2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 中国矿业大学(北京) 化学与环境工程学院, 北京 100083
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology-Beijing, Beijing 100083, China
土壤微生物常被比拟为土壤养分循环的“转化器”、污染物的“净化器”和生态系统稳定的“调节器”. 在维持生态系统的稳定以及受损生态系统的恢复与重建过程中发挥重要作用. 研究报道的土壤中能降解烃类污染物的微生物有70个属,200多个种[1]. 同时,许多研究表明[2,3],植物生长可以增加根际土壤微生物的密度、提高其对污染物的降解作用,且根际土壤微生物群落结构及其降解功能受植物类型的影响.
紫茉莉(Mirabilis jalapa Linn.)是紫茉莉科(Nyctaginaceae)紫茉莉属(Mirabilis Linn.)一年生草本植物[4]. 生态适应性广,生长快速,对不良环境具有较强的耐受性,如抗氯气[5]、耐盐性[6]和富集镉[7]. 近年来,有许多关于其在金属污染土壤修复中的应用报道[8,9],但在石油污染盐碱土壤修复中的应用研究还较少.
磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)分析方法是基于PLFAs发展起来的现代生物化学技术,已被广泛应用于探讨时空变化、污染物对土壤微生物群落结构的影响[10].本研究采用PLFAs分析方法,解析紫茉莉生长对石油污染盐碱土壤微生态环境的影响,揭示根际土壤微生物的变化对石油烃降解作用的影响,以期为石油污染土壤的生物修复技术研究和植物资源的开发利用提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验设计与土壤样品采集实验土壤类型为取自油田区典型的盐碱性土壤. 土壤石油烃含量为(6.3±0.3) g·kg-1、总碳为(3.5±0.5) g·kg-1、总氮为(0.5±0.2) g·kg-1、有效磷(26.9±0.6)g·kg-1、有效钾(8.2±0.3) g·kg-1、pH为8.8±0.7、电导率(EC)为1 387 μS·cm-1.本实验通过盆栽紫茉莉完成,盆径20 cm×25 cm,共30盆,其中10盆为未种植紫茉莉的对照(CK).2013年3月移栽具有1~2片真叶的种苗,每盆栽种2株.整个实验期,采用自然光源,温度模拟自然温度在15~38℃之间,湿度保持50%~60%. 于2013年3~11月在紫茉莉根区周围(0~20) cm用打孔器采集土样,每月中旬取样、每次取40个(每盆2个)根际土样,然后去除石块、动植物残体等杂质混合成一个样品,用四分法取需用量的土样,装入密封袋运回实验室,置于-20℃冰箱保存并尽快进行微生物PLFAs提取与TPH含量分析.PLFAs分析采用鲜土,TPH分析采用冷冻干燥后研磨过100目金属筛的干燥土壤.3~5月采样记为春季样品,6~8月记为夏季样品,9~11月记为秋季样品.
1.2 土壤理化性质与石油烃含量测定土壤中总碳、总氮含量采用元素分析仪(Vario Toc,Germany)测定;pH采用水土比5 :1的混合液,pH计(pHs-3C)测定;采用电导仪(DDS-11A)测定电导率;采用钼锑抗比色法测定有效磷[11]. 根据文献[12]方法测定土壤总石油烃含量.
1.3 土壤微生物PLFAs测定参照Bligh等[13]的方法提取PLFAs,采用内标法,以十九烷酸甲酯(C19:0)作为内标物,用气相色谱-质谱分析(GC-MS)测定土壤微生物PLFAs的含量.定性分析用计算机自动检索质谱图库的方法;定量分析采用总离子流各峰面积归一化,各种脂肪酸甲酯的含量采用不同脂肪酸峰面积/内标物(C19:0)峰面积的比值计算.
1.4 磷脂脂肪酸的命名原则磷脂脂肪酸的命名采用“ω”系统,分子通式记为:(i/a/me/cy)X:YωZ(c/t),其中,前缀 “i”/“a”/“me”代表甲基支链的位置. “i”代表在距离分子链末端第二个碳原子上;“a” 代表甲基在距离分子链末端第3个碳原子上;“me”代表甲基支链的位置在脂肪酸分子链中间的碳原子上,其前面的数字如“10 me”代表甲基在距离始端第10个碳原子上;“cy”代表分子中的环丙基结构;X代表脂肪酸碳原子的个数;Y代表分子中双键的个数;ω代表双键;Z代表双键的位置(距离分子末端碳原子的个数);后缀“c”或“t”分别代表分子的顺、反式结构[14, 15, 16].
1.5 数据分析PLFAs种类变异率(%)计算公式:
PLFAs的测定结果利用NEST 5.0图谱库进行分析;利用SPSS 17.0软件进行相关数据处理与分析.
