病毒、 细菌、 真菌、 原虫和蠕虫等病原体作为主要的致病介质，对全世界的公共健康构成威胁^[1]. 虽然病原体是水质检测的一项重要指标，但是基于病原体检测费用高且检测手段复杂等原因，实际操作过程中对很多病原体(如病毒)几乎不定量分析. 通常，大多数病原体仅通过粪源指示菌(fecal indicator bacteria,FIB)进行表征，或者通过FIB和病原体的简单关系预测目标病原体的真实浓度^[2]. 然而，研究表明： FIB和病毒并没有直接的相关性^[3].

随着聚合酶链式反应(PCR)技术的不断发展，研究人员开始着手从分子水平探讨环境水体病原体的组成和浓度水平，如对大肠杆菌^[4]、 军团菌^[5]、 腺病毒^[2]和贾第虫^[6]等的研究. 另外，随着各种核酸染料的不断出现和新技术的不断发展，近些年来许多学者利用流式细胞术(flow cytometry，FCM)对水体中细菌^[7]和病毒^[8]进行研究. 表 1概述了近5年来水体病原体研究的主要对象、 内容及手段. 从中可以看出，定量 PCR和FCM是当前病原体研究中所采用的主要手段.

表 1(Table 1)

表 1 近5年环境水体中病原体研究概况 Table 1 Summary of water pathogen research in recent five years 环境水体 研究内容 研究手段 文献 污水 贾第虫、 隐孢子虫 PMA-qPCR、 qPCR [9] 污水 贾第虫和隐孢子虫 qPCR [10] 含有病原微生物的水体 贾第虫和隐孢子虫 光学显微镜法 [11] 河水 贾第虫和隐孢子虫 流式细胞术、 荧光显微镜法、 PCR [12] 污水处理厂污水 军团菌 荧光显微镜、 qPCR [13] 给水厂进出水、 河水 腺病毒、 多瘤病毒 qPCR [14] 水源水 埃希氏大肠杆菌、 鼠疫沙门氏菌、 空腔弯曲杆菌、 铜绿假单胞菌、 福氏志贺菌 qPCR [15] 农业灌溉用水 人类特异性拟杆菌、 大肠杆菌、 肠球菌、 耐热型大肠杆菌、 体细胞和 F+噬菌体、 腺病毒和诺瓦氏病毒 平板培养法、 多管发酵法、 细胞感染法、 RT-PCR、 qPCR [2] 城市洪水 空腔弯曲杆菌、 贾第虫、 隐孢子虫、 诺瓦氏病毒、 肠道病毒 平板培养法和PCR、 荧光显微镜法、 培养法和PCR [16] 湖水 大肠杆菌、 弯曲杆菌、 志贺氏菌、 沙门氏菌 qPCR [17] 活性污泥 病毒 流式细胞术 [18] 污水处理厂各阶段水 病毒和细菌 流式细胞术 [19] 饮用水 细菌 流式细胞术 [20, 21] 受微生物污染的海岸 腺病毒、 肠道病毒 细胞感染、 qPCR、 Nested-PCR、 RT-PCR [22]

表 1 近5年环境水体中病原体研究概况 Table 1 Summary of water pathogen research in recent five years

FCM和定量PCR(qPCR)两种方法各有特点：FCM可以高效灵敏地检测样品中细菌总数和病毒总数； qPCR可以准确地对每一类病原体进行相对定量分析. 前者从宏观角度判别病原体污染情况； 后者从微观角度论证病原体污染水平. FCM和qPCR的联用，不仅可以较为准确地检测水体中总细菌和总病毒浓度水平，而且能对典型病原体进行定量，使得检测结果更加具有说服力. 传统检测方法中，以粪源菌检测为主，而忽视其他原虫、 病毒类病原体的检测，FCM-qPCR方法兼顾三类病原体使得检测内容更加丰富； 选择具有代表性的典型病原体，使得检测对象更加具有针对性，进而加快了检测的速度； 与传统的细胞培养法检测细菌总数相比，FCM-qPCR方法更加快捷也相对更加准确； 传统方法中，很难对病毒总数进行检测，FCM-qPCR方法实现了对病毒总数的检测.

