植物抵抗重金属的毒性通常体现为对重金属的避性和耐性，其中耐性又包括对重金属的排斥和富集，植物对重金属的富集主要指重金属经植物吸收、 转运后在植物体内以某种不具生物活性的化学结合形态存在于不同的器官组织中，并在植物体内产生细胞区隔化作用，沉淀到细胞壁、 进入液泡、 与有机酸或蛋白质络合等^{[1, 2, 3]}，从而减轻其对植物的毒害. 目前对于重金属在植物体内结合形态以及亚细胞分布的研究大多针对超富集植物且多为草本^{[4, 5]}，对于耐性植物尤其是木本植物的研究很少. 相比于草本植物，木本植物具有生物量大、 根系发达、 寿命长、 抗逆性强、 且经济价值高等优点^{[6, 7]}，筛选对多种重金属具有耐性的木本植物用于矿区植物恢复，可以实现环境治理与经济增收的双赢，具有广泛的应用前景. 经本课题组前期研究发现，夹竹桃(Nerium oleander)、 栾树(Koelreuteria paniculata)、 泡桐(Paulownia)和苎麻(Boehmeria)这4种植物均能在改良铅锌尾矿渣中生长良好，对高浓度Pb、 Zn复合污染表现出较强的耐性.在此基础上，本研究进一步分析4种植物对Pb、 Zn的富集能力及Pb、 Zn在植物体内的亚细胞分布和化学形态，以揭示4种植物对Pb、 Zn复合污染的耐性及其耐性机制.

铅锌矿渣具有物理结构不良、 持水保肥能力差； 极端贫瘠、 N、 P、 K及有机含量极低； 极端pH； 重金属含量高等特点，影响植物正常生长，因此基质改良十分必要^[8]. 通过查阅文献并结合前人的研究结果，本实验选择磷肥、 泥炭土和有机菌肥作为基质改良剂，在前期实验中发现，将磷肥、 泥炭土和微生物肥料与铅锌矿渣以不同比例混合进行基质改良，可以明显提高植物成活率，且改良剂加入比例越大，植物长势越好，但在工程应用中，要综合考虑植物修复效果与改良成本，因此本文研究不同改良配比对植物体内重金属含量及分布的影响，旨在为工程应用中选择合适基质配比和进一步优化配比提供参考.

供试基质改良为磷肥(磷酸二铵)、 泥炭土和有机菌肥，磷肥、 泥炭土购自长沙市红星花卉市场，不含重金属，有机菌肥为本课题组自制，配置方法为： 分别配置氢氧化钠，磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠的混合液体作为基础营养液备用，少量速效磷肥、 高浓度抗性菌株1%、 有机肥原料(甘蔗渣 ∶米糠=3 ∶7)4%、 泥炭土15%，堆放发酵15 d备用.

盆栽基质设置3个处理(mg ·kg^-1)： CK组(100%铅锌矿渣±少量磷肥)： 3424.62 Pb±4205.88 Zn； 改良一(85%铅锌矿渣±10%泥炭土±5%菌肥±少量磷肥)： 3240.30 Pb±3973.34 Zn； 改良二(75%铅锌矿渣±20%泥炭土±5%菌肥±少量磷肥)： 1663.78 Pb±3435.53 Zn； 测得CK组、 改良一和改良二的pH分别为： 8.08、 6.74和6.79. 先用大盆将每组基质处理按比例混均后装盆，花盆采用口径为40 cm，储量为11 kg的塑料花盆.

