环境科学  2015, Vol. 36 Issue (11): 4319-4324   PDF    
引用本文
李鑫, 乔琰, 钟国祯. 应用基于单克隆抗体的免疫传感器检测环境中的芘和苯并芘[J]. 环境科学, 2015, 36(11): 4319-4324.
LI Xin, QIAO Yan, ZHONG Guo-zhen. Development of a Monoclonal Antibody-Based Sensor for Environmental Pyrene and Benzo(a)pyrene Detection[J]. Environmental Science, 2015, 36(11): 4319-4324.
应用基于单克隆抗体的免疫传感器检测环境中的芘和苯并芘
李鑫, 乔琰, 钟国祯    
西南大学材料与能源学部, 重庆 430062
收稿日期: 2015-03-04; 修订日期: 2015-06-29.
基金项目: 西南大学博士基金项目(SWU20700901); 中央高校基本科研业务费专项(XDJK2013C022)
作者简介: 李鑫(1983~),女,博士,讲师,主要研究方向为小分子污染物的免疫快速检测, E-mail: lixin999@swu.edu.cn
摘要：多环芳烃是一类普遍存在的环境污染物,可以诱发癌症,对人们的健康造成严重威胁. 本研究利用一种四环芳烃芘的衍生物作为半抗原,利用活泼酯法合成人工抗原免疫小鼠研制多环芳烃单克隆抗体. 通过非竞争性ELISA与竞争性ELISA相结合的筛选方式得到一株单克隆抗体,命名为6A6. 该抗体能特异性识别芘和苯并芘,其IC50值分别为8.1 μg ·L-1和6.8 μg ·L-1,对其他多环芳烃的交叉反应率均低于5%. 在此基础上,建立了免疫传感器法对芘和苯并芘进行检测,线性范围为0.2~10.0 μg ·L-1. 利用该方法对添加在水样中的样品进行回收,并与传统ELISA方法进行比对,结果证明传感器法检测更加快速且灵敏度更高. 该方法可以用于含有芘和苯并芘的环境样品的快速筛选,可以在10 min内初步获得检测结果.
关键词： 苯并芘     芘     单克隆抗体     免疫检测     传感器    
Development of a Monoclonal Antibody-Based Sensor for Environmental Pyrene and Benzo(a)pyrene Detection
LI Xin, QIAO Yan, ZHONG Guo-zhen    
Faculty of Materials and Energy, Southwest University, Chongqing 430062, China
Abstract: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are common environmental pollutants which are concerned because several of its members have been known to be carcinogenic and mutagenic. Pyrene, as a kind of PAHs, was covalently linked to carrier protein bovine serum albumin by active ester method and immunized to mice. A sensitive mAb 6A6 was developed by a three-step screening procedure. The IC50 of 6A6 against pyrene and benzo(a)pyrene were 8.1 μg ·L-1and 6.8 μg ·L-1, respectively. The cross-reactivity values (CR) with other PAHs were less than 5%. An immunosensor was developed based on 6A6 for pyrene and benzo(a)pyrene detection with a linear range of 0.2-10.0 μg ·L-1. The assessment of spiked water samples by the sensor demonstrated faster and more sensitive than ELISA method. We believe that this sensor can be used to rapidly assess pyrene and benzo(a)pyrene in environmental samples.
Key words: pyrene     benzo(a)pyrene     monoclonal antibody     immunoassay     sensor    

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指具有两个或者两个以上苯环的有机化合物，是一类重要的环境污染物[1,2]. 多环芳烃由于具有致癌性，致畸性以及致突变性近年来引起科学界的广泛关注[3,4]. 多环芳烃在自然界中广泛存在，大气、 土壤和水体中都不同程度地含有多环芳烃. 而这些污染可以通过食物链向人体转移，最终都有可能聚集在人体中，对人们的身体健康造成严重威胁. 因此，实时监测环境中多环芳烃的含量非常重要.