基于前人研究成果，本研究将建立流式细胞术和定量PCR联用方法，用于快速准确获取水环境中总细菌、 总病毒及大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫等病原体的浓度水平； 并将该方法应用到北京市某污水处理厂进出水及受纳河流上下游病原体的检测中.

水样采于北京市某污水处理厂进水、 出水口以及排水的受纳河的上下游(以排水口为界)约200 m处的河道，采样时间为2015年4月23日.

取1 mL水样装入1.5 mL棕色样品瓶中，然后向样品瓶中加入戊二醛(终浓度为0.5%)固定水样中微生物，用于测定水样中总细菌和总病毒浓度； 取4 L水样装入4 L棕色玻璃瓶中，用于提取水中总DNA. 将容器中的水样低温保存并在8 h内运送到实验室.

将盛有水样的1.5 mL棕色样品瓶放进-80℃冰箱内备用. 从4 L棕色瓶中取出一定量水样，先使用真空抽滤装置对水样进行抽滤(过0.45 μm聚醚砜滤膜)； 然后，将滤过水样的滤膜收集在MO-BIO PowerWater Bead Tubes(研磨管)中； 最后，按照试剂盒(PowerWaterDNA Isolation Kit，MO-BIO公司)操作要求提取总DNA.

常规水质分析，包括总氮(TN)、 氨氮(NH₄⁺-N)、 硝态氮(NO₃^--N)、 总磷(TP)、 溶解性磷酸盐(SRP)、 总有机碳(TOC)和化学需氧量(COD)的检测.

TN测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法^[23]； NH₄⁺-N测定采用水杨酸分光光度法^[23]； TP和SRP测定采用钼酸铵分光光度法^[23]； COD测定采用快速消解分光光度法； NO₃^--N测定采用离子色谱法^[23]； TOC测定采用干式氧化法.

TN、 NH₄⁺-N、 TP、 SRP和COD测定使用紫外/可见光分光光度计(U-3010，日立)； NO₃^--N测定使用离子色谱仪(ICS-2000，赛默飞)； TOC使用总有机碳分析仪(TOC-V_CPH，岛津).

在使用FCM分析细菌和病毒时，样品稀释是较为关键的一步^[24]. 鉴于当FCM检测速度为100~1 000 particles ·s^-1时，可以有效地减少检测误差^[8]. 使用TE溶液(10 mmol ·L^-1 Tris-HCl，1 mmol ·L^-1 EDTA pH=8.0； 30×10³超滤膜过滤)作为稀释缓冲溶液，对4类水样采用不同比例的稀释：上游和下游河水采用1 ∶50稀释； 总进水采用1 ∶200稀释； 总出水采用1 ∶10稀释. 根据不同的稀释比例，上游水、 进水、 出水和下游水分别取10、 2.5、 50和10 μL加入各个上样管中(检测体系500 μL).

使用染色剂SYBR GreenⅠ(工作液浓度100×，BD公司)体积5 μL，上样管中终浓度1×. 细菌和病毒采用不同的染色方法：细菌染色时，混合样在常温下、 避光条件下染色15 min； 病毒染色时，样品在避光、 80℃水浴加热条件下染色10 min，然后自然降温5 min. 最后，使用流式细胞仪(FACSCalibur^TM，BD公司)检测.

在检测过程中，使用Milli-Q超纯水作为鞘液. 检测病毒时，设置空白对照：将10 μL过30×10³超滤膜的上游水加入到上样管，稀释、 染色同正常样品一样，作为空白对照. 通过调节流式细胞仪的电压，使得空白样中的荧光信号趋于零，以消除背景荧光信号对病毒荧光信号的干扰.