供试植物为Pb、 Zn耐性木本植物夹竹桃(Nerium oleander)、 栾树(Koelreuteria paniculata)、 泡桐(Paulownia)和苎麻(Boehmeria)，植物幼苗购自长沙红星花卉市场，所选植物苗高10~15 cm，生长健壮，长势良好，无病虫害. 每组处理每种植物3个平行，每个平行3株苗，植物移栽完成时浇足定兜水，前期适当遮阴防晒，后期自然条件下培养，水分管理遵循“不干不浇、 浇则浇透”的原则. 植物种植时间为2013年3月1日，收获时间为2013年10月1日. 土壤和植物样品采集方法为： 全株收获植株，并在收获植物时将其根际土壤充分混匀后，除去杂草、 石块、 肥料团块等杂物，采集约1~2 kg样品置于洁净的聚乙烯塑料袋中，带回实验室； 将收获植株先用自来水冲洗，再用20 mmol^-1 Na-EDTA交换20 min，去除根系表面吸附的Zn²⁺和Pb²⁺，最后用去离子水冲洗干净，吸干表面水分. 每个处理的植物样品分为根、 茎和叶这3个部位，每个部位分为3个部分，分别用于测定重金属全量、 亚细胞组分和化学形态，剩余样品保存于-4℃冰箱内备用； 植物根系土壤样品自然风干、 磨碎，过100目筛备用. 土壤样品在自然条件下风干，过60目筛备用.

(1)植物对Pb、 Zn的富集与转移能力指标的测定

植物和植物根系土壤样品重金属含量采用火焰原子吸收分光光度计测量^[9]. 植物样品采用“硝酸-高氯酸体系湿法”消解、 根系土壤样品采用“王水-高氯酸电热板法”消解. 重金属富集系数和转移系数计算公式如下：

(2)植物亚细胞组分的分离和化学形态分析

采用差速离心法分离植物根、 茎、 叶中不同的细胞组分； 植物体内重金属化学形态采用化学试剂逐步提取法提取^{[10, 11]}.

12.0软件分析数据.

在不同的改良剂浓度下4种植物种植前后基质、 植物地上部分与地下部Pb和Zn的含量变化见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 植物及基质样品中Pb和Zn的含量 /mg ·kg-1 Table 1 Pb and Zn contents in samples of plants and matrix/mg ·kg-1 重金属 植物 改良 基质 植物 种植前 种植后 地下部 地上部 CK 3424.62 2009.48±35.28a 215.40±17.25a 64.83±2.14a 夹竹桃 改良一 3240.30 1585.44±26.53b 105.60±6.51b 38.84±2.03b 改良二 1663.78 1610.50±16.97b 60.55±2.33c 34.75±0.83c CK 3424.62 2323.84±6.72a 85.55±7.42a 60.49±1.72b 栾树 改良一 3240.30 1698.53±1.17c 61.25±11.38b 80.48±7.36a Pb 改良二 1663.78 1760.42±11.38b 82.90±14.00a 69.14±7.59b CK 3424.62 2001.25±2.82a 77.80±2.12a 103.73±3.42a 泡桐 改良一 3240.30 1711.20±20.99b 70.20±4.10b 58.99±2.50b 改良二 1663.78 1467.16±26.99c 64.60±10.61b 32.49±2.33c CK 3424.62 2253.00±71.70a 113.25±7.85c 111.59±8.83b 苎麻 改良一 3240.30 1668.66±3.53b 138.15±9.97b 132.57±4.63b 改良二 1663.78 1715.76±36.78b 154.35±0.49a 142.20±11.03a CK 4205.88 3748.75±79.39a 608.70±36.06a 137.27±1.02a 夹竹桃 改良一 3973.34 3353.71±166.63b 139.00±8.06b 89.42±4.37b 改良二 3435.53 3305.08±115.81b 120.65±6.43b 83.71±0.06c CK 4205.88 3648.63±131.87a 186.45±4.31a 111.95±2.40a 栾树 改良一 3973.34 2760.80±14.21c 67.90±2.26b 51.97±0.27c Zn 改良二 3435.53 3083.60±85.01b 53.75±1.63c 61.21±1.79b CK 4205.88 3808.01±216.12a 133.95±6.86a 215.91±1.62a 泡桐 改良一 3973.34 3368.26±76.66b 136.05±0.21a 170.08±1.38c 改良二 3435.53 2672.95±95.98c 125.70±21.35a 182.48±0.67b CK 4205.88 4111.51±163.36a 167.70±0.14a 192.63±2.28a 苎麻 改良一 3973.34 2969.06±158.78b 102.35±1.48c 91.65±14.43c 改良二 3435.53 2962.76±141.05b 107.60±0.28b 154.54±1.67b

表 1 植物及基质样品中Pb和Zn的含量 /mg ·kg-1 Table 1 Pb and Zn contents in samples of plants and matrix/mg ·kg-1

从基质中Pb、 Zn含量的变化来看： 4种植物种植后的浓度基本低于种植前，表明4种植物改良处理对土壤中Pb、 Zn修复效果优于其他处理； 夹竹桃与苎麻改良一与改良二之间差异不显著，泡桐改良二效果显著优于改良一，栾树出现改良一效果显著优于改良二. 因此，总体上采用改良剂效果优于没有改良的对照，但是不同的植物应该采用不同的改良剂浓度配比.