传统的多环芳烃检测方法主要有高效液相色谱分析法以及气相色谱-质谱分析法[5,6]. 这些检测方法虽然准确性好，但是仪器操作复杂，成本高，具有一定的局限性. 而且，这些方法大都耗时很长，很难达到环境样品实时监测的目的. 以单克隆抗体为基础的免疫分析方法由于具有成本低，操作简单，检测快速等特点而被越来越广泛地应用[7, 8, 9]. Matschulat等[10]开发出一种单克隆抗体，用于检测水中的苯并芘含量，检测灵敏度(IC50)可以达到24 ng ·L-1. Pschenitza等[11]利用固相萃取与ELISA结合的方法检测食用油中的苯并芘，其检测下限可以达到0.63μg ·kg-1.

由美国Sapidyne公司研发的KinExA系列传感器是一种由计算机掌控的流式荧光计. 其原理与竞争性酶联免疫分析法(ELISA)类似，不同之处在于应用于仪器的抗体需要预先荧光化. 在检测过程中，通过计算机控制使样品与抗体混合并达到结合平衡. 然后这种溶液快速流过包被有固定化抗原的聚甲基丙烯酸甲酯小球，这时候还具有抗原结合位点的抗体被玻璃小珠俘获，通过计算机界面来检测和记录被俘获的抗体的荧光信号，与标准曲线对照得出待测样品的浓度. 该仪器已经成功应用于重金属以及多氯联苯的快速检测[12,13]. 本研究研制了一种多环芳烃单克隆抗体，并成功将其应用于生物传感器，通过建立灵敏、 快速的多环芳烃免疫检测方法，以期实现多环芳烃环境样品的实时监测.

1 材料与方法 1.1 实验试剂与仪器

匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、 牛血清白蛋白(bovine serum albumen,BSA)、 N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)、 二环己基碳化二亚胺(dicylochexylcarbodiimide,DCC) 以及氮羟基琥珀酸(nhydroxysuccinimide,NHS) 均购自美国Pierce公司. 多环芳烃标准品苯并芘(benzo(a)pyrene)、 芘(pyrene)、䓛(chrysene)、 菲 (phenanthrene)、 萘(naphthalene)以及1-芘丁酸(1-pyrene butyric acid,PBA)均购自美国Sigma公司； AlexaFlour647免疫荧光染色试剂盒购自Invitrogen公司； 其余试剂均购自美国Fisher公司.

酶标仪(405 nm)： 美国Fisher Scientific公司； 自动洗板机： 美国Biotek公司； 96孔细胞培养板和96孔酶标板： 美国Costar； CO2培养箱： 美国Fisher Scientific公司.

1.2 方法 1.2.1 人工抗原的制备[14]

称取PBA溶解于适量DMF中，致终浓度为1 mg ·mL-1,加入等摩尔质量的NHS和DCC，缓慢加入到上述DMF溶液中，4℃反应过夜，12 000 r ·min-1，离心15 min去沉淀，即得活化后的半抗原. 称取适量BSA,溶解于磷酸缓冲液中，致终浓度为1 mg ·mL-1. 将1 mL活化后的半抗原缓慢加入到BSA溶液中，室温下振荡反应4 h后将反应物装入透析袋，0.01 mol ·L-1 PBS 4℃透析72 h. 同样方法制得PBA与KLH的偶联物，用作抗体筛选的包被抗原. 二喹啉甲酸(BCA)法测定偶联物中蛋白浓度. 分别称取一定量的PBA、 BSA以及它们的偶联物，配成一定浓度的溶液，PBA以甲醇为空白，BSA和复合物以磷酸缓冲液为空白，在250～450 nm波长范围内进行紫外扫描，分析扫描图谱[15].

