固定床厌氧反应器因具有较高的COD去除率、 产气率以及抵抗低pH、 高负荷冲击的能力而受到广泛欢迎^[1,2]. 目前已在处理畜禽废水、 棕榈油厂废水、 高浓度有机废水、 印染废水以及废水的除磷脱氮等领域开展了广泛的应用与研究^[3,4]. 但是，厌氧发酵过程的稳定性和高效性受到很多因素的影响，比如废水特征、 水力停留时间(hydraulic retention time，HRT)、 污泥停留时间、 有机负荷率、 pH、 温度以及氧化还原电位等，在这些因素中，温度是影响厌氧发酵高效稳定运行的主要因素之一.

根据产甲烷菌适宜温度条件的不同，厌氧发酵可分为低温发酵(15～20℃)、 中温发酵(30～35℃)和高温发酵(50～55℃)3种类型. Zhang等^[5]研究了在低温(5～18℃)条件下固定床厌氧反应器性能和主要产甲烷菌结构，发现COD去除率和产气量明显下降. 陈智远等^[6]进行了猪粪、 鸡粪和牛粪这3种粪便分别都在常温、 25℃和35℃这3种温度条件下的厌氧发酵反应，发现各粪便组都在中温35℃条件下具有明显的发酵产沼气优势，表明中温发酵要优于常温发酵. 而高温发酵比中温发酵更能忍受环境的变化^[7,8]，因此受到广泛欢迎. 但是，中国大部分沼气池是在室温下运行的，运行效率不高，甚至经常不产气，因此许多沼气池面临着改型，但又考虑到能源问题，有些沼气池只能从室温发酵转化为中温发酵，甚至有的继续维持室温发酵，而室温发酵到冬天又转化为低温发酵. 因此研究室温发酵分化为低温、 中温和高温发酵对沼气池改型或不改型都具有重要的意义，也丰富了从室温下采集的污泥分别驯化成低温、 中温和高温污泥的相关知识，并且这方面的研究也鲜有报道.

本研究利用固定床厌氧反应器，探索从室温发酵阶梯式温度分化到低温、 中温和高温发酵产甲烷机制和主要产甲烷菌群演替变化，以期为室温沼气池改型或不改型提供理论依据.

接种污泥取自中国农业大学上庄实验基地运行良好的厌氧沼气发酵罐，总固体(total solids,TS)含量为3.04%，挥发性固体(volatile solids,VS)含量为1.93%. 牛粪采自中国农业大学营养代谢实验室，TS含量为15.92%，VS含量为13.79%.

本研究使用的升流式碳纤维固定床厌氧反应器(APBR)，用10 mm有机玻璃设计加工而成，外径24 cm，总高度27 cm，反应器有效总容积为10 L，反应器内使用比表面积为1 100 m² ·g^-1的炭纤维(日本Japan Carbon Company)作为微生物载体，反应器装置如图 1所示. APBR放在生化培养箱中控制温度.

图 1

Fig. 1

图 1 固定床厌氧反应器 (APBR)装置系统 Fig. 1 Schematic diagram of anaerobic packed bed reactor (APBR)

使用牛粪废水作为发酵底物，在室温(22℃±1℃)条件下以5 d(day)为1个HRT，COD为15 000 mg ·L^-1运行3个发酵罐，第11 d开罐取挂膜污泥样品(温度分化前原始样O点)，再驯化1个HRT后以每个HRT升降5℃的方法进行温度分化，分别达到低温R1(15℃±1℃)、 中温R2(37℃±1℃)和高温R3(55℃±1℃)，在第50 d完成温度分化后驯化1个HRT开罐取挂膜污泥样品，各罐运行温度如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 运行温度/℃ Table 1 Operation temperature/℃ 项目 1~15 d 15~20 d 21~25 d 26~30 d 31~35 d 36~40 d 41~45 d 45~50 d 51~55 d R1 22 17 15 15 15 15 15 15 15 R2 22 27 32 37 37 37 37 37 37 R3 22 27 32 37 42 47 52 55 55

表 1 运行温度/℃ Table 1 Operation temperature/℃

pH值： 用B-212型微量pH计(日本HORIBA)，每天测定各罐的进出水pH值； 化学需氧量(COD)： 采用标准重铬酸钾滴定法^[9]； 总产气量与气体成分： 采用Geotech Biogas测定仪(深圳昂为电子有限公司)进行测定； 挥发性脂肪酸(VFA)： 使用QP2010型气相色谱-质谱(日本岛津)测定； 总固体(TS)和挥发性固体(VS)： 用重量法测定TS和VS^[9].