从不同改良剂浓度处理对植物不同部位Pb、 Zn含量的影响来看： 植物间差异明显. 如夹竹桃与泡桐各处理组Pb、 Zn含量改良组>CK； 栾树、 苎麻夹竹桃各处理组Pb、 Zn含量变化没有规律； 因此，改良剂对植物不同部位Pb、 Zn含量的影响在植物物种之间差异较大.

从植物地上部Pb、 Zn富集系数(图 1)可以看出： 4种植物地上部对Pb、 Zn的富集系数都比较低，都不足0.1. 同时，同种植物对Pb和Zn的富集系数存在相互竞争的现象，当Pb富集系数较高时，其Zn富集系数就较低，当Pb富集系数较低时，其Zn富集系数就较高.

图 1

Fig. 1

图 1 植物地上部的Pb、 Zn富集系数 Fig. 1 Plants enrichment coefficient of Pb and Zn

从4种植物Pb、 Zn转移系数(图 2)可以看出： 泡桐和苎麻对Pb、 Zn的平均转移系数高于夹竹桃和栾树. 从同种植物3种处理来看，夹竹桃以改良二处理下Pb、 Zn转移系数最高，栾树两改良组Pb、 Zn转移系数都比较高，泡桐以CK组Pb、 Zn转移系数最高，改良一次之，苎麻各处理组Pb、 Zn转移系数都比较高. 综上所述，适当的基质改良有利于植物对Pb、 Zn的富集与转移，合适的基质配比因植物种类而异.

图 2

Fig. 2

图 2 植物的Pb、 Zn转移系数 Fig. 2 Plants Transfer coefficient of Pb and Zn

从植物不同部位Pb的亚细胞分布情况(见图 3)来看，细胞壁(F1)和可溶性组分(F4)是Pb的主要分布位点，由于Pb不是植物生长所必需的元素，为减少Pb对植物体的伤害，植物叶绿体和细胞核(F2)、 线粒体(F3)等细胞器组分中的Pb分布量极少. 从各处理组Pb的亚细胞分配比例来看，CK处理下，除夹竹桃的根、 叶部及栾树的根部出现F4>F1，其它植物各部位均为F1>F4； 改良一和改良二处理下，4种植物各部位F4的分配比例都有所增加，尤其以改良一处理下夹竹桃、 栾树和泡桐这3种植物茎、 叶部增幅最大，其分配比例增加至100%，表明改良剂的加入使可溶性组分对Pb的滞留作用增强了.

从植物不同部位Zn的亚细胞分布情况(见图 3)来看，细胞壁(F1)和可溶性组分(F4)也是Zn的主要分布位点，在细胞核、 叶绿体(F2)、 线粒体(F3)等细胞器中也有一定量的分布，这可能与Zn是植物生长所必需的微量元素有关. 从不同处理下各组分的分配比例来看，CK处理下，夹竹桃和栾树根、 茎部以(F4)最高，泡桐和苎麻以F1最高； 栾树、 泡桐和苎麻这3种植物叶部以F1或F4最高，其次是F2，且其F2远远高于夹竹桃，与植物叶片大，光合作用所需Zn含量高有关. 与CK组相比，改良一和改良二处理下，4种植物地上部Zn在细胞壁中的分配比例均明显增加，表明改良剂的加入使细胞壁对Zn的滞留作用增强了.

