为了解决水体中氨氮污染问题，各国学者共同研究开发出一批新型生物脱氮工艺诸如短程硝化-反硝化工艺^[1]、 SHARON-ANAMMOX^[2]、 OLAND^[3]、 CANON^[4]等. 这些新工艺的首要步骤都是将硝化过程控制在亚硝化阶段，实现亚硝酸盐的积累，关键在于有效富集氨氧化菌(AOB)并抑制亚硝酸盐氧化菌(NOB).

氨氮作为AOB的底物在超过一定浓度时反而会对AOB产生抑制^[5]，但是目前人们对氨氮抑制AOB的观点不一. Shrama等^[6]和Hou等^[7]认为AOB真正利用的底物是氨氮中的游离态氨(FA)而不是NH₄⁺离子. Jubany等^[8]研究发现FA对AOB和NOB都有抑制作用，但是NOB对FA更为敏感，因此FA是实现亚硝化的重要控制因素. 在以往关于FA抑制AOB的研究中难以做到反应条件恒定，特别是pH会随着反应的进行逐渐降低，无法排除其他因素对结果的干扰. 在非单一变量条件下不同研究者得到的FA对AOB的抑制阈值差异明显，范围跨度大(9～613 mg ·L^-1)^[9-12]. 这样的结果不能真实反映FA抑制AOB的普遍规律，对实际工艺缺乏指导意义.

在本实验中严格控制反应过程中的各项条件恒定，做到单因子分析. 本实验旨在分析氨氮对AOB的抑制形态，并且通过进水氨氮的浓度梯度实验探索抑制物作用于AOB的一般规律，以期为在新型生物脱氮工艺中实现亚硝酸盐积累提出一些可行的建议.

实验所用的装置如图 1所示，为圆柱形玻璃反应器，有效容积2.5 L. 反应器内置搅拌器、 水浴夹套、 ORP实时监控装置和温度、 pH自动调节装置. 反应器采用生物膜系统，以海绵块为载体，连续流方式进水，水力停留时间为4.76 h，反应温度控制为30℃.

图 1

Fig. 1

图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the reactor

实验使用的生物膜以海绵块为载体，载体的堆积体积占反应器有效容积的0.1. 该生物膜取自本研究所的亚硝化反应器，其亚硝化速率稳定在0.9 kg ·(m³ ·d)^-1.

实验进水为人工配水，其中氨氮和碳源分别由NH₄Cl和NaHCO₃提供. 微量元素组成^[13]为: MgSO₄ ·7H₂O 0.3 g ·L^-1、 KH₂PO₄ 0.027 g ·L^-1、 CaCl₂ 0.136 g ·L^-1、 微量元素Ⅰ 1.0 mL ·L^-1、 微量元素Ⅱ 1.25 mL ·L^-1. 微量元素I组成(g ·L^-1)为: FeSO₄ 5、 EDTA 5； 微量元素Ⅱ组成(g ·L^-1)为: EDTA 5、 CuSO₄ ·5H₂O 0.25、 ZnSO₄ ·7H₂O 0.043、 MnCl₂ ·4H₂O 0.99、 CoCl₂ ·6H₂O 0.24、 H₃BO₄ 0.014、 NaMoO₄ ·2H₂O 0.22、 NaSeO₄ ·10H₂O 0.2.

各种指标检测方法参照文献^[14]. NH₄⁺-N: 钠氏试剂分光光度法； NO₂^--N: N-(1-萘基)-乙二胺光度法； pH、 ORP均采用METTLER-TOLEDO电极实时监测； FA浓度(以N计)按公式(1)^[15]计算:

以出水中NO₂^--N浓度和亚硝化速率来表征抑制物对AOB的抑制程度，通过ORP控制反应器中的DO. 定义当出水NO₂^--N浓度降为最大值的一半时称为半抑制水平(I₅₀)，此时的抑制物浓度称为半抑制浓度(IC₅₀).

氨氮抑制形态分析: 待反应器运行稳定后，将进水氨氮浓度升至2000 mg ·L^-1. 控制温度为30℃，pH为8.3，ORP为100 mV，定时检测出水中的NH₄⁺-N和NO₂^--N. 当反应达到半抑制水平后将pH降至7.0，以此改变反应器中FA和NH₄⁺离子的浓度，结合出水NO₂^--N浓度变化情况来分析AOB的真正抑制物.

抑制物对AOB的作用规律: 待反应器运行稳定后，控制温度为30℃、 pH为8.3、 ORP为100 mV. 进水氨氮浓度分别为1000、 1500、 3000、 4000、 5000 mg ·L^-1，定时检测出水中的NH₄⁺-N和NO₂^--N. 在提高进水氨氮浓度时同步增大曝气量以保证反应器中DO不变.

