纳米科技是20世纪80年代末诞生，并正在飞速崛起的高科技，预计到2015年，与纳米技术相关的产品价值将达2.5亿美元^[1]. 纳米材料因具表面效应、 小尺寸效应、 量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等特殊的理化性质而被广泛应用. 然而，纳米材料在生产和使用过程中将不可避免地通过直接或间接的途径进入环境，对人类健康和生态环境带来潜在的危害^[2]. 水体是人工纳米颗粒的主要最终归宿，其在水体中行为和生物安全引起人们的极大讨论和关注^[3]. 纳米氧化锌(nano-ZnO)是一类重要的纳米材料，因具有独特的荧光性、 抗菌性及吸收紫外线的能力，在气敏传感器、 药物缓释剂、 微电子、 航空等领域有着广阔的应用前景和发展潜力^{[4, 5, 6]}. 根据来源不同，每年全球产生的nano-ZnO产量能达550～33 400 t^{[7, 8]}. 随着nano-ZnO的广泛应用，对生物的毒性作用和对环境带来的安全隐患也受到越来越多学者的关注^[9].

研究者们采用不同的实验对象评估nano-ZnO的毒性，发现nano-ZnO可引起啮齿类动物肺部上皮细胞的炎症、 呼吸毒性、 氧化损伤及生物体的氧化应激等反应^{[10, 11]}. 在研究nano-ZnO对人类Caco-2细胞的毒性中发现，细胞中的SOD水平和ROS水平明显升高，并且这种细胞毒性与暴露浓度存在一定的剂量关系^[12]. Hao等^[13]报道了nano-ZnO能在鲫鱼的不同组织中积累，体内脂质过氧化物含量均会提高，鳃、 肝、 脑组织对nano-ZnO的毒害反应最为敏感. 细胞中的ROS受到组织中抗氧化酶系统的影响，nano-ZnO能增加细胞内的ROS，从而诱导细胞的凋亡^[14]. 此外，有研究报道nano-ZnO在胞内和胞外均会造成毒性，产生氧化应激和ROS^[15]，进而引起机体损伤.

鱼体内的抗氧化酶防御体系对环境污染物敏感，因此鱼类组织中的抗氧化酶能作为环境污染物的生物标记物^{[16, 17, 18]}. 斑马鱼(Danio rerio)是国际标准化组织(ISO)推荐使用的鱼类毒性试验动物^[19]. 因此被广泛应用于毒理学^[20]、 环境保护^[21]、 发育生物学^[22]等研究，已成为一种重要的生物模型.

nano-ZnO对斑马鱼胚胎的发育毒性研究较多，然而nano-ZnO对生物毒性机制还不甚明确. 由于生物在不同的生长阶段对nano-ZnO敏感性不同. 因此，研究nano-ZnO对成年斑马鱼的毒害更能反映nano-ZnO对水体中多数生物的影响. 本研究以模式生物斑马鱼为对象，通过nano-ZnO诱发斑马鱼肝组织损伤，肝脏中抗氧化酶活性的变化及肝脏中凋亡基因的影响，探讨nano-ZnO暴露下对斑马鱼的毒害，以期为nano-ZnO对水生生物的影响和组织毒害提供理论依据.

斑马鱼购于宁波市天胜花鸟市场，鱼龄120 d左右，平均体长为(3.00±0.6) cm，平均体重为(0.36±0.1)g，驯养7 d后用于急性毒理试验，驯养用水为自来水曝气12 h，水温(26±0.5)℃，光照/黑暗周期为14 h ∶10 h，早晚投食各1次.

nano-ZnO(25 nm±2 nm)： 购于杭州大洋纳米新材料有限公司，RNAiso Plus试剂盒、 SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)试剂盒购于TaKaRa，超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)、 过氧化氢酶(CAT)试剂盒购于南京建成生物研究所，其他试剂均为分析纯.

选择健康活泼的斑马鱼，每容器30尾，nano-ZnO浓度设为0.05、 0.1、 5、 10、 25、 50 mg ·L^-1，另设对照组，每组3个平行，暴露实验参照GB/T 13276-1991，约1 L的水中暴露1 g斑马鱼，暴露4、 24、 96 h后解剖取肝组织，部分肝组织用于RNA提取. 其余肝组织加入预冷的匀浆介质(0.01 mol ·L^-1 Tris-HCl、 0.001 mol ·L^-1 EDTA-2Na、 0.01 mol ·L^-1蔗糖，pH 7.4)研磨，2 000～4 000 r ·min^-1离心，上清用于生理指标测定. 另取7、 15、 30 d斑马鱼的肝组织，固定于10%甲醛溶液中，用于石蜡切片的制作.