对于细菌、 大肠杆菌、 军团菌、 贾第虫，直接对上游河水DNA样品进行PCR扩增； 然后将获取的PCR产物转到质粒上； 最后配制成不同浓度的标准样品. 根据已知的腺病毒基因序列^[22]，直接合成质粒标准品. 隐孢子虫质粒直接通过对隐孢子虫DNA进行扩增，然后将PCR产物转到质粒上.

在进行qPCR时，大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒和16S rRNA基因检测采用染料法(SYBR Green I Premix Plus，天根). 反应体系：2×SuperReal PreMix Plus(with SYBR Green I) 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 μL，Forward primer(10 μmol ·L^-1) 0.6 μL，Reverse primer(10 μmol ·L^-1) 0.6 μL，ddH₂O 4.8 μL，模板2 μL，反应体系为20 μL. 引物和扩增条件，见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 目标病原体对应的引物、 探针和扩增条件 Table 2 Primers,probes,and thermocycling conditions of target pathogens 病原体 序列和探针 扩增条件 文献 大肠杆菌 F: TGTTCAGTGGCA AGAGTTR: TAATCGATATACCCGCTC 95℃ 15 min； 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，72℃ 10 s，40个循环 [4] 腺病毒 F:GGACGCCTCGGAGTACCTGAGR: ACNGTGGGGTITCTGAACTTGTT 95℃ 15 min； 95℃ 15 s，55℃ 60 s，45个循环 [22] 细菌 341F:CCTACGGGAGGCAGCAG534R:ATTACCGCGGCTGCTGGAC 95℃ 15 min； 95℃ 8 s，61℃ 8 s，72℃ 10 s，40个循环 [25] 军团菌 F:CCCATGAAGCCCGTTGAAR:ACAATCAGCCAATTAGTACGAGTTAGC 95℃ 15 min； 95℃ 30 s，60℃ 60 s，72℃ 60 s，40个循环 [26] 隐孢子虫 F: CAAATTGATACCGTTTGTCCTTCTGR: GGCATGTCGATTCTAATTCAGCTP:HEX/TGCCATACATTGTTGTCCTGACAAATTGAAT/BHQ-1 95℃ 2 min； 95℃ 10 s，63℃ 1 min，72℃ 1 min，45个循环 [6] 贾第虫 F: CATCCGCGAGGAGGTCAAR: GCAGCCATGGTGTCGATCT P:FAM/AAGTCCGCCGACAACATGTACCTAACGA/TAMRA 95℃ 15 min； 95℃ 10 s，58℃ 8 s，72℃ 26 s，45个循环 [6]

表 2 目标病原体对应的引物、 探针和扩增条件 Table 2 Primers,probes,and thermocycling conditions of target pathogens

在进行qPCR时，贾第虫和隐孢子虫基因检测采用探针法(Premix Ex Taq^TM，TaKaRa). 反应体系：Premix Ex Taq(2×Conc.)10 μL，ROX Reference Dye(50×Conc.)0.4 μL，Forward primer(10 μmol ·L^-1) 0.4 μL，Reverse primer(10 μmol ·L^-1) 0.4 μL，BSA(10 mg ·L^-1) 0.4 μL,TaqMan Probe 0.4 μL，ddH₂O 6 μL，模板2 μL，反应体系为20 μL. 引物和扩增条件，如表 2所示. 病原体定量使用定量PCR仪(ABI 7300，ABI公司).

常规水质分析结果见表 3. 经过污水处理厂处理，进水中NH₄⁺-N、 TP、 COD的去除率分别达到83.80%、 98.91%和88.79%，呈现出较好的去除效果.