设定进水氨氮浓度2000 mg ·L^-1，温度为30℃，HRT为4.76 h，初始pH为8.3. 反应器运行19 h后将pH降到7.0继续运行8 h，出水中NH₄⁺-N和NO₂^--N浓度变化如图 2所示. 在反应开始后的4 h内，反应器中NH₄⁺-N浓度由0升到1075.84 mg ·L^-1，出水中NO₂^--N浓度升到最大值275.3 mg ·L^-1. 在此过程中亚硝化速率上升到最大值1.39 kg ·(m³ ·d)^-1. 在4~19 h的过程中反应器内NH₄⁺-N浓度持续上升然后趋于稳定. 在此阶段出水中NO₂^--N浓度最终下降至134.4 mg ·L^-1，亚硝化速率降低至0.68 kg ·(m³ ·d)^-1，此时反应达到半抑制水平.

图 2

Fig. 2

图 2 进水氨氮2000 mg ·L-1下出水氨氮、 亚硝态氮浓度变化 Fig. 2 Variation of effluent NH4+-N and NO2--N at an influent NH4+-N of 2000 mg ·L-1

反应进行到19 h时将pH降低至7.0来改变FA浓度，此后出水中NO₂^--N浓度开始回升. 27 h后出水中NO₂^--N浓度上升到210.7 mg ·L^-1，亚硝化速率回升到1.06 kg ·(m³ ·d)^-1，对AOB的抑制得以解除.

氨氮在水中存在两种形态即NH₄⁺离子和FA，两者存在如下平衡关系:

由式(1)、 (2)可知FA浓度与氨氮浓度、 温度、 pH有关，在氨氮浓度和温度均不变的情况下，可通过降低pH以降低FA的浓度. 如图 3所示为在进水氨氮2000 mg ·L^-1时出水中NO₂^--N和FA浓度变化趋势. 反应初始阶段出水中NO₂^--N、 FA浓度均上升，当FA增大到137 mg ·L^-1后AOB活性开始受到抑制，这与最初报道的FA对AOB的抑制浓度10～150 mg ·L^{-1 [16]}相符. 此后FA继续升高到235 mg ·L^-1，AOB达到半抑制水平. 在FA升高的过程中NH₄⁺离子同时升高，因此实验进行到此尚无法判断氨氮对AOB的抑制形态. 在反应进行到19 h时将pH降低到7.0，根据FA与NH₄⁺离子间的平衡关系可知FA浓度降低，而NH₄⁺离子浓度继续升高. 在19～27 h反应器中FA维持在13 mg ·L^-1左右，NO₂^--N浓度回升到210 mg ·L^-1，AOB活性恢复. Park等^[17]研究表明pH为7.0时，pH主要通过影响氨氮在水中的平衡来影响亚硝化反应. 这很好地说明了FA是AOB的抑制物，与Tor等^[18]的研究结果一致.

图 3

Fig. 3

图 3 FA对亚硝化的影响 Fig. 3 Influence of FA on nitritation

如图 4所示，在稳定运行的反应器中，控制温度恒定为30℃，pH为8.3，进行氨氮浓度梯度实验. 如图 4(a)所示在进水氨氮浓度为1000 mg ·L^-1时，反应进行到71 h后出水亚硝酸盐浓度仍未出现下降趋势. 这说明在当前条件下该浓度未能对AOB产生抑制. 如图 4(b)所示，进水氨氮浓度为1500 mg ·L^-1时，反应25.5 h后达到半抑制水平，此时反应器中氨氮浓度为1080 mg ·L^-1. 随着进水氨氮浓度的提升，反应达到半抑制所需的时间缩短，并且产生半抑制的氨氮浓度相应提高. 如图 4(e)所示，当进水氨氮浓度高达5000 mg ·L^-1时，达到半抑制水平仅需7.9 h，半抑制氨氮浓度4100 mg ·L^-1.

图 4

Fig. 4

图 4 不同浓度下出水氨氮、 亚硝态氮浓度变化 Fig. 4 Variation of effluent NH4+-N and NO2--N at various concentration

综上所述，在达到相同抑制水平的前提下，抑制浓度与响应时间有密切关系. 进水氨氮浓度越大，达到半抑制所需的时间越短，而且当氨氮浓度低于某一值时将不能对AOB构成抑制.

表 1中列出了不同进水氨氮浓度下达到半抑制水平所需的时间t和半抑制FA浓度IC_50FA. 数据表明不同进水氨氮浓度下达到半抑制水平所需的时间t有显著差异，并且IC_50FA与其反应时间t呈现明显相关性. 以往的研究中并没有考虑到半抑制水平I₅₀、 半抑制FA浓度IC_50FA与反应时间t的关系，只将FA浓度作为产生抑制的依据，但是在一些实验中低浓度FA^[19]经过足够长的时间后仍能对AOB产生抑制.

