环境科学  2015, Vol. 36 Issue (12): 4574-4581   PDF    
引用本文
刘雪, 刘树深, 刘海玲. 构建三元混合污染物的三维等效图[J]. 环境科学, 2015, 36(12): 4574-4581.
LIU Xue, LIU Shu-shen, LIU Hai-ling. Construction of Three-Dimensional Isobologram for Ternary Pollutant Mixtures[J]. Environmental Science, 2015, 36(12): 4574-4581.
构建三元混合污染物的三维等效图
刘雪, 刘树深 , 刘海玲    
同济大学环境科学与工程学院, 长江水环境教育部重点实验室, 上海 200092
收稿日期: 2015-05-15; 修订日期: 2015-07-13.
基金项目: 国家自然科学基金项目(21177097);高等学校博士学科点专项科研基金项目(20120072110052)
作者简介: 刘雪(1990~),女,硕士研究生,主要研究方向为混合污染物的分析毒理,E-mail: lurel_duoduo@sina.com
通讯联系人: 刘树深, E-mail: ssliuhl@263.net
摘要: 等效线分析法广泛应用于二元混合物的毒性相互作用评估. 然而, 如何构建三维等效图以考察三元混合物中发生的毒性相互作用至今没有文献报道. 本研究的主要目的即以三元混合物中3个组分的相对浓度为坐标轴建立三维等效图以考察三元混合物的毒性相互作用. 以6种目前在中国广泛使用的农药, 包括3种除草剂(2,4-D、敌草净、西草净)和3种杀虫剂(乐果、吡虫啉、残杀威)为混合物组分, 采用均匀设计射线法(UD-Ray)分别对三元除草剂和三元杀虫剂混合物中各组分浓度分布进行优化设计, 以全面表征实际混合物的浓度多样性. 通过费氏弧菌微板毒性分析法测定农药及其三元混合物在不同浓度下的发光抑制毒性, 以浓度加和(CA)模型为加和参考模型, 建立三维等效图, 分析各混合物的毒性相互作用. 结果表明, 三维等效图能清晰、直观地反映三元混合物的毒性相互作用信息, 开拓等效分析法在三元混合物毒性分析中的应用.
关键词: 三维等效图     均匀设计射线法     费氏弧菌     三元农药混合物     毒性相互作用     微板毒性分析    
Construction of Three-Dimensional Isobologram for Ternary Pollutant Mixtures
LIU Xue, LIU Shu-shen , LIU Hai-ling    
Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China
Abstract: Isobolographic analysis was widely used in the interaction assessment of binary mixtures. However, how to construct a three-dimensional (3D) isobologram for the assessment of toxicity interaction within ternary mixtures is still not reported up to date. The main purpose of this paper is to develop a 3D isobologram where the relative concentrations of three components are acted as three coordinate axes in 3D space to examine the toxicity interaction within ternary mixtures. Taking six commonly used pesticides in China, including three herbicides (2, 4-D, desmetryne and simetryn) and three insecticides (dimethoate, imidacloprid and propoxur) as the mixture components, the uniform design ray procedure (UD-Ray) was used to rationally design the concentration composition of various components in the ternary mixtures so that effectively and comprehensively reflected the variety of actual environmental concentrations. The luminescent inhibition toxicities of single pesticides and their ternary mixtures to Vibrio fischeri at various concentration levels were determined by the microplate toxicity analysis. Selecting concentration addition (CA) as the addition reference, 3D isobolograms were constructed to study the toxicity interactions of various ternary mixtures. The results showed that the 3D isobologram could clearly and directly exhibit the toxicity interactions of ternary mixtures, and extend the use of isobolographic analysis into the ternary mixtures.
Key words: three-dimensional isobologram     uniform design ray     Vibrio fischeri     ternary pesticide mixtures     toxicity interaction     microplate toxicity analysis    