1.2.2 小鼠免疫与细胞融合

将PBA-BSA偶联抗原溶解于磷酸缓冲液中，与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后，背部多点注射4只BALB/c 小白鼠，每只小鼠注射约50 μg PBA-BSA. 6周后，断尾采血，间接ELISA法测定抗血清效价[16]. 选取抗血清效价最高的小鼠在融合3 d前进行加强免疫，用约20 μg PBA-BSA溶于0.3 mL磷酸缓冲液中进行尾静脉注射. 融合当天，分离小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞按8 ∶1比例混合，在PEG作用下融合[17,18]. 融合后细胞置于96孔细胞培养板中，37℃，CO2培养箱进行培养.

1.2.3 单克隆抗体的筛选

采用三步法对融合后的杂交瘤细胞进行筛选[19]. 首先以PBA-KLH为包被原，间接ELISA方法筛选PBA阳性细胞株； 然后以原始半抗原PBA作为抑制剂，间接竞争ELISA方法进一步筛选获得能识别PBA单体的细胞株； 最后，分别以无取代基的三环至五环芳烃单体作为抑制剂，筛选获得对不同多环芳烃同时具有识别能力的杂交瘤细胞株. 有限稀释法亚克隆3次以后，利用Protein A免疫亲和柱对单克隆抗体进行纯化.

1.2.4 单克隆抗体性质鉴定

利用Sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对抗体亚型进行鉴定[20]. 利用间接竞争ELISA 方法测定单克隆抗体对不同苯环数量的多环芳烃苯并芘(5环)、 芘(4环)、䓛(4环)、 菲(3环)和萘(2环)的竞争抑制曲线，根据曲线计算抗体对不同多环芳烃的灵敏度(IC50). 选取免疫原芘(pyrene)作为参照毒素计算抗体对不同多环芳烃的交叉反应率 (交叉反应率%=IC50 pyrene/IC50 other PAH×100%)[21].

1.2.5 生物传感器检测体系的建立

以筛选得到的多环芳烃单克隆抗体为基础，使用美国Sapidyne公司出产的KinExA生物传感器建立多环芳烃检测体系，仪器原理及测定方法见文献[22]. 简要来说，首先用PBA-KLH包被聚甲基丙烯酸甲酯小球制成固定化抗原，同时，使用荧光染料AlexaFlour647标记多环芳烃单克隆抗体[23]. 设置自动化进样程序: 抗体400 μL，样品400 μL，混合均匀后，混合液400 μL快速流过固定化抗原，670 nm检测固定化抗原俘获的抗体荧光信号.

1.2.6 检测标准曲线的建立

为比较分析传感器法与间接竞争ELISA法，分别建立两种不同检测方法的标准曲线. 以PBA-KLH的偶联物为检测抗原，分别包被聚甲基丙烯酸甲酯小球(传感器法)以及96孔酶标板(ELISA法)，1%BSA封闭. 以系列浓度苯并芘和芘作为标准溶液，根据确定的最佳的抗原包被浓度以及抗体工作浓度，分别利用传感器法和间接竞争ELISA方法，检测不同浓度多环芳烃标准品溶液的电压值/吸光值除以零标准品浓度的电压值/吸光值，再乘以100%，得到抗体对不同标准品的抑制百分比. 以PAH标准品浓度(μg ·L-1)的对数值为横坐标，抑制百分比为纵坐标，绘制标准曲线[24].

1.2.7 样品添加回收实验

为了验证传感器法检测多环芳烃的准确性，在经测定不含多环芳烃的自来水中分别添加不同浓度的苯并芘和芘的标准品(5.0、 2.0和0.5 μg ·L-1). 同时应用传感器法和ELISA法对加标样品进行测定，从标准曲线上求出待检样品的多环芳烃浓度，根据公式计算添加回收率(回收率%=实测浓度/添加浓度×100%).

2 结果与分析 2.1 人工抗原偶联产物分析

PBA-BSA偶联产物经4℃ PBS溶液透析3d后，除去未反应的PBA，250～450 nm紫外扫描获得偶联产物的紫外光谱(图 1). 可见，PBA在305 nm和347 nm处有两个吸收峰，BSA在278 nm处有一吸收峰，而偶联产物在300 nm和355 nm处出现了特征吸收峰. PBA-BSA与其前体物具有不同的紫外吸收特征，表明PBA与BSA偶联成功.

