2015, Vol. 36
2. 北京大学环境工程系, 水沙科学教育部重点实验室, 北京 100871
2. The Key Laboratory of Water and Sediment Sciences, Ministry of Education, Department of Environmental Engineering, Peking University, Beijing 100871, China
21世纪以来，发达国家的垃圾产生量每年增长3.2%~4.5%，发展中国家垃圾产量每年增长2.0%~3.0%[1].中国已成为世界上最大城市生活垃圾产生者. 1990~2004年，我国生活垃圾处理设备和基础设施的投资增加了21倍，安全处理量提高逾30倍[2]. 填埋仍是我国最主要的城市生活垃圾处理方式，截至2009年底，我国城市生活垃圾填埋场447座，处理能力约为27.3万t ·d-1[3].然而填埋场垃圾降解速率慢，可能耗费数十年时间才能达到稳定化[4, 5]，伴随着渗滤液、填埋气等污染[6, 7].
填埋垃圾的降解是一系列微生物作用的过程，不同类群的微生物协同作用，并将二氧化碳和甲烷作为稳定的终产物[8].研究者根据垃圾降解的不同阶段将填埋堆体内的微生物分为水解菌、产酸菌、产乙酸菌和产甲烷菌四类[9].产甲烷是垃圾降解的限速步骤之一，了解填埋堆体内产甲烷菌，对提高垃圾降解效率，回收能源，减少污染物排放等方面都具有重要作用.
产甲烷菌可根据其营养类型分为乙酸营养型、氢营养型和甲基营养型三类. 研究发现垃圾填埋场中产甲烷菌有一定的多样性，包括Methanobacteriales、Methanomicrobiales 和 Methanosarcinales等[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. 其中Cardinali-Rezende等[10]在运行44~90 d的反应器填埋中发现了氢营养型的 Methanomicrobiales和Methanobacteriales. Li 等[13] 和Nayak等[16]在各自的模拟填埋反应器中均发现Methanomicrobiales 和Methanosarcinales为优势产甲烷菌.然而实验室反应器运行时间短，条件易于控制，很难反映真实填埋场数年至数十年内复杂的微生物群落变化.另一些研究者以填埋场渗滤液为对象，发现优势类群为乙酸型的Methanosarcina 和Methanosaeta，或氢营养型Methanobacteriales 和 Methanomicrobiales[11, 12].这些研究限于填埋场某一阶段或各阶段混合的产甲烷菌群落，不易深入探究其随时间的演替规律. Uz 等[15]定性上明确了不同深度的产甲烷菌群落，发现低龄垃圾中产甲烷菌多样性高于老龄垃圾，未开展各类群含量的变化规律研究.
实际填埋场的垃圾空间异质性很强，运行时间比反应器长很多，产甲烷菌可能分布于很大的时间和空间跨度内.有必要深入地开展实际填埋场内产甲烷菌群落分布和随时间的演替规律的定量研究. 本文采用实时荧光定量核酸扩增(real-time quantitative polymerase chain reaction，QPCR)检测手段，结合垃圾的化学组分和性质，研究填埋时间跨度2~15 a的产甲烷菌的种类、数量及其随时间和深度的变化规律.
1 材料与方法 1.1 样品采集样品来自北京北神树垃圾填埋场，采样时间2012年11月. 如图 1所示，填埋场总填埋高度51 m，自下而上分为5个平台，其中填埋时间小于2 a的5平台已采用膜覆盖，为避免毁坏覆盖膜导致气体泄漏，采样点分布于1~4平台. 采用柴油机驱动的机械冲击钻，其前端为0.5 m钢管，在夯锤的作用下打入堆体内部，上提后将堆体内部垃圾取出. 共钻井6眼，得到A，B，C 3组各10个样品，填埋时间2~15 a，深度6~36.1 m，由于同层次3个取样点的垃圾入场时间相近，深度以平均值表示(表 1). 样品在-80℃保存.
 | 图 1 垃圾填埋堆体及采样点信息 Fig. 1 Information of the landfill and sampling points |
 | 表 1 A、B、C三样品组采样位点信息 Table 1 Information of the samples in Group A, B, and C |
总有机质测定参照中华人民共和国城镇建设行业标准CJ/T 96-1999，灼烧法； 淀粉含量测定参照食品标准，GB/T 5009.9-2008； 纤维素、半纤维素含量测定参照GBT 23857-2009生活垃圾填埋场降解治理的监测与检测； 蛋白质测定采用紫外吸收法测定蛋白质的含量； 脂肪测定参照GB 5413.3-2010.由于垃圾不均匀，且部分方法并非针对垃圾样品设计，在取样前需将大块成分剪碎，混合均匀再取样.