取固定24 h后的肝组织，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，H-E染色，中性树胶封片，Olympus BX-51显微镜下观察并拍照(图 1).

图 1

Fig. 1

图 1 nano-ZnO胁迫对斑马鱼肝组织结构的影响(H-E，×400) Fig. 1 Effect of nano-ZnO on structural change in liver of zebrafish (H＆E stain,×400) a： 对照组，b： 0.05 mg ·L-1，c： 0.1 mg ·L-1，d： 5 mg ·L-1，e： 10 mg ·L-1，f： 25 mg ·L-1，g： 50 mg ·L-1； HC： 肝细胞，HS： 肝血窦，HP： 肝板，HM： 肝巨噬细胞，PN： 核固缩，CV： 细胞质空泡化，Oe： 组织水肿，V： 空泡化，LM： 淋巴细胞与巨噬细胞浸润

取匀浆的肝组织上清液，样品总蛋白质含量和氧化应激指标(MDA、 SOD、 CAT)测定均按照试剂盒的说明书(南京建成生物工程研究所)操作.

MDA以每mg组织蛋白中MDA的nmol数表示； SOD以每mg组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)； CAT活力定义为每mg组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H₂O₂的量为一个活力单位.

根据GenBank中斑马鱼Bcl-2基因序列、 MDM2基因序列、 p53基因序列和Bax基因序列，以斑马鱼管家基因β-actin为内参，设计Bcl-2、 MDM2、 p53、 Bax和β-actin基因引物(如表 1). 引物由上海生工有限公司合成，取处理4、 24、 96 h实验组和对照组斑马鱼的肝组织，参考RNAiso Plus(TakaRa)试剂提取总RNA，D₂₆₀/D₂₈₀为1.90左右. 根据Prime Script^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TakaRa)试剂盒将各样品RNA进行反转录.

表 1 (Table 1)

表 1 目的基因及内参基因的引物 Table 1 Primers of target and internal control genes 基因 基因编号 正向引物5′-3′ 反向引物5′-3′ 退火温度/℃ β-actin NM_131031.1 ACCACCACAGCCGAAAGAG(F) GGCAACGGAAACGCTCA(R) 56 Bcl-2 NM_001030253.2 ATGTGCGTGGAAAGCGTCAAC(F) GAAGGCATCCCAACCTCCATT(R) 56 p53 NM_001271820.1 GGGCAGGGAGCGTTATGA(F) AGAGTCGCTTCTTCCTTCGTC(R) 56 MDM2 AF010255.1 CCGACGCCTCCACTTCTC(F) ATAAGGTGCCCAGTCCTTCC(R) 56 Bax AF231015.1 CGATACGGGCAGTGGCA(R) TCGGCTGAAGATTAGAGTTGTTT(F) 56

表 1 目的基因及内参基因的引物 Table 1 Primers of target and internal control genes

荧光定量RT-PCR反应体系(20 μL)： SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(2×)10 μL、 正向及反向引物各0.8 μL、 cDNA模板2 μL、 补无菌水至总体积. 扩增条件为： 预变性95℃ 5 min，40个循环(95℃ 20 s，57℃ 25 s，72℃ 25 s)，反应结束后制备溶解曲线. 每个反应设3个复孔，所有检测样品均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果. 采用2^-ΔΔCT法分析荧光定量结果^[23]，并用统计学软件进行单因素方差分析.

用SPSS 19.0统计分析软件，方差分析采用One Way ANOVA，并以Tukey's test多重比较； P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著差异.