等效线图(isobologram)是具有相同效应(通常是半数效应)的浓度点的组合,常用于二元混合物的毒性相互作用分析[1, 2]. 等效线图已成功应用于研究两种止痛药的联合药效[3],鱼藤素和顺铂对人胃癌细胞株MGC-803的二元联合效应[4],重金属与有机磷农药二元混合物的联合毒性[5],氟唑磺隆与苯磺隆两种除草剂混合物的毒性相互作用[6]以及离子液体与甲霜灵二元混合物的联合毒性[7]等. 然而,等效线图是一个二维浓度图,只能描述两组分之间的毒性相互作用[8]. 有学者将混合物效应作为第3个坐标引进传统等效线图中,制作了所谓三维等效线图,从而能考察任意等效应而不仅仅限于半数效应浓度水平下的二元混合物中的毒性相互作用[9, 10]. 但是,这个三维图并非处处等效,只有当第3个坐标固定时才是等效的. 事实上,如何构建3个物质之间的等效图进而考察三元混合物中发生的毒性相互作用尚无研究报道. 本研究的主要目的即是以三元混合物中3个组分的相对浓度为坐标轴建立等效图以考察三元混合物中产生的毒性相互作用. 这个图是三维的,也是处处等效的,称之为三维等效图.

混合污染物是一个复杂的体系[11],其效应不仅与混合物组成有关,也与混合物中各组分的浓度有关[12, 13, 14],仅仅研究其中某些等毒性浓度比混合物[15, 16]或随机地考察几个非等毒性浓度比混合物的效应[17, 18]来分析混合物的毒性变化规律是不全面的. 因此,必须采用优化实验设计方法对混合物中各种浓度组成进行设计,以全面表征实际混合物的浓度多样性. Dou等[19]提出了适用于二元混合物设计的直线均分射线法,Zhang等[20]首次将均匀设计(UD)的思想用于多元(六元)混合物的实验设计. 为了说明本研究建立的三维等效图在三元混合污染物中的应用,以6种目前在中国广泛使用的农药,包括三种除草剂(西草净、 敌草净、 2,4-D)和3种杀虫剂(乐果、 吡虫啉、 残杀威)为混合物组分,采用均匀设计射线法 (uniform design ray,UD-Ray)[21]分别对三元除草剂和三元杀虫剂混合物中各组分浓度分布进行优化设计,以费氏弧菌微板毒性分析法测定农药及其三元混合物在不同浓度下的发光抑制毒性,以浓度加和(concentration addition,CA)为加和参考,建立三维等效图,分析各混合物的毒性相互作用.

1 材料与方法 1.1 主要试剂

3种除草剂(西草净、 敌草净、 2,4-二氯苯氧乙酸)和3种杀虫剂(乐果、 吡虫啉、 残杀威)购自Dr Ehrenstorfer GmbH公司(德国),其名称、 纯度、 CAS登记号(CAS RN)等基本性质及储备液浓度见表 1. 农药的储备液使用含2% NaCl的Milli-Q水配置,使用前置于4℃冰箱避光保存.

表 1 6种农药的基本信息及储备液浓度数 Table 1 Basic information and stock solutions of six pesticides
1.2 费氏弧菌微板毒性分析法

根据Wang等[22]提出的方法做适当修改而成. 具体操作过程如下.

1.2.1 菌种、 培养基及细菌培养

费氏弧菌冻干粉购自北京滨松光子技术股份有限公司(产品型号为CS234,编号D14H021).

培养基配置参照ISO 11348-1. 具体操作过程如下: 称取30 g氯化钠、 6.10 g一水磷酸二氢钠、 2.75 g三水磷酸氢二钾、 0.204 g七水硫酸镁、 0.50 g磷酸氢二铵、 3 mL甘油、 5.00 g蛋白胨、 0.500 g酵母提取物,溶于约900 mL Milli-Q超纯水. 搅拌均匀后用2 mol ·L-1 NaOH溶液和1 mol ·L-1 HCl溶液调节pH至7.0±0.2,定容至1 L,取其中约200 mL用于制备固体培养基,剩余800 mL用于制备液体培养基. 用量筒量取200 mL上述溶液至250 mL容量瓶,加入2.4 g生化琼脂粉,用牛皮纸封口、 橡皮筋扎紧后,和洗净的培养皿一起放入高压蒸汽灭菌锅,在121℃下灭菌20 min. 稍作冷却,移至超净台,将溶有琼脂粉的培养基分装至直径约7 cm的培养皿中,培养基厚度约0.5 cm. 待其凝固、 冷却后置于4℃冰箱保存,此即为固体培养基. 余下的800 mL溶液则分装至150 mL锥形瓶,每瓶50 mL,用牛皮纸封口、 橡皮筋扎紧后,放入高压蒸汽灭菌锅,在121℃下灭菌20 min,冷却后直接置于4℃冰箱保存,此即为液体培养基.

