黄连(Coptis chinensis)属毛茛科多年生草本植物，其根茎内含有小檗碱(berberine)、 黄连碱(coptisine)、 表小檗碱(epiberberine)和药根碱(jatrorrhizine)等30余种生物碱，具有消炎、 抗菌、 泻火解毒之效. 在水产养殖中，黄连根茎和制剂广泛用于鱼类多种感染性疾病的防治^{[1, 2, 3]}. 此外，全国60%的黄连集中种植于重庆市三峡库区的石柱县^[4]，在黄连生长过程中，根茎中的生物碱经降雨淋溶、 枯枝落叶和根系分泌作用进入土壤，再经地表地下径流进入水体^[5]. 因此，黄连生物碱可直接和间接进入水体，作用于水生动物、 植物和微生物，对水体生态系统产生持续影响^[6].

黄连根茎中的生物碱选择性抑制植物、 原生动物和微生物的生长繁殖^[7]，但人们对浮游动物的急性毒性作用研究甚少. 水溞食用绿藻，鱼类以水溞为饵料，故水溞是水生食物链的关键环节，与水体健康和生产力密切相关^[8]. 三峡库区是全国水资源保护的重点地区之一，三峡水库的水质涉及到南水北调和下游亿万人民的生产生活. 三峡库区水产养殖发达，同时，又是大规模集约化种植黄连的区域，故了解黄连种植和使用产生的水生态风险有益于保护三峡库区的水资源. 为此，试验研究了黄连根茎浸提物对隆线溞的急性毒性作用，以期为评估黄连浸提物对水体生产力和水生态的影响提供科学依据.

选取自主选育的、 趋光性强的隆线溞(Daphnia carinata，Dc)为试验材料. 原种采集于重庆三峡库区的自然水体，经多代孤雌生殖、 纯化，获得单克隆生物株，现保存于西南大学资源环境学院水溞实验室.

在(20±0.5)℃、 光照周期12 h ·d^-1和光强1200 lx的条件下，用充分曝气脱氯的自来水培养水溞，每日08:00投喂新鲜的斜生栅藻(2×10⁵个 ·mL^-1)，至4 d龄期备用.

标准毒物的稀释水为ISO6341-1989人工标准水(以下简称标准水)^[9]，溶液的组成为： 0.294 g ·L^-1 CaCl₂ ·H₂O，0.123 g ·L^-1 MgSO₄ ·7H₂O，0.065 g ·L^-1 NaHCO₃，0.006 g ·L^-1 KCl，用预先充氧至饱和(20℃)的去离子水配制，pH 7.5~7.8，DO≥8.4 mg ·L^-1，用1 mol ·L^-1的HCl或NaOH调节pH至7.8，静置24 h后使用.

供试黄连取自石柱县黄水镇5年生黄连根茎，(80±1)℃烘干，粉碎过2 mm筛，称取100.00 g，加去离子水800 mL，37℃水浴，浸提24 h，过滤，定容至1000 mL，配成质量浓度为100 g ·L^-1的黄连根茎浸提液(CRE)，置于4℃冰箱避光保存. 样品由西南大学药学院HPLC测定，其生物碱总含量(total alkaloid，TA)为176.1 mg ·L^-1. 其中，小檗碱101.1 mg ·L^-1，黄连碱28.7 mg ·L^-1，巴马汀26.6 mg ·L^-1，表小檗碱18.1 mg ·L^-1，药根碱1.6 mg ·L^-1.

在多次预备试验的基础上，根据寇氏法，等比法设置处理浓度，组间比值为1.87. 试验设置5个处理，分别为(CK)0、 (A)25、 (B)47、 (C)88、 (D)164 mg ·L^-1的CRE，各处理相当于含有总生物碱0、 0.044、 0.082、 0.153、 0.285 mg ·L^-1. 试验重复5次，共做3个批次.

试验在(20±0.5)℃条件下进行，先将隆线溞在200 mL的标准水中润洗3次，每次5 min，每组随机选取10只隆线溞，置于100 mL处理浓度的CRE溶液中，在1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 24、 48 h观察水溞活动及存活情况.

水溞活动受抑制标准为： 轻微扰动溶液15 s，个体不能游泳活动(即触角仍可活动)； 死亡判断标准为： 溞体沉入水底，轻轻转动容器无任何反应^[10]. 在观察期间，停止喂食，其余同常规培养.

试验处理、 试验温度、 试验前水溞的预处理均同1.2.1节. 即每组随机取隆线溞10只，置于100 mL处理浓度的CRE溶液中，1200 lx光照培养3 h. 然后，将水溞转入自主设计的水溞趋光测定装置^[11](图 1)，暗适应5 min后，在1200 lx光照下，刺激10 min，从第6 min开始，每隔1 min记录各光区内的水溞数目. 试验重复5次，共做3个批次.

采用寇氏法计算24 h和48 h的半致死浓度和泳动受到抑制的半抑制浓度(半抑制浓度)； 水溞趋光指数(phototaxical index，I_p)的计算公式如下^[12]：

图 1

Fig. 1

图 1 水溞趋光行为测试装置 Fig. 1 Setup for quantification of Daphnias photoaxis behavior in light tight box U、 M1、 M2、 L分别代表观察装置上部、 中上部、 中下部和底部的水溞数目

用改进寇氏法计算LC₅₀和EC₅₀. Excel对试验数据进行基本计算，SPSS 17.0软件进行方差分析，多重比较采用Duncan法，显著水平设为0.05.