2 结果与分析 2.1 土壤微生物PLFAs指纹图谱将提取的土壤微生物PLFAs样品用GC-MS分析.以紫茉莉秋季根际土壤样品所提取的微生物PFLAs分析得到的气相色谱-质谱图为例(图 1),其中,纵坐标表示各种PLFAs的峰值,横坐标代表特征峰出现的时间.
![]() | 图 1 紫茉莉秋季根际土壤样品微生物磷脂脂肪酸气相色谱图 Fig. 1Chromatogram profiles of phospholipids fatty acids of microbial community in Mirabilis jalapa soil sample in autumn |
将谱图信息转化成数据形式(表 1).根据分子结构可分为6种类型.第1类,饱和脂肪酸类型(SAT)如C14:0、C15:0、C16:0、C17:0、C18:0标识细菌[17];第2类,甲基支链在分子末端的饱和脂肪酸类型(TBSAT)如i13:0、i15:0、i16:0、a14:0、a16:0等标识革兰氏阳性细菌(G+)[18];第3类,甲基支链在中间碳原子位置的饱和脂肪酸类型(MBSAT),如9Me14:0、9Me16:0、10Me18:0等,如10Me18:0是典型的放线菌标识PLFAs[19].第4类,单不饱和脂肪酸类型(MONO)如16:1ω5、16:1ω7t、18:1ω7c、18:1ω9c、18:1ω9t标识革兰氏阴性细菌(G-)[20];第5类,具有环丙基的脂肪酸类型(CYCLO),如cy16:0、cy18:0标识存在环境营养或污染胁迫;第6类,多不饱和脂肪酸(PUFA),如18:2ω6,9典型真菌标识类型[21,22].
![]() | 表 1 紫茉莉不同生长期土壤微生物PLFA的动态变化/nmol·g-1 Table 1 Dynamic changes of the concentration of the PLFAs in soils during in the Mirabilis jalapa growth/nmol·g-1 |
从表 1可知,整个生长期,土壤中共检测到22种PLFAs,其中,紫茉莉根际土壤中共检测到19种,没植物的CK土壤17种,相比较微生物PLFAs总的种类数增加11.8%. 紫茉莉根际土壤在春、夏、秋季分别检测到12种、9种和15种,CK土壤分别为6种、8种和16种. 相比较,春季根际土壤微生物PLFAs种类数增加50%,夏季和秋季没有明显(P>0.5)增加,但根际土壤微生物PLFAs种类的变异率在春、夏、秋季分别为71.4%、69.2%和33.3%.
春季CK土壤的优势类群为TBSAT(58.0%)和MBSAT(21.4%),而根际土壤的优势类群为TBSAT(48.5%)和MONO(38.3%);夏季CK土壤中MONO(37.1%)和TBSAT(32.4%)是典型的优势类群,而根际土壤中SAT(45.9%)和MBSAT(21.8%)是优势类群,第一、第二优势类群均不相同;秋季CK土壤的优势类群分别为SAT(38.4%)、MONO(32.5%),根际土壤的优势类群分别为TBSAT(37.4%)、MONO(30.0%)第一优势类群发生了改变. 真菌和细菌的相对多度比在春、秋季节根际大于对照,这表明,紫茉莉根际土壤微生物群落结构与CK有较大的差异.
2.2.2 土壤微生物PLFAs的主成分分析对不同生长期土壤微生物PLFAs的生物量进行主成分分析(PCA).提取PLFAs主成分的特征根及方差贡献率,以方差贡献率最高的主成分1(PC1,40.9%)和主成分2(PC2,26.1%)作图(图 2),进行微生物群落多样性分析.
![]() | ●1、3、5分别表示春季、夏季、秋季没种植紫茉莉的对照组土壤样品,●2、4、6表示该季节紫茉莉根际土壤样品图 2 土壤微生物PLFAs的主成分分析(PCA)及因子分析 Fig. 2PCA analysis of soil PLFAs and factors |
图 2表明,对PC1贡献率较大的PLFAs类型主要有a14:0、a16:0、cy18:0、cy16:0、18:1ω9c、i16:1ω5、16:1ω7t、i15:0、i16:0、i13:0、C14:0、C18:0、C15:0、9me14:0解释变量的40.9%;对第2主成分贡献率比较大的PLFAs类型有18:1ω9t、18:1ω7c、10me18:0、9me16:0、C16:0、C17:0、n16:0解释变量的26.1%. 其中,春季CK与根际微生物群落种类的差异主要表现在PC1,如cy18:0、cy16:0和a14:0、a16:0、i16:0、i16:0、i15:0、18:1ω9c;夏、秋季,CK与根际土壤微生物群落种类的差异在PC1、PC2上均有体现. 表明紫茉莉生长对根际土壤微生物群落结构有较大的影响.