费氏弧菌培养：取费氏弧菌冻干粉及复苏液,无菌条件下,用移液器吸取0.5 mL复苏液至费氏弧菌冻干粉小瓶,缓缓振荡摇匀. 用接种环沾取适量菌液至配置好的固体培养基,均匀划线使菌液呈条状均匀分布. 在20℃±1℃下培养48 h后,再分别进行两次传代培养(均在20℃±1℃下培养24 h),即可得到发光稳定的第三代菌株. 将发光稳定的菌株接种到液体培养基,20℃±1℃、 180 r ·min-1下培养约13~15 h,即可得到相对发光数(relative light unit,RLU)在1.0×109~1.5×109之间的费氏弧菌菌液(处于对数生长期的菌液). 另取一瓶液体培养基,20℃±1℃下放置30 min后,向其中加入约5~10 mL上述处于对数生长期的菌液,混匀后测试混合菌液的相对发光数,混合液的RLU在1.0×108～2.0×108之间,即可作为测试菌液使用. 研究中发现,测试菌液的敏感性与菌液密度密切相关,本文通过对对数期菌液进行稀释,来提高实验的灵敏性; 同时通过控制测试菌液的RLU,来控制实验结果的稳定性.

1.2.2 发光抑制毒性测试

选用白色不透明标准96孔板,微板周边的36个微孔加入200 μL Milli-Q超纯水; 第2、 6、 7及11列除周边外的24个微孔加入100 μL 2% NaCl溶液(空白); 剩余36个微孔按一定稀释因子设计12个浓度梯度,各浓度设3个平行,试液体积不足100 μL时以2% NaCl溶液补充. 用多道移液枪移取1.2.1节中培养至对数生长期的测试菌液100 μL加入96孔板中间的60个孔中,使每孔总体积为200 μL,记下加入菌液的时间. 在20℃±1℃温育30 min后,在Glomax微板光度计上测定各孔测试液的RLU,按式(1)计算发光抑制毒性(E)：

式中,I0为24个空白RLU的平均值,Ii为第i个浓度梯度3个平行RLU的平均值. 为减少实验误差,微板实验至少进行3次重复.

1.2.3 浓度-效应曲线拟合

采用3参数Hill函数[23]对不同浓度下的发光抑制毒性(E)数据进行非线性拟合,拟合优度用拟合相关系数(R)和均方根误差(RMSE)表示. 3参数Hill函数如式(2)所示：

式中,γ表示最大效应,ECx表示毒性效应为x时对应的浓度,ECm表示毒性效应为最大效应(γ)一半时的浓度,β是斜率参数.

1.3 混合物设计

以三元混合物中的3个组分为因素,各组分的5个效应浓度(EC10、 EC20、 EC30、 EC40、 EC50)为因素水平,采用U5(54)均匀表中的第1、 2、 3列设计5条混合物射线[15]. 混合物射线中各组分浓度在混合物总浓度(各组分浓度之和)中所占分数(pi)结果见表 2. 其中HMk和IMk分别表示除草剂混合物(herbicide mixture)和杀虫剂混合物(insecticide mixture)体系中的第k条射线.

表 2 除草剂或杀虫剂混合物射线中3个组分的浓度比(pi) Table 2 Concentration ratios (pi) of three components in herbicide or insecticide mixture rays
1.4 三维等效图构建

三维等效图是以3个组分相对浓度为坐标轴(三维浓度空间)各等效应混合物的浓度分布图,它由一个浓度加和等效面和各混合物等效应浓度及误差棒(本研究以95%置信区间表示)组成. 具体构建方法如下.

浓度加和等效面的构造：以浓度加和(CA)作为加和相互作用标准分析混合物相互作用如协同和拮抗作用. 三元混合物的浓度加和(CA)模型可表达为式(3).