表 3(Table 3)

表 3 不同水样的物化参数 Table 3 Physicochemical properties of different water samples 采样点 TN/mg ·L-1 NH4+/mg ·L-1 NO3-/mg ·L-1 TP/mg ·L-1 SRP/mg ·L-1 TOC/mg ·L-1 COD/mg ·L-1 上游 6.94 1.29 2.46 0.11 0.10 7.51 30.14 进水 29.05 12.16 12.88 10.53 2.67 16.70 135.77 出水 17.40 1.97 2.76 0.11 0.10 7.92 15.22 下游 11.22 0.62 1.63 0.06 0.05 7.23 27.80

表 3 不同水样的物化参数 Table 3 Physicochemical properties of different water samples

河道上下游对比分析：NH₄⁺-N和TP指标，上游水质满足Ⅳ类水，下游满足Ⅲ类水； 针对COD指标，上游水质满足Ⅴ类水，下游满足Ⅳ类水.

通过FCM检测4类水样中的细菌和病毒，结果 见图 1. FCM检测4类水样中细菌浓度水平在10⁵counts ·mL^-1以上，而病毒浓度水平在10⁷ counts ·mL^-1以上. 同一水样中，病毒浓度水平比细菌高出一个数量级以上. 通常水环境中细菌和病毒数目分别为10⁵~10⁶ counts ·mL^-1和10⁷ counts ·mL^-1数量级^[27]，与研究结果一致.

图 1

Fig. 1

图 1 细菌和病毒浓度检测 Fig. 1 Concentration of bacteria and viruses in different samples

经过污水处理厂处理，细菌浓度由(5.77E+07) counts ·mL^-1降至(2.28E+05) counts ·mL^-1； 病毒由(4.68E+08) counts ·mL^-1降至(1.12E+07) counts ·mL^-1，去除效率分别达到99.85%和97.61%. 由于进水中细菌和病毒的浓度较高，所以即使在较高的去除效率之下，出水中的病原体浓度水平依然很高.

如图 2所示，同一水样中不同的病原体浓度差异较为明显. 例如，军团菌浓度最高，达(5.81E+04)copies ·mL^-1； 而隐孢子虫浓度最低，其最高浓度仅为(1.29E+01)copies ·mL^-1，军团菌基因浓度比隐孢子虫基因浓度高出3个数量级. 研究表明，每个隐孢子卵囊中含有4个拷贝数的卵囊壁蛋白基因^[6]. 因此，隐孢子虫卵囊的浓度相对更低.

图 2

Fig. 2

图 2 不同水样的病原体浓度 Fig. 2 Concentration of the water pathogens in different water samples

16S rRNA基因浓度在污水处理厂进水高达(1.25E+08)copies ·mL^-1； 出水浓度降至(2.83E+05)copies ·mL^-1，基因拷贝数降低3个数量级，去除效率达到99.77%. 同时，大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫基因的去除效率分别为99.99%、 98.95%、 99.47%、 97.38%和93.82%. 结果表明，污水处理厂对病原体较高的去除效率使得进水、 出水中病原体浓度水平有显著差异.

病原体较高的去除率，与水厂所采用的深度处理工艺(MBR+紫外消毒)有着密不可分的关系. 由于污水处理厂处理污水的主体是水中的污泥，所以处理污水过程中进水中的病原体会大量吸附在污泥的颗粒表面. 通过滤膜的截留，大量病原体滞留在污泥中，进而使得出水中病原体浓度大幅度下降. 膜过滤之后的水经过消毒处理，实现对水中残留病原体的杀灭； 同时，促使一些胞外的DNA分解. MBR工艺直接通过截留方式实现对病原体的去除，被截留的病原体将不会被再次检出； 紫外消毒则是将病原体杀死，杀死后的病原体依然有被检出的可能. 整体评判，病原体被大量截留在污泥中，以污泥形式被去除.

就细菌检测结果而言，qPCR检测结果高于FCM检测结果. 基于各种原因(见3.2节)，qPCR检测存在过高估计微生物真实浓度水平的可能. 因此，考虑以FCM测得细菌及病毒结果作为基准值，使用FCM结果对qPCR结果进行相应的校正. 假定qPCR/FCM系数与细菌浓度被高估倍数一致，4类水样被高估倍数分别为：3.49、 2.16、 3.25和4.34. 另外，假定水样中原虫和病毒被高估程度同细菌一样. 校正后结果，如图 3所示，认为校正后的值为水样较为准确的浓度.