取2 mL样品经12 000 r·min^-1×10 min离心后，弃掉上清液，再称取0.2～0.3 g的样品(准确记录克数)，按照型号为DP4011污泥基因组快速提取试剂盒(北京百泰克)的说明书操作提取DNA. 提取得到的DNA经检测、 分装后，放-20℃保存待用.

PCR样品经纯化回收后，按照试剂盒的方法步骤连接到质粒pGEM^®-T Easy Vector(日本Chiba). 随机各挑选100个克隆子，在所建立的克隆文库中挑取阳性转化子，引物用5′-TAATACGACTCA CTATAGGG-3′)和Sp6 (5′-ATTTAGGTGACACT ATAG-3′)进行菌落PCR.

经菌落PCR得到的模板DNA 用于限制性酶切片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism analysis，RFLP). 古菌单酶切体系： NE Buffer 2 μL，PCR产物3 μL，HinfⅠ 1 μL，加无菌水至总体积20 μL. 然后经过37℃水浴3 h，产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，比对并筛选出不同带型的克隆子后，再从克隆文库中挑选出这些不同带型的克隆子，放入1.5 mL的离心管(加入有LB培养基)中培养2 h后，送出测序(上海生工生物工程有限公司). 最后得到的DNA序列通过GenBank 网站，用BLAST软件进行比对.

根据所测定的16S rRNA序列，通过 http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/数据库进行相似性检索，进行同源性分析和相关信息检索，近缘种序列及本研究所获得序列一起载入 CLUSTAL X 软件包，通过程序MEGA 4构建系统发育树，分析亲缘关系及相似性^[11].

使用ABI 7500仪器(美国Applied Biosystems)进行定量PCR (Q-PCR)反应. 反应体系为： 使用2×TaqMan Universal PCR Master mix 来配成20 μL，反应体系如下： 1 μL的DNA模板，6.4 μL的去离子水，正反向引物各1 μL(引物的最终浓度为10μmol ·L^-1)，0.2 μL的TaqMan probe(最终浓度： 100 nmol ·L^-1)，0.4 μL的50×ROXⅡ(终浓度为1×)，10 μL的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)Reaction Solution(终浓度1×)(大连TaKaRa). 每次测定的时候，每种菌都需要设置一个空白对照.

使用两步扩增PCR程序： 94℃变性10 min，随后进行40个热循环(94℃变性10 s，60℃退火与延伸30 s)，注意MMB的退火温度和延伸唯独都为63℃.

Q-PCR使用的特异性引物对和5′-探针为： MMB (Methanomicrobiales； MMB282F，MMB749F，MMB832R； 扩增长度： 506 bp)； Msc (Methanosarcinaceae； Msc380F，Msc492F，Msc828R； 扩增长度： 408 bp)和Mst (Methanosaetaceae； Mst702F，Mst753F，Mst862R； 扩增长度： 164 bp). 这些引物都在TaqMan探针上标上了FAM(荧光基团)和BHQ-1(猝灭基团). 古菌标准菌株由NITE Biological Research Center (日本Chiba)提供，培养3个不同种的古菌作为标准菌株，并用其基因组DNA来制作定量PCR 的标准曲线： Methanomicrobiales(Methanospirillum hungatei NBRC100397，产甲烷微菌目)，Methanosarcinaceae (Methanosarcina acetivorans NBRC100939，产甲烷八叠球菌科)，Methanosaetaceae(Methanosaeta thermophila NCBR101360，产甲烷鬃毛菌科)分别用MMB、 Msc、 Mst. 采用传统的PCR手段用上文提到的相应引物，对每一株甲烷菌的目的rRNA 基因进行扩增，经纯化后，采用TIANgel Midi琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA并连接到pGEM-T Easy Vector(美国Promega)载体内，随后转化到大肠杆菌中，扩大培养后，采用PL0301高纯质粒小量快速提取试剂盒(北京博迈德)提取质粒. 然后对每一个质粒DNA按照10倍浓度梯度进行10²～10⁹ copies ·μL^-1不同梯度稀释，用于制作定量PCR 的标准曲线.