式中,c1、 c2、 c3分别表示效应为x时混合物中3个组分的浓度,ECx,1、 ECx,2、 ECx,3分别表示3个组分单独存在时产生效应x时的浓度.

由式(3)可知,符合CA模型且效应为x的所有三元混合物都位于三维浓度空间的一个平面上. 这个平面通过3个坐标轴的ECx,i (i=1,2,3)相交. 本研究利用MATLAB 2008的网格化技术构建这个平面. 具体做法如下：任选两组分(1和2)分别作为X轴和Y轴,以合适的步长对0~ECx,1和0~ECx,2进行网格化处理,对每一个网格化节点计算符合式3的第3组分的浓度(c3)值.

等效应浓度及误差棒：从实验测定的各混合物射线的浓度-毒性数据的拟合曲线函数计算指定效应x下的浓度ECx,从拟合曲线的95%观测置信区间[24]计算该效应浓度的置信上限浓度(UCx)和置信下限浓度(LCx),最后各混合物浓度分别与各组分的浓度分数相乘得到各组分浓度.

利用上述符合CA模型的等效面数据和混合物实测等效应浓度及置信区间数据在Origin 8.0中完成作图.

2 结果与分析 2.1 农药的剂量-效应曲线

结果表明,Hill函数能很好地拟合除草剂和杀虫剂的剂量-效应数据(表 3). 由表 3可知,拟合相关系数R均大于0.98,拟合均方根误差RMSE均小于0.030. 若以EC50为毒性指标,除PRO外,杀虫剂的EC50比除草剂低1~2个数量级,说明杀虫剂对费氏弧菌的毒性高于除草剂. 6个农药的浓度-效应数据点,拟合剂量-效应曲线(concentration-response curve,CRC)及置信区间如图 1所示,从中可知,数据重复性较好,除个别点外,大部分数据点均落在较窄的置信区间内.

表 3 6种农药的Hill函数拟合参数与EC50值 Table 3 Hill equation fitting parameters and EC50 value of six pesticides

图 1 3个杀虫剂和3个除草剂的剂量-效应关系 Fig. 1 Concentration-response relationships of three insecticides and three herbicides
2.2 农药混合物的毒性相互作用

Hill函数能够对HM体系的5条混合物射线及IM体系的5条射线的毒性数据进行有效拟合. 表 4结果表明,拟合相关系数R均大于0.98,均方根误差RMSE均小于0.035. 各混合物射线的浓度-效应数据点,拟合CRC及置信区间如图 2所示. 为了从整体CRC分析混合物的毒性相互作用,应用CA模型计算各混合物射线的预测CRC (图 2中的黑色实线).

表 4 三元除草剂和杀虫剂混合物射线的拟合函数与EC50及置信区间 Table 4 Fitting functions and EC50s with their 95% confidence intervals of ternary herbicide and insecticide mixture rays

图 2 HM体系及IM体系各混合物射线的剂量-效应关系 Fig. 2 Concentration-response relationships of various mixture rays in the HM and IM systems

从图 2(a)可以看出,对于HM体系,低浓度下,5条混合物射线的CA预测CRC都落在95%置信区间内,是浓度加和作用; 随着混合物浓度增加,射线HM1和HM2的CA预测CRC逐渐低于置信区间下限,呈协同作用. 从图 2(b)可以看出,对于IM体系,低浓度下,部分混合物射线的CA预测CRC高于置信区间上限,呈拮抗作用; 中等浓度下,CA预测CRC位于置信区间内,呈加和作用; 在高浓度时,CA预测CRC低于置信区间下限,呈协同作用.

2.3 三维等效图在混合物毒性分析中的应用

应用三维等效图可以考察三元混合物在任意效应水平下的毒性相互作用,本研究以效应x=50为例,制作三元除草剂和三元杀虫剂混合物的三维等效图(图 3). 图 3中三角平面表示浓度加和等效面,各线段(三点)表示各混合物射线的EC50(中间点)及其浓度置信区间(两端点). 若线段与三角平面相交说明该混合物射线在EC50水平下呈加和作用; 若线段位于三角平面左下方,则呈协同相互作用; 若位于右上方则呈拮抗相互作用.