图 3

Fig. 3

图 3 FCM/16S rRNA系数校正后病原体浓度 Fig. 3 Concentration of different pathogens after the correction by FCM/16S rRNA coefficient

对于水体病原体污染的研究，典型病原体的选择显得非常关键. 因为在研究水体病原体污染过程中，对每一种病原体逐一检测是无法实现的； 此外，一种能表征病原体真实浓度和多种病原体的万能指示微生物不存在^[15]，所以必须选择具有代表性的病原体进行检测，以较为准确地表征病原体的污染水平.

研究发现：在几种常见病原指示物中，只有使用膜滤-mI培养法检测出的大肠杆菌与肠道疾病的发生存在较为明显的相关性^[3]. 隐孢子虫和蓝氏贾第虫作为世界范围内水体传播疾病的主要病因之一，其卵囊或孢囊在环境中有较高的稳定性，对大部分的消毒剂都有抵抗能力，故不易去除. 基于腺病毒在人群和环境普遍性，及其自然恢复力和人类宿主的特异性，许多学者推荐其作为人类污染物污染的指示物^[28]. 研究表明，在河流和湖泊中，一旦有腺病毒检出说明该地区水体受到了人类粪便的污染^[29]. 军团菌以嗜肺军团菌最易致病，且占病例的85%~90%； 此外，军团菌属又是以庞蒂亚克热而为人所熟知的自限制性非肺炎疾病的主要病因^[26].

基于对前人研究成果的对比和分析，本研究所采用的5种典型病原体(大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫这5种病原体)具有典型代表意义，能较全面表明病原体在水体中的存在状况.

特异性，引物的特异性是PCR扩增检测结果正确性和实用性的基础. 细菌基因扩增选择已报道的通用引物，而大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫基因扩增选择已报道的特异性引物，对以上几种病原体进行了多次的PCR扩增. 对PCR产物进行电泳，结果每次的电泳条带呈现出较好的一致性，扩增的条带大小与目标条带大小相一致. 此外，对以上扩增的产物进行测序，将获取的序列通过NCBI进行验证，均符合检测的目标病原体. 流式细胞术检测总细菌和总病毒的原理是基于核酸与核酸染料结合时产生荧光，使得流式细胞术对细菌和病毒的检测具有很强的特异性.

准确性，检测样品时取3个平行样，且多次进行检测. 检测结果显示，细菌、 大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫相对标准偏差分别为1.5%~10%、 6.3%~10.7%、 3.4%~8.96%、 5.7%~10.8%、 4%~10.3%、 3.8%~14.7%； 总病毒和总细菌的相对标准偏差分别为12%~18%和1.5%~4.8%. 检测结果呈现较好的平行性，且多次检测验证保证了方法的准确性.

检测限，经过多次检测和验证，结果表明该方法对细菌、 大肠杆菌、 军团菌、 腺病毒、 贾第虫和隐孢子虫目的基因的最低检测限分别为(1.48E+02)、 (2.06E+01)、 (4.62E+00)、 (2.15E+00)、 (6.01E+00)、 (1.02E+00)copies ·μL^-1. 较低的检测极限使得该方法可以检测环境水体中微量的病原体，提高了病原体检测的精度.

FCM-qPCR方法主要针对环境水体中病原体的检测. 与环境水体相比，自来水中物质组成相对较为简单，因此也可以使用该方法检测自来水中病原体的存在水平. 虽然没有使用该方法检测底泥和活性污泥，但是已有学者使用FCM方法检测底泥^[7]和活性污泥^{[18, 19]}中细菌或病毒. 所以，该方法的适用范围相对较广.

qPCR过程中，可能会受到模板质量的影响，如模板中含有杂蛋白质、 Taq酶抑制剂、 染色体中的组蛋白、 酚类等，所以在DNA提取过程中要保证模板的质量. 基于荧光染料与核酸结合的性质，该方法可能会受到水中藻类的影响，故不适宜检测含有高藻类的水体.