COD去除率是反映APBR处理粪便废水效果的一个重要指标，COD去除率越高处理效果越好. 各罐COD去除率如图 2所示. 在前10 d温度分化前COD去除率维持在55%左右，各罐运行稳定且具有较高的COD去除率； 在第11 d开罐取样，由于反应器进入空气，溶解氧增加，部分厌氧菌活性受到抑制，各罐COD去除率迅速下降，R1低至8%，但是取样后各罐的COD去除率迅速恢复，表明此时各罐具有较高的运行效率； 在温度分化的过程中，各罐的COD去除率基本符合R3>R2>R1的规律，且随着运行时间的增加，各罐的COD去除率也逐渐波动增加，但是到温度分化结束后，只有R3达到了温度分化前10 d的COD去除率，约为60%，而R1、 R2基本稳定在45%和25%左右，可能是由于11 d开罐取样对COD去除率造成的影响； R3 COD去除率在42℃和47℃交替时，32～38 d这个阶段出现一个低谷，在第36 d时仅为28%，可能是在此温度下嗜温微生物与嗜热微生物处于激烈竞争阶段，微生物群落比较混乱不稳定导致COD去除率下降.

图 2

Fig. 2

图 2 各发酵罐COD去除率变化 Fig. 2 Variations of COD removal in different fermentation tanks

产气量和甲烷含量是评估反应器稳定高效运行的重要指标. 各罐日产气量如图 3(a)所示，温度分化前各罐日产气量在2～4 L ·d^-1之间浮动，说明各罐能稳定运行. 在温度分化初期，各罐日产气量均上升，这与前人的研究结果相符，温度的增加引起产气量的临时增加^[12,13]. 但R1温度降到17℃，产气量在第18 d增加至4.6 L ·d^-1，这与前人的研究结果相反^{[5, 12, 14]}，这可能是由于在室温条件下存在很多食氢产甲烷菌，温度的降低刺激了食氢产甲烷菌的活性，从而导致产气量增加. 在温度分化过程中，R3在42℃和47℃时，32～36 d和38～42 d这两个时间段中，日产气量出现两个低谷，在35 d和40 d时仅为3.5 L ·d^-1和4.4 L ·d^-1，与此时R3 COD去除率降低相符，许多研究表明当温度升到略超过45℃，反应器稳定能明显降低，产气量下降^[15,16]，这可能是由于45℃是嗜温微生物和嗜热微生物生存的边缘^[13]. 温度分化结束后，R1、 R2、 R3日产气量分别稳定在2.3、 4.0、 8.5 L ·d^-1左右，可见温度分化后R3明显增加，R2略有增加，R1略有减少，说明温度升高有利于产气量的增加，升高温度促进微生物生长和基质利用率^[17]，伴随着更快的生化反应^[18]，从而使产气量增加. 但是从图 3(b)可以看出，温度分化对甲烷含量基本没有影响，维持在65%左右，但是CO₂含量略有增加，各项结果表明，各罐在各温度下都具有较高的产甲烷效率.

图 3

Fig. 3

图 3 各发酵罐日产气指标 Fig. 3 Variations of daily biogas production in different fermentation tanks