2.1 CRE对水溞存活率的影响

表 1可见，CRE浓度与水溞存活率之间存在明显的剂量-效应关系，可用表示. 将水溞置于供试溶液中，24 h和48 h的半致死浓度分别是160.20 mg ·L^-1和135.04 mg ·L^-1.

表 1(Table 1)

表 1 CRE对隆线溞存活率的影响 1) Table 1 Effects of CRE on the mortality rate of Daphnia carinata 时间/h LC50/mg ·L-1 95%置信区间 毒性方程 相关系数 24 160.20 145.06~175.36 0.992** 48 135.04 116.18~153.90 0.997** 1)**表示在P≤0.01水平上有显著差异，下同； y表示累计致死率(%)，x表示CRE浓度(mg ·L-1)

表 1 CRE对隆线溞存活率的影响 1) Table 1 Effects of CRE on the mortality rate of Daphnia carinata

2.2 CRE对水溞的游动能力的影响

表 2可见，CRE浓度对水溞的活动能力之间也存在剂量-效应关系，可用y=ax+b表示. 将水溞置于供试溶液中，CRE对水溞24 h和48 h的半抑制浓度分别是116.87mg ·L^-1和86.94 mg ·L^-1.

表 2(Table 2)

表 2 CRE对隆线溞活动能力的影响 1) Table 2 Effects of CRE on the movement of Daphnia carinata 时间/h EC50/mg ·L-1 95%置信区间 毒性方程 相关系数 24 116.87 92.76~140.99 y=0.41x+2.33 0.805** 48 86.94 66.75~107.13 y=0.55x+2.50 0.914** 1)y表示累计抑制率(%)，x表示CRE浓度(mg ·L-1)

表 2 CRE对隆线溞活动能力的影响 1) Table 2 Effects of CRE on the movement of Daphnia carinata

2.3 CRE对水溞趋光性的影响

水溞趋光指数(I_p)随着CRE浓度的增大而显著降低(图 2). 在CRE溶液中，当CRE浓度为4.27 mg ·L^-1时，水溞I_p显著降低； 当CRE浓度为25.00 mg ·L^-1时，趋光性由正变负.

图 2

Fig. 2

图 2 CRE对隆线溞趋光性的影响 Fig. 2 Effects of CRE on the phototaxis of Daphnia carinata

3 讨论

在集约化水产养殖过程中，黄连根茎或制剂常用于防治鱼、 虾、 蟹、 贝类、 海参的多种细菌和病毒引起的疾病^[13]，如鱼类的暴发性出血病、 痘疮病、 腹水病、 疖疮病、 肠炎病、 烂鳃病、 烂尾病、 弧菌病、 爱德华菌病、 细菌性败血症、 白头白嘴病、 白皮病、 腐皮病； 虾类的暴发性红腿病、 烂眼病、 白斑病、 黑斑病、 甲壳溃疡病、 颤抖病、 水肿病、 黑鳃病、 红体病、 肌肉坏死症等^{[14, 15, 16, 17]}. 每公斤鱼体的黄连根茎(或制剂)用量高达20 mg左右^[18]，并需要连续或隔日投药，在水体中的浓度可达16.72 mg ·L^-1，是水溞趋光指数发生显著变化浓度的2.92倍，故防治鱼病的用药量可能影响水溞趋光性^[19]. 水溞作为水体生态系统中的重要成分，是连接水生动、 植物生产的关键环节，也关系到水体的健康质量^{[20, 21, 22, 23]}. 值得注意的是，种植黄连后的土壤一般需要休耕3~5 a，说明进入土壤环境中的黄连生物碱难以降解，持续存在^[24]. 因此，黄连生物碱进入水体之后，半衰期可能较长，对水体生态系统产生的影响可能较大. 此外，水溞半致死浓度>半抑制浓度>趋光指数显著改变的浓度，即引起水溞的趋光性显著改变的CRE浓度远远低于半致死浓度，说明利用水溞趋光性的改变来监测毒物的危害更加灵敏和快捷.

化学方法可以测定有害物质的绝对含量，生物监测能了解已知和未知毒物的生物有效性，故生物监测是水质监测的重要环节，可总体上评价水体的健康质量^[25]. 水溞个体小、 繁殖迅速、 容易饲养，可方便、 经济地获得大量的试验材料，通过孤雌生殖，可获得遗传性相同的个体，有效减小试验误差. 因此，在水质生物监测中，水溞是国际公认的标准试验生物^[26~29]. 但是，水溞死亡和游泳活动观察误差大，耗时长； 相反，水溞趋光性对毒物反应灵敏. 研究中导致隆线溞趋光指数发生显著改变的CRE浓度比24 h半致死和半抑制浓度分别低36.51倍和26.37倍，测试时间缩短到3 h，且易于观察.

4 结论

黄连根茎浸提物对隆线溞具有急性毒性作用，对隆线溞的泳动能力、 存活率和趋光性产生影响. 同时，半致死浓度>半抑制浓度>趋光指数显著改变的浓度，利用水溞的趋光性，可以显著提高监测黄连生物碱的灵敏度.