溶剂对环境特征污染物免疫分析的影响机制，不仅可以大大拓宽免疫传感器在环境检测中的应用范围，而且可为复杂环境特征污染物的免疫传感分析提供重要的理论基础，具有显著的科学意义和实用价值.

本研究利用前期发展的倏逝波全光纤免疫传感系统考察了不同有机溶剂对双酚A免疫传感分析的影响并初步探讨了影响机制. 倏逝波光纤生物传感器是利用光波在光纤内以全反射方式传输时在光纤传感器所处的介质中产生的倏逝波，该倏逝波可以激发光纤传感器表面连接的抗体/抗原标记的荧光物质，同时结合免疫反应原理，实现待测目标物质的定量检测^{[7, 8]}. 本研究之所以选择BPA作为研究对象，是因为BPA是最为重要的化工原料之一. 它主要用于生产聚碳酸酯、 环氧树脂、 聚砜树脂等多种高分子材料，也被用于生产增塑剂、 抗氧剂等一系列化工产品^[9]. 更为重要的是，BPA也是制造婴儿奶瓶、 水瓶、 其他食品和饮料容器等与生活息息相关的日常用品的关键物质，残留的BPA可通过食物或饮料被摄入机体，从而对健康造成潜在的危害^[10]. 具有类似雌性激素作用的BPA不仅可导致各种生殖异常和扰乱生物正常内分泌功能，而且可致癌或致婴幼儿性早熟^{[11, 12]}. 鉴于双酚A在环境中的广泛存在性及危害，为保障环境和食品安全，发展适应于非水溶液中双酚A灵敏度高、 特异性强、 快速检测新技术显得尤为重要^{[13, 14]}. 乙腈和正己烷分别是提取有机污染物常用的极性和非极性有机溶剂，本研究着重考察这两种有机溶剂对BPA免疫传感分析的影响.

所有试剂均为分析纯或更好. 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)、 戊二醛、 BPA、 牛血清蛋白(BSA)、 二甲基甲酰胺(DMF)均购自Sigma中国公司. 浓硫酸、 过氧化氢、 甲苯、 正己烷、 乙腈购自北京化学试剂公司. pH=1.9的SDS溶液，PBS缓冲溶液由本实验室配制. OVA-BPA和Cy5.5标记抗BPA抗体均为课题组自行制备^[9]. 为配制BPA标准样品，准确称取0.1 mg BPA，用10 μL的DMF溶解，然后使用PBS缓冲溶液定容，配制成1 mg ·L^-1 BPA储备液备用.

600 μm石英光纤(NA=0.22，南京春辉)； 烘箱； 氮吹仪； 倏逝波全光纤传感器.

配制Piraha溶液(浓H₂SO₄ ∶H₂O₂=3 ∶1)，将探头浸入其中30 min； 然后放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，然后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用.

为进行免疫分析，须将抗体或抗原固定到探头表面上，本实验采用的是固定抗原法. 按照文献中的方法^{[15, 16]}，先将探头硅烷化，将探头放入含2％APTS的甲苯溶液中反应2 h，后用甲苯溶液清洗3次，氮吹，并在120℃的烘箱中烘1 h，然后将光纤传感器放入5%的戊二醛溶液中反应1 h，洗净. 最后，将探头放入1.5 mg ·mL^-1的OVA-BPA中过夜反应，用超纯水冲洗后，放入4 mg ·mL^-1 BSA溶液中2 h以封闭非特异性吸附位点. 制备好的光纤放在4℃冰箱保存备用.

采用间接竞争抑制的方法对BPA进行免疫传感分析. 首先，将一定体积的不同浓度(0.1、 0.3、 1、 3、 10、 30、 100 μg ·L^-1)的BPA溶液分别与一定体积和浓度的Cy5.5荧光标记抗体混合，预反应5 min. 然后将预反应后的混合物输入到样品池(20s). 停止进样后，荧光标记抗体继续与光纤传感器表面修饰的包被抗原反应，系统检测到的信号继续增大. 考虑检测周期和信号值大小，取10 min时的信号值作为检测的有效信号值. 检测完成后，使用0.5% SDS溶液(pH 1.9)对光纤传感器表面进行再生. 一个样品的检测周期约为20 min(包括进样、 检测和传感探头再生过程). 为绘制标准曲线，将使用系列标准样品得到的荧光信号值归一化，然后使用4参数Logistic方程拟合，绘制BPA的检测标准曲线.

为有效考察有机溶剂对BPA免疫传感分析的影响，选择BPA检测标准曲线的线性区间浓度值进行有机溶剂影响实验. 为消除样品配制和仪器系统的影响，每次检测时，同时设置一组空白实验作为对照. 有机溶剂则选取了乙腈和正己烷作为研究对象，分别考察了有机溶剂含量为1%、 2%、 5%和10%的情况下传感器系统检测荧光信号值的结果. 与之前实验中BPA的检测程序相同，只是预反应过程中在BPA和荧光标记抗体的混合溶液中加入不同体积分数(0%、 1%、 2%、 5%、 10%)的有机溶剂混合，预反应5 min.