温度分化前各罐的甲酸、 乙酸和丙酸含量相对比较低(甲酸=0.005 g ·L^-1，乙酸=0.01 g ·L^-1，丙酸=0.02 mg ·L^-1)，表明各罐运行比较稳定，没有酸积累现象(图 4). 在16 d开始温度分化时，各罐甲酸、 乙酸和丙酸含量急剧上升，这与Dohnyos等^[19]研究结果相符，温度的突然改变引起挥发性脂肪酸的短暂积累，尤其是乙酸和丙酸，这可能是由于增加的部分氢压力促使专性食质子细菌的选择抑制作用的结果^[20]，导致产甲烷菌的活性受到抑制，不能及时地分解利用各类酸，从而影响了甲烷的产量. 随着阶梯式温度分化，甲酸、 乙酸和丙酸的含量略有下降，此后各酸的的浓度小幅度波动，表明微生物菌群处于扰动的环境中，不能及时地分解利用所有的有机酸，从而造成少量有机酸的积累. 温度分化后R1、 R2、 R3甲酸含量稳定在0.42、 0.18、 0.2 g ·L^-1左右，R1甲酸含量较高，约为R2和R3甲酸含量的2倍； R1、 R2、 R3乙酸含量稳定在0.62、 0.47、 0.43 g ·L^-1左右，R1乙酸含量略高； R1、 R2、 R3丙酸含量稳定在0.21、 0.44、 0.25 g ·L^-1左右，R2丙酸含量较高，约为R1和R3丙酸含量的2倍，丙酸不能直接被产甲烷菌利用，只能先通过产氢产乙酸菌将其分解成乙酸^[21],丙酸是产甲烷的主要限制因素^[22],中温罐丙酸含量的增加说明反应器表现出一定程度的不稳定性，但总体都未出现酸化现象.

图 4

Fig. 4

图 4 各发酵罐挥发性脂肪酸含量变化 Fig. 4 Variations of VFAs in different fermentation tanks

原始点建立了100个古菌克隆子，分析图 5可以发现在原始点处的污泥中，共有10个OTUs(operational taxonomic unit，操作分类单元)隶属于广古生菌门(Euryarchaeota)的产甲烷菌： 登录号AB181816的Methanobrevibacter sp.97和登录号GU936489的Methanobacterium sp.为嗜氢产甲烷杆菌MBT； 登录号NR_102903.1的Methanosaeta concilii GP6为产甲烷鬃毛菌Mst； 登录号NR_102454的Methanomethylovorans为甲烷八叠球菌Msc； 登录号KC876048.1为甲烷微菌MMB. 也有嗜热菌： 登录号AY099181.1为高温球菌属(Thermococcus mexicalis)，它是Antoine在1996年发现的一种从深海热液沉积物分离出来的新嗜热古菌； 登录号NR_074260.1的Methanothermobacter thermautotrophicus str.也为热杆菌属. 同时，原始底泥中还有2个OTUs隶属于泉古生菌门(Crenarchaeota)，泉古生菌门大多数为极端嗜热和嗜酸菌： 登录号HQ675790.1的Crenarchaeote和登录号GU187356.1的Thermofilum sp.都是属于泉古生菌门的嗜高温菌，它们都是化能无机自养型的古菌，能在厌氧的条件下促进碳循环.

图 5

Fig. 5

图 5 原始点产甲烷古菌 16S rRNA系统发育树 Fig. 5 16S rRNA phylogenetic tree based on the sequence of methanogenic archaea in the sample of original sludge

结果表明在温度变化开始之前的原始的底泥中，存在着大量的产甲烷古菌，并且有嗜高温菌的存在，这为后续的温度升高实验提供了可能性理论.

(1)低温罐R1温度分化后古菌群落结构分析(图 6). 经过低温驯化后，基于16S rRNA的克隆文库分析表明，100个克隆子分属于10个OTUs，比原始点污泥减少了3个OTUs. 登录号AB679168.1的Methanosaeta和NR_102903.1的Methanosaeta为产甲烷鬃毛菌Mst. 登录号NR_102454.1的Methanomethylovorans为甲烷八叠球菌Msc； 登录号KC876048.1和NR_028253.1为甲烷微菌MMB； NR_074235.1的Methanobrevibacter和AB368917.1的Methanobacterium为嗜氢产甲烷杆菌MBT.

图 6

Fig. 6

图 6 罐 R1产甲烷古菌 16S rRNA系统发育树 Fig. 6 16S rRNA phylogenetic tree based on the sequence of methanogenic archaea in the sludge sample of R1

表明在低温条件下，典型的产甲烷古菌也继续存活，其中包括嗜乙酸产甲烷菌Mst和Msc，以及嗜氢产甲烷菌MMB.