垃圾样品风干、碾碎并过1 mm筛，取筛下物5 g加入25 mL无CO2水，搅拌30 min，静置30 min，离心后用PHSJ3F型酸度计测定上清液pH.
将垃圾和超纯水以1:2混合，密闭振荡30 min，静置30 min. 依次用滤纸和0.45 μm的水相膜过滤，稀释. 取1 mL，加入10 μL磷酸，混匀. 用安捷伦气质联用仪测定，色谱柱DB-FFAP，测定乙酸、丙酸、丁酸.
1.3 分子生物学分析 1.3.1 样品预处理和DNA提取Staley 等[17]用pH 6.73的冷磷酸缓冲液对垃圾充分浸提，过筛，离心，冷冻干燥，用试剂盒成功提取出DNA.为使本研究复杂的垃圾样品与DNA提取试剂盒兼容，适用于下游分子生物学分析，参照该文献进行样品预处理然后用MOBIO PowerSoil DNA Isolation kit提取DNA. 用MOBIO纯化试剂盒进行纯化，至样品DNA A260/280在1.8左右，A260/230在2.0左右.
1.3.2 产甲烷菌种类分析Methanococcales、Methanobacteriales、Methanomicrobiales和Methanosarcinales这4个目，Methanosarcinaceae和Methanosaetaceae这2个科是可能出现于人工厌氧环境内的产甲烷类群[18]，包括氢、乙酸和甲基这3种营养类型. Methanosaeta和Methanosarcina是已知仅有的两个乙酸型产甲烷菌[19]. 针对以上类群，以表 2所示引物依次对提取的DNA进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR). 反应体系为模板(10~1 000 ng)1 μL，正反引物(10 μmol ·L-1，各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10μL，ddH2O 7 μL)，升温程序参照表 2中的文献. PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，检验扩增结果.
| 表 2 产甲烷菌PCR扩增所用引物及探针 Table 2 Primer and probe sets for methanogens PCR |
以提取的基因组DNA为模板，用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′)和518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG -3′)扩增细菌，用表 2中引物扩增产甲烷菌特定量区段，产物与PMG-18T载体连接后导入呈感受态的大肠杆菌细胞内克隆复制. 提取纯化大肠杆菌T载体，梯度稀释，获取标准系列.
QPCR反应体系：模板(2 μL)、正反引物 (10 μmol ·L-1，各1 μL)、SYBR PCR Master Mix (10 μL)、ddH2O (7 μL)； 反应条件为 50℃预热2 min，初始变性温度为95℃ 10 min. 细菌体系随后进行40循环PCR反应：95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸46 s，每个循环结束时于72℃ 530 nm检测荧光信号.溶解曲线分析为72~95℃，每隔0.5℃检测一次荧光.产甲烷菌Methanosaeta和Methanosarcina 随后进行40个循环：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s.Methanobacteriales随后40个循环：95℃ 15 s，60℃ 60 s，72℃ 45 s. 于60~95℃，每升高0.5℃检测荧光信号，以确定反应特异性.
1.4 数据处理方法采用MS Office Excel处理化学分析结果和QPCR测得的DNA含量，计算各深度3个样品的平均值和标准误. 对各样品产甲烷菌DNA含量取对数，与各类有机组分和挥发性脂肪酸含量进行相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 垃圾的化学组分和理化性质垃圾样品中有机组分含量随深度的变化如图 2所示.淀粉、脂肪、蛋白质、纤维素、半纤维素等可生物降解有机质约占垃圾干重的5%，且随深度增加没有明显变化.总有机质含量在15%~30%间波动且略有升高.据报道，原生垃圾中脂肪、淀粉、半纤维素和纤维素等可生物降解组分含量在40%以上，总有机质含量高达60%以上[20]，而14 a以上的垃圾有机质含量为1.3%~50.6%[9].本垃圾堆体可生物降解组分较原生垃圾大幅减少，并稳定在老龄垃圾的范围内，表明有机质的快速的降解基本发生在垃圾填埋初期的2 a内.而总有机质的含量变化可能与不同年份入场的垃圾成分差异有关. 我国垃圾处理技术不断发展和规范，填埋场入场垃圾成分也随之变化. 例如，GB 16889-2008《生活垃圾填埋场污染控制标准》较之前的版本对餐饮废物、粪便和养殖废物等高有机质含量的废物入场做了严格限制.