nano-ZnO暴露对斑马鱼肝组织结构的影响如图 1所示，对照组(a-1、 a-2、 a-3)中肝细胞分布均匀，细胞核位于细胞中央，呈圆形或椭圆形，胞质均匀，肝细胞单层排列形成肝索(肝板)，有肝血窦(肝索间的空隙)汇入，窦间隙较小，且有少量的肝巨噬细胞存在(a-2). 与之相比，处理7 d后实验组中，10 mg ·L^-1和25 mg ·L^-1组肝组织中肝细胞窦间隙增大(e-1、 f-1)，5 mg ·L^-1和50 mg ·L^-1组出现细胞膜受损，剩下裸露的细胞核(胞质空泡化)现象(d-1、 g-1)，高浓度 (10、 25、 50 mg ·L^-1) 组肝组织中巨噬细胞明显增多(e-1～g-1)，0.1 mg ·L^-1组肝细胞膜受损，细胞核消失，肝细胞呈空泡化现象明显(c-1)，10 mg ·L^-1组并伴有肝细胞核固缩现象(e-1). 当处理15 d时，5 mg ·L^-1、 25 mg ·L^-1组出现肝组织水肿(d-2、 f-2)，5 mg ·L^-1组肝细胞窦间隙增大(d-2)，0.05 mg ·L^-1组肝细胞胞质空泡化(b-2)，除高浓度(25 mg ·L^-1、 50 mg ·L^-1)组外其他实验组出现巨噬细胞增多现象(b-2～e-2)，中浓度(10 mg ·L^-1、 25 mg ·L^-1)组肝细胞空泡化(e-2、 f-2)，50 mg ·L^-1组中部分肝细胞发生核固缩现象(g-2). 当暴露30 d后，各处理组肝脏中巨噬细胞明显增多，在实验组(除5 mg ·L^-1组外)均出现肝细胞细胞膜受损，只剩下裸露的细胞核(胞质空泡化)现象(b-3、 c-3及e-3～g-3)，0.1、 10及25 mg ·L^-1组中肝细胞窦间隙增大(c-3、 e-3、 f-3)，在5 mg ·L^-1组肝组织间隙有大量体液滞留，造成肝组织水肿(d-3)，而50 mg ·L^-1组有部分肝细胞核固缩变小、 淋巴细胞和巨噬细胞增多的现象(g-3).

如图 2所示，实验组斑马鱼肝脏中SOD活性均高于对照组. 胁迫4 h、 96 h后，浓度为25 mg ·L^-1组与对照组的差异极显著(P＜0.01)，分别为对照组的4.15倍、 3.6倍； 处理24 h，浓度为50 mg ·L^-1组SOD活性达到最大，是对照组的5.5倍.

图 2

Fig. 2

图 2 斑马鱼肝中SOD活性的变化 Fig. 2 Changes of SOD activity in zebrafish liver *：P＜0.05，**：P＜0.01，下同

由图 3可见，实验组斑马鱼肝脏中MDA含量均高于对照组，且在高浓度(50 mg ·L^-1)组中肝中MDA含量最大. 在低浓度(0.05 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1)组肝组织中MDA含量略有上升，当浓度为10 mg ·L^-1、 50 mg ·L^-1时随着处理时间的延长MDA含量呈现上升趋势； 处理96 h时，高浓度(50 mg ·L^-1)组肝脏中MDA含量达到最大，是对照组的3倍.

图 3

Fig. 3

图 3 斑马鱼肝中MDA含量的变化 Fig. 3 Changes of MDA contents in zebrafish liver

从图 4中看出，实验组斑马鱼肝中CAT活性低于对照组，处理4 h，在浓度为10 mg ·L^-1时肝组织中CAT活性最低(是对照组的67%)； 暴露24 h时，肝中CAT活性略有下降，差异不显著(P>0.05)； 96 h时在0.1 mg ·L^-1组肝中CAT活性最低(是对照组的69%).

图 4

Fig. 4

图 4 斑马鱼肝中CAT活性的变化 Fig. 4 Changes of CAT activity in zebrafish liver

图 5所示为nZnO对斑马鱼肝脏中Bcl-2 mRNA表达量的影响，与对照组相比，浓度为0.05 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1组中Bcl-2 mRNA表达量极显著下降(P＜0.01)，其余各组中的Bcl-2 mRNA的表达量呈上升趋势，处理24 h，浓度为50 mg ·L^-1组中Bcl-2 mRNA的表达量极显著升高(P＜0.01)，是对照组的20倍.

图 5

Fig. 5

图 5 nano-ZnO胁迫对斑马鱼肝脏中Bcl-2影响 Fig. 5 Effects of the nano-ZnO of Bcl-2 in zebrafish liver

斑马鱼肝脏中Bax mRNA表达量的变化(如图 6)，与对照组相比，除低浓度(0.05 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1)组肝脏中Bax mRNA表达量极显著降低(P＜0.01)外，其余各组中Bax mRNA表达量均高于对照组. 其中，浓度为5 mg ·L^-1、 10 mg ·L^-1组中Bax mRNA表达量随处理时间的延长而增加； 在4 h、 24 h时，浓度为25 mg ·L^-1、 50 mg ·L^-1时肝中Bax mRNA表达量均极显著高于对照组(P＜0.01)，且浓度为25 mg ·L^-1时Bax mRNA的表达量达最大，分别为对照组的28倍、 23倍.