(2)中温罐R2温度分化后古菌群落结构分析(图 7). 经过低温驯化后，基于16S rRNA的克隆文库分析表明，100个克隆子分属于5个OTUs，与原始点污泥减少了8个OTUs. 登录号AJ244284.1的Anaerobic methanogenic archaeon(厌氧产甲烷古菌)能在15～30℃的时候降解纤维素，这可能是因为进料废水为牛粪，纤维素含量较高. 登录号NR_074235.1的Methanobrevibacter为嗜氢产甲烷杆菌MBT； FR749949的Methanocorpusculum sinense为甲烷微菌MMB； NR_102903.1的Methanosaeta为产甲烷鬃毛菌Mst.

图 7

Fig. 7

图 7 罐 R2产甲烷古菌 16S rRNA系统发育树 Fig. 7 16S rRNA phylogenetic tree based on the sequence of methanogenic archaea in the sludge sample of R2

中温条件下的菌群种类不够丰富，对比中温条件下丙酸含量较高，进一步说明了微生物群落单一不够稳定，可能是一小部分菌群迅速生长成为优势菌群，导致其他非优势菌群难以存活.

(3)高温罐R3温度分化后古菌群落结构分析(图 8). 经过高温驯化后，基于16S rRNA的克隆文库分析表明，100个克隆子分属于9个OTUs，与原始点污泥减少了4个OTUs. 登录号NR_102903的Methanosaeta为产甲烷鬃毛菌Mst； NR_074110的Methanosarcina为甲烷八叠球菌Msc； NR_028163的Methanolinea tarda为甲烷微菌MMB； KC139248的Methanococcus voltae PS为沃式甲烷球菌(Methanococcus)，刘莉等^[23]对沃式甲烷球菌的研究表明其能利用CO产甲烷. 结果表明，在高温环境中，也存在着嗜乙酸产甲烷菌Mst和Msc，以及嗜氢产甲烷菌MMB.

图 8

Fig. 8

图 8 罐 R3产甲烷古菌 16S rRNA系统发育树 Fig. 8 16S rRNA phylogenetic tree based on the sequence of methanogenic archaea in the sludge sample of R3

图 9中，产甲烷微菌MMB为嗜氢产甲烷菌，而甲烷八叠球菌Msc和甲烷鬃毛菌Mst为嗜乙酸产甲烷菌，这3种主要产甲烷菌基因总数在温度分化后都有下降的趋势，并且R1＞R2＞R3. 温度分化前，Mst为主要优势产甲烷菌，其16S rRNA浓度(以VS计，下同)为8.79×10⁹ copies ·g^-1，约占3种产甲烷菌基因总数的98.7%； 其次是MMB，为9.14×10⁷ copies ·g^-1； Msc最低，仅为2.30×10⁷ copies ·g^-1，不到基因总数的0.3%. 温度分化后，各罐Mst虽然略有减少，但是仍然占主导地位，R1=8.24×10⁹ copies ·g^-1(占基因总数的99.6%，是分化前的93.7%)，R2=5.07×10⁹ copies ·g^-1(88.5%，57.7%)，R3=2.56×10⁹ copies ·g^-1(95.5%，29.1%)，Nissila等^[24]的研究表明，若在厌氧发酵反应器中存在大量的Mst，将有助于促进颗粒污泥的形成，而颗粒污泥的形成能有效提高厌氧体系的发酵效率，因此，Mst往往是活性较好的颗粒污泥中的主导产甲烷菌^{[25, 26, 27]}. 而温度分化后，MMB则表现为在R1明显减少，约占分化前的26.4%； R2则显著增加，为6.59×10⁸ copies ·g^-1是分化前的7倍之多，占基因总数的11.5%； R3则是略微的增加，其影响不大； 可能是温度分化过程中，中温环境给MMB创造了更有利的生长环境. 甲烷八叠球菌Msc为嗜乙酸产甲烷菌，其数量表明在整个过程中，Msc为非优势种群，温度分化后各罐Msc数量都较温度分化前大量减少，尤其是R2下降为1.92×10⁶ copies ·g^-1，仅为分化前的8.3%，R1为分化前的42.1%，R3为分化前的35.1%.