如方法部分所述，BPA光纤传感器是采用固定BPA包被抗原的方法进行修饰的. 图 1是一条典型的BPA荧光标记抗体与BPA包被抗原特异性结合的反应曲线，实时反映了标记抗体与光纤传感器固定抗原的动态反应过程. 在进样期间，仪器检测到的荧光信号迅速增大，停止进样后，仪器检测到的荧光信号随反应进程继续升高，但增幅逐渐回落，并逐渐达到一种平衡状态. 这是固液界面传感分析过程中典型的免疫反应曲线，反映了溶液中的荧光标记抗体与光纤传感器表面抗原结合的动力学过程. 由于激发光是一直开启的，因此，该仪器能够实时检测抗体抗原之间的亲和动力学过程，为后续有机溶剂对免疫传感分析的影响研究提供了良好的技术基础.

图 1

Fig. 1

图 1 BPA的免疫传感分析特征曲线 Fig. 1 Typical curve of BPA immunoassay

为考察BPA包被抗原的固定效果及BPA抗体抗原特异性亲和反应，本研究进行了几组对照实验，结果如图 2所示. 当0.4 μg ·mL^-1荧光标记抗微囊藻毒素抗体输入样品池时，传感器没有检测到明显的荧光信号，这不仅表明荧光标记抗体不会非特异性吸附到光纤传感器表面，而且由于倏逝波的渗入深度有限，溶液中的荧光染料很少被激发，对仪器系统检测的荧光信号值贡献很少. 然后，将0.4 μg ·mL^-1荧光标记的BPA抗体输入到样品池，仪器检测到的荧光信号值与仪器基线值比可以达到3以上. 而当0.4 μg ·mL^-1荧光标记的BPA抗体与100 μg ·L^-1 BPA混合反应后输入到样品池，仪器检测到信号值明显降低. 这说明大部分荧光标记抗体的亲和位点已被溶液中BPA结合，不能再与光纤传感器表面的抗原结合. 以上结果不仅表明传感器系统检测到的信号值来自BPA抗原抗体之间的特异性反应，而且进一步证明了游离的荧光分子不会对检测信号值产生明显影响.

图 2

Fig. 2

图 2 光纤传感器BPA包被抗原修饰效果表征 Fig. 2 Characterization of optic fiber sensor modified by the coated-antigen of BPA

为有效评价有机溶剂对BPA免疫传感分析的影响，传感器良好的再生与重复使用性能至关重要. 该研究中采用固定包被抗原方法，避免了传统传感器修饰抗体的局限性，即苛刻的再生试剂导致传感器的再生性能差，仅可重复使用几次. 本研究已通过大量的实验表明，使用该修饰方法可使得传感器至少可以使用100次以上^[9]，而且不会明显影响传感器的检测性能. 图 3为连续检测后的再生性能曲线，可以看出经过多次检测后信号值并没有明显的下降.

图 3

Fig. 3

图 3 BPA-OVA修饰的光纤探头再生性能验证 Fig. 3 Verification of regeneration performance of the optical fiber probe modified by BPA-OVA

图 4是使用倏逝波全光纤免疫传感检测BPA的标准曲线，每个点的值均用空白值归一化，然后使用4参数Logistic方程拟合，曲线呈现明显的反S型. 从中可以看出，在间接竞争检测模式下，系统检测到的荧光信号随BPA浓度的提高而降低，该系统的检测限(LOD)可达 0.2 μg ·L^-1. 定量检测区间为0.3～33.4 μg ·L^-1. 因此，在后续实验中，选取线性区间内的浓度(1、 3、 10 μg ·L^-1)进行有机溶剂的影响研究.

图 4

Fig. 4

图 4 倏逝波全光纤免疫传感系统检测双酚A的标准曲线 Fig. 4 Standard curve of BPA detection by evanescent wave all-fiber immunosensing system

图 5是乙腈对倏逝波光纤免疫传感器检测双酚A的影响实验结果. 当乙腈加入检测体系后，无论乙腈含量和BPA的浓度如何，传感器系统检测的信号都有所升高. 这表明当检测体系加入乙腈时，BPA抗体与光纤传感器表面包被抗原的结合效率有所提高，而溶液中BPA与BPA抗体的结合效率降低. 当乙腈的含量为1％和2％时，虽然传感器的检测信号比未添加乙腈的检测信号有所升高，但传感器检测信号随BPA浓度的升高而降低，具有较好的线性关系. 因此，在一定条件下，该传感器仍然能用于BPA的检测. 当乙腈含量提高到5％以上时，乙腈对传感器检测的影响越来越大，传感器检测信号已与BPA浓度无关，并趋于稳定，这表明溶液中BPA已不能与BPA抗体结合. 但是，BPA抗体仍然能与光纤传感器表面固定化的包被抗原结合.