图 3

Fig. 3

图 3 Pb、 Zn在4种植物体内的亚细胞分布情况 Fig. 3 Subcellular distribution of Pb and Zn in four kinds of plants F1为细胞壁组分； F2为细胞核和叶绿体组分； F3为线粒体组分； F4为可溶性组分

由Pb在植物不同部位的化学形态分布情况(见图 4)来看，Pb主要以盐酸、 氯化钠和乙醇提取态这3种形态存在，各化学形态所占比例植物间差异较大. 从不同处理下各形态的分配比例来看，CK处理下，夹竹桃、 栾树和泡桐这3种植物根部以乙醇提取态为主导形态，苎麻以盐酸提取态为主导形态； 4种植物茎、 叶均以盐酸提取态为主导形态. 与CK组相比，两改良处理下，4种植物各部位中活性较弱的一些化学形态所占比例显著下降，活性较强的一些化学形态所占比例则显著上升. 其中，改良一和改良二处理下，夹竹桃根部盐酸提取态分别下降了15%和40%，叶部分别下降了45%和63%； 栾树和泡桐盐酸提取态和乙醇提取态所占比例下降，氯化钠提取态所占比例上升，成为茎、 叶部主要的化学形态，且两改良组间差异不大； 苎麻两改良组间呈现不同变化规律，改良一根、 茎部氯化钠提取态增加至98%~100%，改良二茎叶部盐酸提取态比例增加至92%~100%.

图 4

Fig. 4

图 4 Pb、 Zn在4种植物体内的化学形态分布 Fig. 4 Chemical speciation of Pb and Zn in four kinds of plants FR为残留态、 FHCl为盐酸提取态、 FHAc为醋酸提取态、 FNaCl为氯化钠提取态、 FH2O为水提取态、 FE为乙醇提取态

由Zn在植物体内的化学形态分布情况(见图 4)可以看出，Zn在植物体内以残留态、 盐酸提取态、 醋酸提取态、 氯化钠提取态、 水提取态和乙醇提取态这6种形态存在，各化学形态所占比例植物间差异也较大. 从不同处理下各形态的分配比例来看，CK处理下，4种植物根部以乙醇提取态、 水提取态和氯化钠提取态为主导形态，三者占55%~97%，茎、 叶部以醋酸提取态、 盐酸提取态和残留态等化学形态为主导形态，各种形态所占比例均较大. 与CK组相比，两改良处理下，4种植物根部活性较强的乙醇和水提取态两种化学形态所占比例增加了10%~30%，地上部活性较强的化学形态比例减少.

Pb胁迫至一定程度可以导致酶活性受到抑制，植物失水，细胞膜渗透性改变，扰乱植物对矿质营养元素的吸收等^[12]. 大部分植物吸收的Pb主要蓄集在植物根部，如玉米、 洋葱、 黄扇羽豆和茶树根系中的Pb是地上部的8~150倍^[13]，Pb在植物根系中的过量积累主要是根系组织的内皮层细胞起到了横向截留作用，限制了Pb向地上部转移，从而减轻Pb对植物地上部的伤害. Zn是植物生长所必需的微量元素之一，但是过量的锌也会对植物产生毒害作用，抑制根的生长，导致叶片褪绿而黄化，光合、 蒸腾降低，植株矮化，分蘖和生物量都减少等^{[14, 15]}. 本研究盆栽基质中的Pb、 Zn含量分别高达1663.78~3424.62mg ·kg^-1和3435.53~4205.88mg ·kg^-1，远远超过植物的正常耐受范围，供试的4种植物均成活下来，耐性较强，且表现出较强的富集Pb、 Zn的能力； 4种植物对Pb、 Zn的富集与转移系数虽未达到超富集植物标准，但可以通过基质改良的方法提高植物的长势和生物量，进而提高植物体内重金属的总体含量，取得良好的修复效果.