 | 图 2 垃圾样品的化学组分随深度变化 Fig. 2 Chemical components of the waste samples along depth |
图 3中所示为垃圾样品中乙酸、丙酸、丁酸这3种挥发性有机酸及pH值随深度的变化. 3种挥发性有机酸的含量随填埋深度的增加均有所降低，其中乙酸含量从约90 mg ·kg-1降到40 mg ·kg-1以下. Staley 等[17]认为空间异质性会导致垃圾中挥发酸的初始含量随深度增加而升高，尤其是乙酸.本堆体中乙酸含量的随深度而下降说明随填埋时间的延长，乙酸被消耗，堆体中可能存在乙酸营养型产甲烷菌. 各深度样品的pH值均大于8，垃圾堆体呈弱碱性环境. 吕凡 等[22]发现pH由7升高到8会使垃圾水解速率大幅降低.本堆体中可降解有机物含量的稳定，可能受碱性环境下水解速率下降的影响. 垃圾降解经历水解、产酸、产乙酸、产甲烷这4个阶段，水解后产酸、产乙酸过程会导致pH呈酸性，而在产甲烷阶段由于酸性底物降解，pH趋于碱性[21].进一步说明填埋2~15 a的垃圾可能处于产甲烷阶段.
 | 图 3 垃圾样品的pH值和挥发性脂肪酸含量随深度变化 Fig. 3 The pH values and VFA contents of the waste samples along depth |
采用表 2中引物扩增A、B、C三组样品中各类产甲烷菌DNA，仅Ms1b585F、Sae835R，Mb1b 586F、Sar835R和MB857F、MBT1196R三对引物得到扩增结果，其琼脂糖电泳结果如图 4. 其余各对引物未得到明显扩增信号.
 | 图 4 产甲烷菌PCR扩增结果 Fig. 4 PCR amplification results of the methanogens |
引物Ms1b585F、Sae835R的目标微生物为Methanosaeta，30个样品中均扩增到了长度约250bp的目标片段. 引物Mb1b 586F、Sar835R的目标微生物为Methanosarcina，30个样品中均扩增得到了长度约为250bp的目标片段. 这说明乙酸型产甲烷丝状菌属(Methanosaeta)和乙酸型甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)两个类群普遍存在于填埋2~15 a的垃圾样品中.引物MBT857F、MBT1196R的目标为Methanobacteriales，扩增得到的片段长度约343bp.其中A、B两组仅在相对浅层的样品中得到明显的目标条带，C组条带的亮度也随填埋深度增加而减弱. 说明在该填埋时间段内，甲烷杆菌目(Methanobacteriales)可能随时间减少.
已有研究表明垃圾降解过程主要的产甲烷类群是甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷微球目(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)[12]，其中Methanobacteriales和Methanomicrobiales所包含的菌属主要是氢营养型，Methanosarcinales的菌属有氢营养型、乙酸营养型以及甲基营养型，其中Methanosarcina和Methanosaeta两个属主要为乙酸营养型，个别可氧化甲醇，甚至丁酸盐[23].本研究检测到的3个类群在营养类型方面与文献报道吻合，填埋2~15 a的垃圾中氢营养型和乙酸营养型产甲烷菌为优势类群，甲基营养型比重可能很小.
2.3 产甲烷菌群落演替规律图 5显示了QPCR测得的填埋堆体中各产甲烷菌类群DNA含量及总细菌DNA含量. 垃圾中总细菌DNA含量在7.50E+09 copies ·g-1 到1.11E+12 copies ·g-1之间. 随填时间的增加，总细菌含量显著降低.
 | 图 5 堆体内产甲烷菌和总细菌随深度的分布 Fig. 5 Distribution of methanogens and bacteria in the landfill along depth |
Methanobacteriales的DNA含量为4.18E+04~1.10E+06 copies ·g-1，Methanosaeta DNA的含量为1.74E+04~2.55E+06 copies ·g-1，Methanosarcina DNA的含量为4.0E+06~5.82E+07 copies ·g-1. A、B这2组的深层样品中Methanobacteriales尽管在PCR结果中条带不明显，但在QPCR中均有检出，也表现出QPCR在定量检测中的优势.
填埋2~15 a堆体内部乙酸型的Methanosarcina最多，为垃圾堆体的代表性产甲烷菌. Methanosarcina在深度15.6~19.1m，即填埋时间4~9 a达到最大，随后虽仍有波动，且整体趋于降低. 乙酸营养型的Methanosaeta和氢营养型的Methanobacteriales相对较少，也呈先增多后减少的趋势，填埋后期Methanobacteriales的含量高于Methanosaeta.