图 1 PBA、BSA 与PBA-BSA偶联产物紫外扫描 Fig. 1 UV spectrum of PBA, BSA and PBA-BSA conjugate
2.2 小鼠抗血清效价测定

以PBA-KLH为包被原，梯度稀释免疫6周后的小鼠抗血清，间接ELISA方法测定抗血清效价. 选取血清对包被原最大吸光值的一半的点作为抗血清效价(图 2). 从图 2中可以看出，4只免疫后的小鼠对PAB-KLH均有不同的识别，血清效价均达到了104以上，该结果也再次证明了人工抗原的成功合成. 选取抗血清效价最高的小鼠D,效价8.3×104，作为实验小鼠进行后续的细胞融合.

图 2 间接ELISA测定四只免疫小鼠的血清效价 Fig. 2 Titer curves of 4 mice anti-sera by indirect ELISA
2.3 单克隆抗体鉴定

将SP2/0瘤细胞与小鼠D脾细胞融合，液体培养基法筛选融合后的杂交瘤细胞. 12~15 d后获得杂交瘤细胞约 563 株. 经第一步非竞争 ELISA 筛选后，共获得 OD 值为 1.8 以上的阳性克隆 36 株. 进一步通过竞争 ELISA 筛选获得对多环芳烃具有良好识别能力的阳性菌株4株. 进过三轮亚克隆，最终选取一株能稳定分泌抗体的，并且对多种多环芳烃同时具有识别能力的细胞株作为研究对象进行进一步鉴定. 该细胞株名为6A6.

通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，测得6A6分泌的抗体类型为lgG2a型. 间接竞争 ELISA方法对6A6灵敏度以及特异性进行测定. 由表 1可见，6A6能灵敏识别芘和苯并芘，其灵敏度(IC50值)分别为8.1 μg ·L-1和6.8 μg ·L-1. 另外，选取几种典型的二环至五环芳烃对该抗体的特异性进行鉴定，结果表明6A6仅对芘和苯并芘具有高特异性，对其余 ，菲以及萘的交叉反应率均小于5%.

表 1 6A6分泌单克隆抗体的性质表征1) Table 1 Characterization of monoclonal antibody 6A6
2.4 多环芳烃检测标准曲线

6A6经Protein A免疫亲和柱纯化，AlexaFlour647荧光化之后，根据文献方法[12]构建KinExA检测传感器. 选取不同浓度芘和苯并芘作为标准品，分别绘制6A6对芘和苯并芘检测的标准曲线(图 3). 从图 3中可知，6A6对芘和苯并芘的线性检测范围为0.2~10.0 μg ·L-1. 而且，由于6A6对芘和苯并芘的识别灵敏度非常接近，因而可以在生物传感器中得到非常相似的两条标准曲线. 这就意味着，在实际的检测过程中，只需任选其中一种化合物作标准曲线，计算检测结果，而无需两种都做.

图 3 多环芳烃生物传感器法标准曲线 Fig. 3 Calibration curves of PAHs on sensor

为了比较6A6在不同免疫检测方法中的检测效果，同时也测定了6A6在间接竞争ELISA体系中的标准曲线(图 4). 从图 4中可以看出，芘的检测标准曲线与苯并芘的检测标准曲线同样非常相似，检测线性范围(IC20~IC80)只是略有差异，分别为2.5~30 μg ·L-1和2.7~24 μg ·L-1. 比较分析两种不同方法的检测范围，可以看出传感器方法更灵敏，可以达到更低的检测限(0.2 μg ·L-1). 这也充分说明荧光化对单克隆抗体起到信号放大的作用. 但是，在检测范围上，传感器的最大检测浓度只有10 μg ·L-1，当样品含量大于该浓度时，需要先对样品进行稀释处理.