细胞壁固持和液泡的区隔化是植物体内重金属解毒的两大重要途径^{[16, 17]}. 有研究表明侧柏和国槐等植物中，Pb 主要分布在细胞壁和以液泡为主的可溶部分中，只有少量的分布在叶绿体、 线粒体、 细胞核等细胞器中^[18]，与本研究类似. 细胞壁是重金属离子进入细胞的第一道屏障，细胞壁上的多糖分子和蛋白质分子具有大量的羟基、 羧基、 醛基、 氨基等亲金属离子的配位基团，这些金属配位体能与细胞内金属离子结合，从而减少金属离子的跨膜运输，降低细胞原生质体内金属离子的浓度，维持植物细胞的正常生理代谢^[16]. 在非超富集植物再力花体内，Zn通过区隔化分布及与金属配位体结合表现出一定的解毒能力，并与常见的超富集植物略有不同： 低浓度 Zn 处理下，Zn 主要分布于根部细胞壁，其次为细胞核. 随着处理浓度的提高，可溶部分成为 Zn 的最主要分布位点，其次为细胞壁，表明细胞壁对重金属的阻隔作用存在一定限值^[19]. 当细胞壁结合的金属离子达到饱和点时，进入细胞内的重金属离子可通过液泡输送来降低其在原生质体中的浓度，或利用液泡的区隔化作用将重金属与胞内其他物质相隔离，并通过有机酸、 蛋白质和生物碱等与重金属相结合而降低其活性，从而使植物表现出耐性^{[20, 21]}. 这与本研究结果一致，在CK处理下，Zn、 Pb在细胞壁中的所占比例较高，其次是可溶性组分，改良剂的加入使Pb在可溶性组分中的比例和Zn细胞壁中的比例所增加.

重金属经过植物吸收、 转运后，会以不同化学形态存在于不同的器官组织中，借以限制重金属在植物体内的移动，从而减轻其对植物的毒害^{[22, 23]}. 采用乙醇、 去离子水、 氯化钠、 醋酸和盐酸等不同提取剂，可以顺序性提取植物组织中的不同结合形态的重金属^{[24, 25]}. 在超富集植物圆锥南芥(Arabispaniculata franch)和东南景天(Sedumalf redii)根系中，Zn主要以乙醇和氯化钠提取态为主，叶片中Zn主要以乙醇、 水、 氯化钠提取态为主，表明氨基酸盐、 果胶酸、 蛋白质在解毒Zn毒害过程中起重要作用^[26]. 在超富集植物长柔毛委陵菜(Potentilla grifithii Hook)体内，叶片中乙醇和水提取态Zn占总量的61%~69%，叶柄和根中氯化钠和乙醇提取态占总量的 62%~73%. 本研究中，Zn在4种耐性植物体内的化学形态分配与超富集植物基本相同，Zn主要与蛋白质、 氨基酸以及水溶性有机酸等结合，形成毒性更小的化合物，从而降低了Zn对植物的毒害. Pb在4种耐性植物体内的化学形态分配因植物品种有差异.

(1)从夹竹桃(Nerium oleander)、 栾树(Koelreuteria paniculata)、 泡桐(Paulownia)和苎麻(Boehmeria)这4种植物在不同改良剂浓度种植后的基质Pb、 Zn含量的变化来看： 4种植物都出现改良剂效果优于对照的规律，但是不同的植物对改良剂浓度配比要求不一致，如： 泡桐改良二效果显著优于改良一，栾树出现改良一效果显著优于改良二，夹竹桃与苎麻改良一与改良二之间差异不显著.

(2)从植物不同部位Pb的亚细胞分布情况来看： 细胞壁(F1)和可溶性组分(F4)是Pb的主要分布位点，植物叶绿体和细胞核(F2)、 线粒体(F3)等细胞器组分中的Pb分布量极少； 从植物不同部位Zn的亚细胞分布情况来看，细胞壁(F1)和可溶性组分(F4)也是Zn的主要分布位点，在细胞核、 叶绿体(F2)，线粒体(F3)等细胞器中也有一定量的分布. 与对照比较，改良组使可溶性组分对Pb的滞留作用和细胞壁对Zn的滞留作用在增强.

(3)从Pb、 Zn在植物体内的化学形态分布来看： Pb在植物各部位的化学形态以盐酸、 氯化钠和乙醇提取态为主，其他化学形态含量极少； Zn则以残留态、 盐酸、 醋酸、 氯化钠、 水和乙醇提取态6种形态存在，且都具较高分配比例. 与CK组相比，两改良组使植物各部位活性较弱的Pb的化学形态比例减少，活性较强的化学形态比例增加； Zn则是根部活性较强的化学形态比例增加，地上部活性较强的化学形态比例减少.