图 3 HM和IM混合物射线在EC50下的三维等效图 Fig. 3 Three-dimensional isobologram of HM and IM mixture rays at EC50

由图 3(a)可知,对于HM体系,浓度加和等效面与所有混合物射线的EC50及其误差棒相交. 表明,所有除草剂混合物射线在EC50水平下呈加和作用. 由图 3(b)可知,对于IM体系,浓度加和等效面与IM1和IM3混合物射线的EC50及其误差棒相交,而IM2、 IM4和IM5混合物射线的EC50及其误差棒位于浓度加和等效面的右上方. 表明IM1和IM3混合物射线在EC50水平下呈加和作用,而IM2、 IM4和IM5混合物射线在EC50水平下呈拮抗作用. 这些结果分别与5条HM射线和5条IM混合物射线的CRC及CA预测CRC图的比较结果相吻合.

3 讨论

评价混合物中组分间的毒性相互作用有图形法和指数法两大类. 等效线图法是应用最广泛的图形方法,但只适用于二元混合物的相互作用分析. 指数方法[25, 26, 27, 28]将混合物相互作用用一个定量的数值表示,简单实用,也适用于多元混合物. 最常使用的指数方法有毒性单位法、 加和指数法、 混合物毒性指数法、 相似性参数法等. 然而,使用这些指数的参考浓度都是半数效应浓度,一般较难反映混合物毒性相互作用随混合物浓度组成可能发生变化的事实.

传统等效线图是二维图,只能用于二元混合物的毒性相互作用分析[29, 30]. 要获得比较完整的等效线图,必须按固定浓度比法设计具有多种浓度比(比如EC50,1/EC50,2为5 ∶1、 4 ∶2、 3 ∶3、 2 ∶4和1 ∶5)的大量二元混合物进行毒性测试,从而求得各混合物的EC50[15, 16]. Dou等[19]提出应用直接均分射线法(direct equipartition ray design,EquRay)设计二元混合物,使得各混合物射线在二维浓度空间中均匀分布,从而实现混合物毒性实验的程序化. 由EquRay设计并经毒性测试获得的实验数据可以方便地构建不同效应或浓度水平下的多个等效线图,从而系统分析混合物在不同等效应下的毒性相互作用[7, 31].

传统等效线图不能用于三元混合物的毒性相互作用分析. 虽然利用EquRay设计各种混合物射线可以系统并程序化地得到多个效应下的等效线图,但仍不能应用于三元混合物. 要全面反映三元混合物中的各种浓度组成与分布,需要比二元混合物更大量的毒性测试数据,这只有通过优化实验设计才能在有限的实验测试范围内获得尽可能好的结果. 本研究采用UD-Ray对农药三元混合物进行优化设计,对每个混合物体系(HM与IM)设计了5 条射线并进行毒性测试,获得了能有效反映三元混合物体系中各种不同浓度组成混合物在不同等效应(例如EC50或其它ECx)下的三维等效图. 这个三维等效图可以清晰、 直观地反映三元混合物的毒性相互作用特征; 将三维等效图的分析结果与常规的CRC及CA预测CRC图的分析结果进行对比,说明了三维等效图的分析结果准确可靠; 结合UD-Ray设计法制作三维等效图,可以全面地反映三元混合物体系在特定效应下的毒性相互作用特征.

4 结论

(1) 利用UD-Ray设计三元混合物的各种浓度组成,并测试各种混合物对费氏弧菌的发光抑制毒性,进而以Hill函数拟合浓度-发光抑制毒性数据,浓度加和为加和标准,构建了三元混合物在不同等效应下的三维等效图.

(2) 以三元除草剂和三元杀虫剂混合物体系为例,给出了在EC50水平下的三维等效图,分析了三元混合物体系中的毒性相互作用.

(3) 三维等效图可以清晰、 直观地反映三元混合物的毒性相互作用特征,开拓了等效分析在三元混合物毒性评估中的应用. 结合UD-Ray混合物设计方法,不仅扩大了三元混合物毒性研究的浓度比范围,同时也提高了三元混合物毒性研究的效率.

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