图 6

Fig. 6

图 6 nano-ZnO胁迫对斑马鱼肝脏中Bax的影响 Fig. 6 Effects of the nano-ZnO of Bax in zebrafish liver

图 7为肝脏中p53 mRNA的表达量变化，实验组肝脏中的p53 mRNA的表达量呈上升趋势，在4 h、 96 h时，肝脏中p53 mRNA表达量先升高后下降，暴露4 h，浓度为25 mg ·L^-1时肝脏中p53 mRNA表达量达到最大，是对照组的14.9倍； 处理24 h时，随着nano-ZnO浓度的增加肝脏中p53的表达量增加，呈现一定的剂量关系，在50 mg ·L^-1时，斑马鱼肝脏中的p53 mRNA的表达量极显著上升(是对照组的13.8倍，P<0.01).

图 7

Fig. 7

图 7 nano-ZnO胁迫对斑马鱼肝脏中p53的影响 Fig. 7 Effects of the nano-ZnO of p53 in zebrafish liver

图 8为斑马鱼肝脏中MDM2 mRNA表达量的变化，低浓度(0.05、 0.1、 5 mg ·L^-1)组肝脏中MDM2 mRNA的表达量下降； 浓度为10、 25、 50 mg ·L^-1组中MDM2 mRNA的表达量高于对照组，暴露4 h，浓度为25 mg ·L^-1、 50 mg ·L^-1组MDM2 mRNA表达量极显著增加(P<0.01)，是对照组的10倍、 18倍； 处理24 h时，浓度为50 mg ·L^-1组MDM2表达量极显著增加(P<0.01)，是对照组的6.44倍； 而处理96 h时，10、 25、 50 mg ·L^-1组MDM2 mRNA表达量略高于对照组，差异不显著(P>0.05).

图 8

Fig. 8

图 8 nano-ZnO胁迫对斑马鱼肝脏中MDM2影响 Fig. 8 Effects of the nano-ZnO of MDM2 in zebrafish liver

nano-ZnO能通过皮肤、 鳃等组织进入到鱼体内，从而引起一系列生理生化反应. 鱼类肝脏是新陈代谢和清除有毒物质的重要器官，特别在清除环境污染物中起重要作用，它能将有毒物质代谢分解为无毒或低毒物质，排出体外. 但当有毒物质过高时就会对肝脏造成损伤，表现为肝细胞结构异常和组织病变，生理代谢活动受到影响，同时还会引起基因表达产物的变化. 因此，根据鱼类肝组织细胞的结构变化及生理指标变化可以作为环境中有毒污染物的生物指标^[24].

有研究报道，当鱼类生活在有污染物的环境中，环境污染物会诱导肝组织产生过多的氧自由基攻击细胞膜，使细胞膜受损，细胞核裸露，从而导致细胞质空泡化，同时污染物也能诱导肝巨噬细胞增多，使其吞噬环境异物以减少污染物对机体造成的损伤. 也有研究报道在污染物质的胁迫下肝组织会通过增大肝窦间隙，增加肝组织进行物质交换能力，从而减轻有毒物对机体损伤，但由于窦间隙的增大肝细胞与血液间物质交换发生变化，造成大量液体滞留而导致肝组织发生水肿^{[25, 26, 27, 28]}. 本研究中肝组织解剖结构在nano-ZnO的作用下也呈现类似的结果，另外还观察到肝细胞有核固缩现象，推测DNA停止转录，这是细胞凋亡的典型形态特征之一^[29]，说明nano-ZnO不仅使斑马鱼的肝组织结构发生变化，还会导致肝细胞凋亡.

SOD是氧化应激的重要指标，也是检测环境污染物的生物标志物^[30]. SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用，它能清除超氧阴离子(O₂^-·)保护机体免受损伤. 许多研究表明，当生物受到氧化胁迫时，其机体内会通过产生大量的SOD来清除过多的氧自由基，保护自己免受损伤^[31]. 本研究中，与对照组相比，暴露于nano-ZnO的斑马鱼肝组织中抗氧化酶SOD的活性是升高的，说明nano-ZnO对斑马鱼的肝可能造成了氧化损伤，而斑马鱼肝组织为了免受或减少氧化损伤产生了大量的SOD.

MDA是反映机体受损程度的重要指标，是脂质过氧化作用的产物，是细胞膜系统受损伤的指标之一^[26]，根据MDA含量能评估组织的受损情况. 研究者发现当纳米铁颗粒浓度大于5 μg ·mL^-1时，青鳉鱼胚胎内的MDA含量增加^[32]； 组织细胞受纳米颗粒的诱导产生过多的自由基而攻击细胞膜膜脂中的不饱和脂肪酸，从而破坏细胞膜的完整性，扰乱细胞功能，进而产生过多的脂质过氧化产物MDA，本研究结果显示，当斑马鱼暴露于高浓度中的nano-ZnO溶液中时，斑马鱼肝脏中的MDA含量较高，说明nano-ZnO破坏了斑马鱼肝脏中的氧化酶和抗氧化酶系统，从而对肝脏造成氧化损伤.