表 1(Table 1)

表 1 不同进水氨氮下达到半抑制所需反应时间t与IC50FA浓度 Table 1 Reaction time and IC50FA at various influent NH4+-N 进水氨氮浓度/mg·L -1 1500 2000 3000 4000 5000 反应时间 t/h 25.5 17 15 12 7.9 半抑制FA浓度IC 50FA/mg·L -1 160 235 345 390 600

表 1 不同进水氨氮下达到半抑制所需反应时间t与IC50FA浓度 Table 1 Reaction time and IC50FA at various influent NH4+-N

将表 1中的反应时间t与半抑制FA浓度IC_50FA进行拟合发现两者具有指数函数关系，相关系数为0.96，拟合曲线及方程如图 5所示. FA对AOB的抑制受FA浓度和反应时间t的影响，则I₅₀、 IC_50FA、 t三者关系可表示为I₅₀=F(IC_50FA，t)，IC_50FA值越小达到I₅₀所需的反应时间t越长. 图 5中的曲线为半抑制临界曲线，曲线上任意一点均表示该状态下达到I₅₀的最小IC_50FA和t，在该点处中可以通过增大FA浓度或延长反应时间来达到半抑制水平.

图 5

Fig. 5

图 5 半抑制水平下t与IC50FA关系 Fig. 5 Correlation between t and IC50FA under the condition of half inhibition

由拟合方程分析可知当t趋向正无穷时半抑制临界曲线将无限趋近直线IC_50FA=98.84. 这在实际反应中表现为当FA浓度小于98.84 mg ·L^-1时无论反应进行多长时间都不会对AOB造成抑制，即98.84是本实验条件下FA对AOB产生抑制的最小值. 在图 5中半抑制临界曲线和直线IC_50FA=98.84将象限分为3个区域(Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ). 反应进行到任意时刻所对应的点若落到区域Ⅰ这说明此时没有达到半抑制水平，但是可以通过提高FA浓度至相应的IC_50FA来达到半抑制水平； 若点落到区域Ⅱ则说明虽然此时尚未达到半抑制水平，只要反应进行足够长的时间或提高FA浓度至相应的IC_50FA就能达到半抑制水平； 若点落到区域Ⅲ则说明已经达到半抑制水平. 在浓度梯度1000 mg ·L^-1的实验中，反应器中FA浓度最终稳定为90 mg ·L^-1，反应进行足够长的时间后仍未对AOB产生抑制，这与拟合方程的预测结果一致. 陈建伟^[12]在研究高活性短程硝化菌动力学特性时得到半抑制FA浓度为613.9 mg ·L^-1，反应时间为10 h. 该点落到图 5中区域Ⅲ，这与上述判断结果相符.

目前已有报道中存在FA浓度小于98.84 mg ·L^-1仍能对AOB产生抑制的情况，这表明FA对AOB的抑制除了受FA浓度和反应时间的影响外可能还与一些其他因素有关. Tor等^[20]研究发现限制碳源会放大FA对AOB的抑制作用； Tokutomi等^[21]发现用NaHCO₃代替NaOH提供碱度有利于亚硝酸盐的积累并提出了以高浓度IC(inorganic carbon)来促进AOB活性的策略； Wu等^[22]经过研究发现较高的反应温度可以削弱FA对AOB的抑制作用； Villaverde等^[23]和姚晓园等^[24]均在实验中观察到亚硝酸盐的积累与系统生物量有关，当FA/MLVSS高于某个值后才会对AOB产生抑制，这意味着提高反应器中的生物量可以减弱抑制作用. 更多FA抑制AOB的影响因素仍有待研究. 在本实验中以NaHCO₃提供碱度及AOB所需碳源，C/N控制为1，此时IC不会限制亚硝化^[25]，温度为30℃. 综合各种因素本实验得到的半抑制FA浓度大于其他研究报道值(70～300 mg ·L^-1)^[26].

(1)在进水氨氮浓度为2000 mg ·L^-1时，反应进行17 h后AOB达到半抑制水平，然后通过改变pH使FA浓度降低，AOB活性恢复从而验证了FA是AOB的抑制物.

(2)经拟合发现半抑制FA浓度IC_50FA和达到半抑制水平所需反应时间t呈指数关系，在本实验条件下两者的关系方程为IC_50FA=1314.17 e^(－t/8.18)+98.84. 通过对方程的分析得出本实验条件下FA对AOB产生抑制的最小值为98.84 mg ·L^-1.

(3)FA对AOB的抑制受FA浓度和反应时间的影响，当FA浓度大于可对AOB产生抑制的最小值且经过相应的反应时间后将对AOB产生抑制. 通过对半抑制临界曲线的分析可知: 随着FA浓度逐渐降低至可对AOB产生抑制的最小值，达到半抑制水平所需反应时间随之延长到无穷大.