图 4 多环芳烃间接竞争ELISA标准曲线 Fig. 4 Calibration curves of PAHs on indirect competitive ELISA
2.5 水样添加回收测定

取空白自来水，在其中分别加入苯并芘或者芘的标准溶液，配制成浓度分别为5.0、 2.0和0.5 μg ·L-1的加标样品，以单克隆抗体6A6为基础，分别使用传感器法与ELISA法测定加标样品中相应多环芳烃的含量，比较添加回收率，每个样品重复测定3次取平均值(表 2). 由表 2可知，两种检测方法均具有很好的准确性，回收率均在正常波动范围之内. 当加标样品浓度为5.0 μg ·L-1和2.0 μg ·L-1时，两种检测方法回收率无明显差异，均在95%~110%之间. 但是，当加标样品浓度为0.5 μg ·L-1时，由于已经超出了ELISA检测的线性范围，ELISA法回收率明显降低，仅为80%左右. 因此，当测定低浓度芘或者苯并芘样品时，生物传感器法更具优势.

表 2 传感器法和ELISA法测定多环芳烃水样加标回收率1) Table 2 Recoveries of PAHs in spiked water samples by sensor and ELISA
3 讨论

多环芳烃是一类普遍存在的环境污染物，如何快速地检测多环芳烃也是研究热点之一. 以抗体为基础的免疫学检测方法，因其简单，快速，低成本，成为多环芳烃快速筛查的有力工具. 而在各种不同类型的抗体之中，单克隆抗体因为性质稳定，灵敏度高，针对性强而更具优势. 本研究利用芘丁酸作为半抗原，成功筛选到多环芳烃单克隆抗体6A6,该抗体针对苯并芘的灵敏度对比同类多环芳烃多克隆抗体提高10倍左右[25]. 为开发多环芳烃免疫检测方法提供了有力工具.

本研究通过对6A6的识别特异性进行比较分析，发现该单克隆抗体能特异性识别芘和苯并芘，而对其他3种二环至四环多环芳烃交叉反应率很低. 造成该现象的原因可能与化学结构相关. 从5种不同多环芳烃的结构式可以看到(表 1)，苯并芘与芘具有非常相似的化学结构，与之相比，与䓛、 菲、 萘的结构差异较大. 考虑到本研究以芘丁酸作为半抗原，因此得到了对苯并芘与芘具有特异性的单克隆抗体. 在今后的研究工作中，如需开发其他多环芳烃单克隆抗体，可以尝试免疫其他结构的多环芳烃衍生物作为半抗原.

本研究成功将单克隆抗体6A6应用于KinExA生物传感器，建立了苯并芘与芘的免疫快速检测新方法. 通过与经典的酶联免疫分析(ELISA)法比较可知，传感器方法灵敏度更高，可以达到更低的检测限(0.2 μg ·L-1). 其原因是应用于传感器的抗体需要事先荧光化，该过程对抗体识别信号起到了放大的作用. 通过加标回收实验的比较分析可知，在检测低含量的多环芳烃样品时，传感器法回收率更高，也就是说在检测低浓度样品时，传感器法准确性更高. 另外，排除前期包被与封闭所需要的时间，ELISA法检测一个样品需用时约2 h，而传感器法分析每个样品的时间仅为10 min，更加适合环境样品的快速筛查.

4 结论

本研究利用多环芳烃芘的衍生物芘丁酸作为半抗原，与牛血清白蛋白偶联制成人工免疫抗原，免疫小鼠进行单克隆抗体的研制，成功筛选得到单克隆抗体6A6. 该抗体能同时识别多环芳烃家族中的芘和苯并芘，并且具有很高灵敏度. 以6A6为基础，构建用于芘和苯并芘检测的生物传感器新方法. 通过比较分析可知，该方法无论在检测灵敏度或者检测时间方面，均较传统的ELISA方法具有优势. 由添加回收实验可知，该方法准确度很高. 因此，本研究研制了一种生物传感器，可以应用于环境样品中芘和苯并芘的快速初步筛选，具有很高应用价值.

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