虽然qPCR和FCM方法都可以检测样品中细菌浓度，但是二者获取的数值却有一定的差异：qPCR获取的数值均高于流式细胞术.

造成两种检测方法的检测结果差异的根本原因在于，两种检测方法的原理不同：qPCR是用于测定特定基因，FCM用于计数细菌本身. 研究表明，胞外DNA可以吸附在固体颗粒表面，进而在水体中避免DNA酶对其降解^[30]. 因此，环境样品中一些胞外DNA在进行抽滤过程中会随着颗粒物被截留在滤膜上，在提取总DNA时被重新获取，定量过程中胞外DNA同样被定量. 研究表明，在某些细菌体内含有多个16S rRNA基因^[31]，这就意味着一个细菌可能被计数为多个细菌. 由于16S rRNA基因广泛存在于细菌体内，在进行操作过程也容易受到污染，导致检测结果偏高. 而在使用FCM时，水中存在的胞外DNA不会被计数； 对于含有多个16S rRNA基因的细菌也只能被计数一次. 基于以上诸多原因，容易导致使用qPCR检测到的细菌浓度要高于流式细胞术的检测值.

两者分析比较，16S rRNA基因在使用qPCR检测过程中容易受到样品质量和操作环境的影响，而使用FCM则可以有效避免此类事情的发生，故在测细菌数目时更适宜使用FCM.

水中颗粒物为病原体的生长提供了载体，有机物颗粒、 氨氮和硝态氮等影响着细菌的增殖^[32]. 研究表明，细菌的生长与COD和温度成正相关^[33]. 实际生产中，也常常利用常规指标在一定程度上间接反映生物指标水平. 因此，水体中的常规指标同病原体的关系十分重要.

污水处理厂对常规指标和生物指标都有较高的去除率，二者出现较高的一致性. 对生物指标和常规指标使用SPSS软件进行相关性分析，结果显示：病原体与COD相关性非常显著(P＜0.01)； 病原体与NH₄⁺-N相关性显著(P＜0.05).

人类长期直接或间接暴露在城市水景和水环境中，一旦这些水中有病原体微生物存在，就有可能对人体健康造成危害^[29]. 挪威地区暴发肺炎军团菌疾病，就是因为当地污水处理厂释放出来的肺炎军团菌造成的^[1]. 因此，水体中病原体检测显得尤为重要.

在污水处理过程中，病毒与病原菌相比更加难去除和灭活，在污水处理厂的排水中依然发现有感染人的病毒存在^[34]. 研究发现，在污水处理厂出水中仍然有较高浓度的腺病毒存在. 因此，病原体检测在整个污水处理过程中是很有必要的. 通过对污水处理厂各工艺段病原体的检测研究，可以更好地指导生产、 优化工艺以及指导工艺升级改造，提高病原体去除效率，减少病原体的排放量，进而降低病原体疾病的暴发率. 另外，还可以为评估污水处理厂处理效果及排水对受纳水体的生态分析提供技术支持.

(1) FCM快速准确对细菌和病毒进行计数，qPCR获取典型病原体浓度水平. 前者从宏观角度判别病原体污染情况； 后者从微观角度论证病原体污染水平. 两种方法联用使得检测结果更加具有说服力.

(2)FCM和qPCR联用应用到实际污水处理厂及受纳水体检测中，结果发现：该污水处理厂对病原体有较高的去除率(＞93%)； 该污水处理厂排水对受纳水体基本没有负面影响.

(3)研究为评估污水处理厂处理效果及排水对受纳水体的生态影响提供技术支持，从而可以更好地指导生产和工艺的升级改造.