图 5

Fig. 5

图 5 乙腈对倏逝波全光纤免疫传感系统检测BPA的影响 Fig. 5 Effect of acetonitrile on BPA detection using evanescent wave all-fiber immunosensing system

从图 6可知，实验浓度下的正己烷加入体系后，系统检测的信号值相较于未添加时变化并不大，其检测信号随BPA浓度增加而降低，传感器检测信号与BPA浓度具有较好的线性关系. 总体来说，正己烷含量为5%和10%时比含量为1%、 2%影响略大，但是，添加正己烷的体系传感器检测到的信号值相较于未添加的体系检测信号值来说，总体偏差基本都在10%以内. 因此，正己烷对于倏逝波全光纤免疫传感系统的检测性能影响不大，可以用于非水溶液、 固相或半固相样品的萃取试剂，经一定浓度稀释后，可以进行特征污染物的直接检测.

图 6

Fig. 6

图 6 正己烷对倏逝波全光纤免疫传感系统检测BPA的影响 Fig. 6 Effect of n-hexane on BPA detection using evanescent wave all-fiber immunosensing system

抗体与抗原之间的亲和反应和酶与底物之间的结合一样，不属于化学反应，而是非共价键之间的可逆性结合^[2]. 抗原决定簇和抗体分子的可变区(Ⅴ区)互补构型，使得抗体抗原之间具有较强的亲和力，空间构型互补程度不同，结合力就不同，这与酶与底物的结合是相类似的^{[2, 17]}. 有研究表明^{[17, 18]}：与传统观念不同，在一定条件下，有机溶剂并不一定会使蛋白变性，酶在部分有机溶剂中可比在水溶液的催化性能更佳，这是因为水几乎参与了所有的非共价键作用，但对水的需求量其实仅限于蛋白质的亲水基团与水分子结合的那部分，剩余的那部分水完全可以由有机溶剂代替^{[19, 20, 21, 22, 23]}. 因此，考虑抗体与酶一样均属于蛋白质类，抗体抗原免疫亲和反应理论上讲也可以在一定比例的有机溶剂中进行. 本实验结果也证明了这一点，在低浓度的乙腈和较高浓度的正己烷溶液中，均可实现小分子有机污染物的免疫传感检测.

但不同的有机溶剂、 不同含量的有机溶剂对免疫反应的影响是不同的. 乙腈对免疫传感检测影响较大，而正己烷的影响较少，这与选取的乙腈和正己烷两种典型有机溶剂亲水性能可能是密切相关的^[24]. 研究表明，蛋白质分子带有负电荷，其亲水基团与水分子结合，在蛋白质分子外形成了一层水膜，当加入受体后，蛋白质配体与受体对应的极性相互吸附而得以结合^{[18, 25]}. 正己烷属于非极性溶剂，几乎不溶于水,很难取代蛋白质分子外层的水膜. 而乙腈是极性溶剂，可与水完全互溶,当加入检测体系后，乙腈可能取代了一部分结合在抗体表面的水分子，从而导致抗体构象的改变或者抗体与抗原的亲和力变化，因而对传感分析体系信号值产生较大的影响^{[18, 26]}. 但是，这种亲和力的改变对均相和固液表面免疫结合的影响是不同的. 从本实验结果看，加入乙腈浓度较低时，传感器检测信号升高，这表明乙腈可能促进固液表面抗体抗原的结合； 然而，当乙腈浓度较高时，明显抑制溶液中的抗体抗原结合，具体机制有待进一步详细研究.

(1)使用倏逝波全光纤免疫传感系统实现了BPA的超灵敏检测，其检测限可达0.2 μg ·L^-1，定量检测区间为0.3~33.4 μg ·L^-1. 以BPA包被抗原修饰的光纤传感器能实时反映抗体抗原固相表面的反应动力学过程，并具有良好的再生性能.

(2)乙腈对BPA免疫传感分析有较大影响，当其浓度较低时，传感器系统检测信号随BPA浓度的提高而降低，具有一定的线性关系，可以用于BPA的定量检测. 而当乙腈浓度较高时，其可完全抑制均相溶液中抗体抗原之间的亲和反应，但对固液界面的抗体抗原亲和反应影响不大，此时，已完全不能用于BPA的定量分析. 其原因可能是乙腈取代了一部分结合在抗体表面的水分子，从而导致抗体构象的改变或者抗体与抗原的亲和力变化.

(3)己烷含量高达10%都不会对BPA免疫传感分析产生明显影响，可能是由于正己烷是疏水性的，其与水不互溶. 因此，正己烷可用于食品或固相环境样品中BPA的萃取，然后在稀释一定倍数后，直接用于BPA的免疫传感分析. 研究成果为拓宽免疫传感器的应用范围提供良好的理论基础和数据支持.