图 9

Fig. 9

图 9 产甲烷古菌的定量 PCR分析 Fig. 9 Quantitative changes in the 16S rRNA gene concentration of methanogens under different treatments

温度是对甲烷发酵的处理效率具有很大影响的因素之一，甲烷发酵相关的厌氧菌群特别是产甲烷菌对温度的变化很敏感. 16S rRNA克隆文库分析表明，温度分化导致古菌群落多样性减少，R1减少了3个OUTs，R2减少了5个OUTs，R3减少了4个OUTs，但是主要产甲烷菌还存在，比如Mst、 MMB、 Msc等. Mst能够形成稳定的丝状结构，有利于污泥颗粒化过程及高负荷下系统的稳定，在多种成分复杂的废水厌氧消化过程中被检测到. Lerma等^[28]利用SSCP研究了处理有机废弃物的工业化反应器，发现古菌群中Mst占主导地位，Siggins等^[29]利用16S rRNA克隆文库研究了低温(7℃)处理三氯乙烯废水微生物群落，结果显示嗜乙酸型Mst在所有反应器中均占优势，这与本实验中Mst占优势的结论相一致. Mst只能利用乙酸作为碳源，对乙酸有强亲和性^[22]，因此，乙酸对Mst的生长与代谢起着至关重要的作用，大量乙酸的存在有助于促进Mst的生长. 接种污泥Mst丰富的反应器运行更加稳定，而其它产甲烷菌占优势的反应器在启动阶段更容易产生挥发性脂肪酸大量积累以致启动过程受到抑制^[30]. 温度分化结束后，各罐乙酸含量R1>R2>R3，对比定量PCR图，Mst浓度大小也为R1>R2>R3，这表明乙酸对Mst生长代谢的正相关性和重要性.

MMB只能利用CO₂作为碳源，H₂以及甲酸盐等作为电子供体最终生成甲烷，牛粪原料进料之前的酸化可能使得整个体系内的氢分压的增大，再加上MMB具有较高的抗逆性(抗酸性)^[31]，因此促进了MMB的大量繁殖. 温度分化后R2 MMB数量明显增加，而R2丙酸含量也高于R1和R3，Kim 等^[25]认为，厌氧发酵系统里面的甲烷鬃毛菌MMB与丙酸的平均浓度存在着正相关的关系.

甲烷八叠球菌Msc为嗜乙酸产甲烷菌，其数量表明在整个过程中，Msc为非优势种群. Jetten等^[32]曾经报道，通常情况下，Msc若需正常代谢，环境中的乙酸阈值最低不低于60 mg ·L^-1，远远高于Mst的最低阈值0.3～1.2 mg ·L^-1. 尽管各罐在温度分化过程中的乙酸浓度同时满足二者的利用需求，但仍以Mst为主，这与张兰英等^[33]中得出的“乙酸浓度较低时，Mst占优势； 乙酸浓度较高时，Msc占优势”结论有所差别. 在温度分化过程中，各罐Msc数量都大量减少，可能是牛粪成分比较复杂，存在抑制Msc生长的因素，也可能是因为Msc为球形菌，容易随废液出水流出反应器，导致后续各罐数量减少^[34].

(1)温度分化对APBR反应器处理效果具有显著的影响. 在进水COD为15 000 mg ·L^-1，HRT为5 d的条件下，发酵温度从室温阶梯式分化到15、 37和55℃，COD的去除率和日产气量随温度增加而增加，分化后日产气量分别为2.3、 4.0和8.5 L ·d^-1，但是甲烷含量维持在60%左右，基本保持不变.

(2) 温度分化影响产甲烷古菌群落的丰度和多样性. 温度分化过程古菌多样性减少，R2减少比较严重，产甲烷菌Mst、 MMB、 Msc总基因浓度都有所减少，Mst仍为主导产甲烷菌，只有MMB在R2和R3中有不同程度的增加，分别为分化前的7.2倍、 1.2倍.