CAT是过氧化物酶体的标志酶，能催化H₂O₂的分解，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害，是生物防御体系的关键酶之一. 成嘉等^[33]在研究金属铅对鲫鱼的毒性中发现，铅对组织中的CAT活性有一定的抑制作用； Pandey等^[34]也发现污染区域中的鱼体内CAT活性降低； 在比较污染区域和清洁区域鲈鱼和鲻鱼体内的CAT活性中Ameur等^[28]发现，污染区域鱼体内CAT活性低于清洁区域； 重金属通过置换出金属酶活性中的必要金属或结合到酶蛋白分子中的巯基、 羧基等功能基团而导致酶活性降低或失活，当机体中抗氧化酶活性受到抑制后，清除自由基能力下降，引起氧化损伤^[35]. 本研究中nano-ZnO也能引起肝组织氧化损伤使组织中CAT活性的降低，进一步证明nano-ZnO对斑马鱼肝组织造成了氧化损伤.

p53最重要的功能在于其能诱导应激信号引起凋亡^[36]. MDM2对于调节p53的水平，维持生命体的稳定起重要的作用，p53可以诱导MDM2的表达，MDM2的表达产物对p53实施负调控^{[37, 38]}. 有研究报道，纳米二氧化硅包被氧化锰能诱导细胞中p53基因表达量升高，能激活凋亡蛋白酶活性从而诱导细胞凋亡产生^[39]，而nano-ZnO能激活BJWT、 BJshp53细胞中p53基因表达，预示nano-ZnO引起的细胞凋亡与其产生的ROS相关^[40]. 本研究也发现nano-ZnO能激活肝脏中p53基因表达量升高，而肝脏中MDM2基因表达量，在低浓度组中受到抑制，而在高浓组中被激活，一方面可能是肝组织中p53基因的表达诱导MDM2基因的表达，另一方面可能是MDM2基因的表达对p53基因表达进行负调控的作用的结果，这与Christen等^[41]发现p53表达水平的降低可能与MDM2调控起作用相关的结论相一致.
Bcl-2和Bax是一对重要的调控凋亡的基因，Bax/Bcl-2比值决定了细胞对凋亡的敏感性，决定细胞是否发生凋亡. Bcl-2是细胞存活的促进因子，Bax可使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，从而引起细胞的凋亡. Bax能拮抗Bcl-2的生物学活性，加速细胞的凋亡. 研究报道，羟基磷灰石纳米粒子使肝肿瘤中Bax/Bcl-2的比值升高，并推测Bax/Bcl-2比值的升高可导致细胞凋亡^[42]. 也有学者在研究纳米二氧化硅包被氧化锰能诱导HeLa细胞和L929细胞中Bax基因表达量升高，Bcl-2基因表达量降低. Bax/Bcl-2的比值增大，能激活凋亡蛋白酶活性从而诱导细胞凋亡产生^[39]. 本研究也发现斑马鱼肝脏中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达量，在低浓度时(0.05 mg ·L^-1、 0.1 mg ·L^-1)受到抑制，其他浓度组表达量均升高，而Bax/Bcl-2比值升高，说明nano-ZnO能诱导肝组织中细胞的凋亡.

在细胞凋亡过程中，p53通过调节下游Bax、 MDM2等基因诱导细胞周期的阻滞、 促进细胞凋亡和DNA损伤修复，维持基因组稳定，避免受损DNA的积累. 本研究发现nano-ZnO胁迫下，斑马鱼肝组织细胞结构发生变化，部分细胞发生凋亡，肝脏中抗氧化酶活性发生变化，产生大量活性氧自由基，肝组织中p53的表达促进MDM2和Bax的表达，组织中Bax/Bcl-2的比值增大，说明nano-ZnO诱发斑马鱼肝组织中细胞的凋亡，并且肝细胞凋亡的产生与组织中活性氧的存在可能存在一定的关系.

(1)nano-ZnO能造成斑马鱼肝组织结构发生变化，肝细胞窦间隙增大，细胞核固缩，细胞空泡化，组织水肿等症状.

(2)nano-ZnO能使组织中抗氧化酶活性受到影响，引起肝组织中抗氧化酶系统发生紊乱，使肝组织受损，且高剂量组受损程度更严重.

(3)肝脏中Bax/Bcl-2基因表达量的比值升高； p53、 MDM2 mRNA的表达量发生变化，说明nano-ZnO可以诱导肝细胞发生凋亡.