在以往研究中，Laloui-Carpentier 等[24]检测到填埋5 a、11 a的渗沥液中乙酸营养型Methanosaetaceae为优势类群，氢营养型的比例较小； Uz等[15]发现低龄垃圾中产甲烷菌多样性高于老龄垃圾，随垃圾降解时间的推移，氢营养型产甲烷菌占据优势； Bareither等[25]在实验室反应器研究中发现 Methanomicrobiales、Methanobacteriales和Methanosarcinaceae这3个类群，Methanomicrobiales含量最高，但因为实验室研究的时间跨度太短，仅观测到3类产甲烷菌随时间增多，未观测到下降阶段. 根据反应器模拟，垃圾的产甲烷过程可分为3个阶段：第一阶段氢营养型主导，第二阶段乙酸营养型显著升高，成为主要营养类型，第三阶段乙酸营养型逐渐降低，最终氢营养型再次占优势[14]. 各研究对象可能处于产甲烷过程的不同阶段，且同一阶段的垃圾堆体中尽管优势营养类型相同，其中的微生物种类和数量却存在差异. 反应器与真实填埋场的运行时间、工程参数和环境差异很大，反应器的研究结果具有借鉴意义，但无法代表填埋场的情况.
本垃圾堆体符合产甲烷第二和第三阶段特征，但优势产甲烷菌类群和演替规律与前人研究差别较大. 在填埋2 a以上的垃圾中，微生物总量逐渐减 少，产甲烷菌呈先增多后减少的趋势，乙酸营养型的 Methanosarcina是优势类群.
2.4 产甲烷菌丰度的影响因素产甲烷菌DNA含量的对数与各有机化学组分含量的相关性分析结果如表 3所示. 3类产甲烷菌与乙酸、丙酸、丁酸这3种挥发性脂肪酸含量均为正相关. 其中Methanosaeta与3种挥发酸均在0.05的显著性水平呈中度相关，Methanobacterials和Methanosarcina与挥发酸的相关性相对较弱. 以往研究认为有效产甲烷菌底物含量的差异决定产甲烷菌群种类和数量分布[26, 27]. 尽管Methanosaeta与Methanosarcina均为乙酸营养型产甲烷菌，但在堆体中受到乙酸含量的影响并不相同. Methanosaeta和Methanosarcina是一对能够在相同底物环境下共生的微生物. 在动力学参数方面，Methanosarcina具有更高的乙酸利用上限和生长速率上限，当底物充足时，Methanosarcina会成为优势类群，但随着乙酸浓度的降低，Methanosaeta可能会得到优势[19]. 本堆体Methanosarcina含量始终高于Methanosaeta，反映出乙酸底物充足. 对优势菌Methanosarcina来说，存在其它更强的限制性环境因子.
| 表 3 产甲烷菌丰度对数与各有机化学指标的相关性分析 Table 3 Correlation analysis between logarithmic Methanogen abundance and chemical parameters |
各类大分子有机组分和总有机质含量与3类产甲烷菌丰度基本相关性较弱或不相关.这些有机质均不是产甲烷的底物，但它们可通过水解、发酵、产乙酸等微生物过程转化为产甲烷底物.堆体进入产甲烷阶段后，水解、发酵等微生物过程减弱. 因此各类大分子组分的含量趋于稳定，对产甲烷菌群落结构的影响微弱.
此外，本研究中仍存在一定不足：受采样方法的限制，未能监测到各采样点温度和产气情况；对可能影响产甲烷菌群落的理化参数分析不全面.希望在进一步的研究中可改良采样方法，扩大理化性质分析范围，深入探寻产甲烷菌的群落演替规律.
3 结论(1)填埋2~15 a的垃圾堆体中大分子有机化学组分含量基本稳定，pH呈弱碱性，挥发性脂肪酸含量随填埋时间延长略有下降，暗示堆体已经历过水解、产酸、产氢产乙酸阶段，以产甲烷阶段为主.
(2)在堆体内检出了3类产甲烷菌，分别是Methanobacterials、Methanosaeta和Methanosarcina，营养类型主要为乙酸营养型和氢营养型.
(3)在2~15 a之间，随着填埋时间的延长，堆体内总细菌含量显著下降，但产甲烷菌含量先迅速上升，在填埋4~9 a年时达到最大，随后下降. 其中乙酸营养型的Methanosarcina为优势类群.
(4)在堆体产甲烷阶段，挥发性脂肪酸可能影响产甲烷菌群落结构，但有机大分子的水解、发酵、产乙酸等作用对产甲烷菌的影响很小.
致谢:北京市环卫集团陈鹏、刘志辉、李滕，张雪地，北神树生活垃圾填埋场各级领导与员工在样品采集中给予了极大帮助；研究组的焦安英、王溪曦、郭雪、夏树林和宾银平参加了样品采集和理化性质分析工作，在此一并致谢.
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