2.2.3 土壤微生物量动态变化以所有类型PLFAs的总和计算土壤微生物群落中活性微生物总的生物量;以SAT、TBSAT、MONO和CYCLO的总量计算细菌的生物量;以PUFA的量计算真菌生物量,以MBSAT的量计算放线菌生物量,结果可知:春、夏、秋季根际土壤活性微生物总的生物量分别为:24.6、4.77、25.1 nmol·g-1;CK土壤总的生物量分别为:0.840、16.7、22.3 nmol·g-1. 不同微生物类群的生物量(如图 3),在根际土壤与CK土壤表现为不同的动态变化趋势. 根际土壤中,细菌表现为春季(20.3 nmol·g-1)>秋季(18.9 nmol·g-1)>夏季(3.55 nmol·g-1);真菌表现为秋季(5.55nmol·g-1)>春季(3.95nmol·g-1)>夏季(0.185nmol·g-1);放线菌表现为夏季(1.04 nmol·g-1)>秋季(0.678 nmol·g-1)>春季(0.394nmol·g-1). CK 土壤中,细菌呈现秋季(17.6 nmol·g-1)>夏季(6.51 nmol·g-1)>春季(0.65nmol·g-1);真菌表现为夏季(7.55nmol·g-1)>秋季(2.21nmol·g-1)>春季(0.015 3 nmol·g-1);放线菌呈现夏季(2.67 nmol·g-1)>秋季(2.66 nmol·g-1)>春季(0.180 nmol·g-1). 与CK相比细菌、真菌表现为春季升高,夏季降低,秋季升高的波动趋势; 放线菌表现为春季增加,夏、秋季减少.
![]() | 图 3 磷脂脂肪酸标识的活性土壤微生物量变化趋势 Fig. 3Changes trend of activity microorganism biomass in sample soil |
紫茉莉根际土壤pH值与CK相比表现为较小差异(P>0.05) [图 4(a)]. 根际土壤分别为8.63、9.15、8.02,表现为先升高后降低;CK土壤在春、夏和秋季分别为9.43、9.49、8.46. 根际土壤EC值与CK相比表现为显著降低(P<0.05) [图 4(b)]. 根际土壤EC值在春、夏、秋季分别为796、187、133 μS·cm-1;CK土壤分别为1 387、1 361、925 μS·cm-1.
![]() | 图 4 土壤中酸碱度(pH)和电导率(EC)的变化情况 Fig. 4Change of pH and EC in sample soils |
紫茉莉的生长对土壤石油烃的降解具有显著(P<0.05)的促进作用(如图 5). CK土壤石油烃的总降解率为28.3%,其中,春季为9.6%,夏季为10.2%,秋季为11.6%;紫茉莉根际土壤石油烃的总降解率为81.7%,其中,春季、夏季、秋季的降解率分别为57.2%、38.5%、30.6%.
![]() | 图 5 不同季节土壤中石油烃含量的变化情况 Fig. 5Change of concentration of total petroleum Hydrocarbons (TPH) in soils during the different seasons |
对土壤微生物22种特征PLFAs的相对含量与石油烃的降解率进行Spearman相关性分析(图 6).当相关系数r>0,表明特征PLFAs与TPH降解具有正相关关系,r<0表明具有负相关关系;︱r︱≥0.8 表明具有高度相关性;0.6≤︱r︱<0.8表明具有中等程度的相关性;0.3≤︱r︱<0.6表明具有低度相关性;︱r︱<0.3表明几乎没有相关性.由图 6可知,CK土壤中石油烃的降解与77.8%的PLFAs类型有正相关关系,其中有高度正相关关系(相关系︱r︱≥ 0.8)的PLFAs,包括C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、n16:0、i13:0、16:1ω7t、18:1ω7c、9me14:0、9me16:0;有中、低度正相关关系(相关系数0.3<|r|<0.8)的特征PLFAs,包括c15:0、a16:0、18:1ω9c、18:2ω6,9;根际土壤中,石油烃降解与31.6%的特征PLFAs有正相关关系,与CK相比减少了46.1%. 正相关的PLFAs类型包括i15:0、a14:0、cy18:0、i16:1ω5、16:1ω7t、C18:0,相关系数分别为0.89、0.96、0.96、0.96、0.67、0.35.结果表明CK土壤中石油烃的降解是多数土著微生物共同作用的结果,而根际土壤中石油烃降解是少数特征菌的作用.
![]() | 图 6 石油烃降解与土壤微生物特征性PLFAs相对含量的相关系数 Fig. 6Spearman correlation coefficient of the ratio of total petroleum hydrocarbons(TPH) degradation to the relative content of microbial PLFAs |
对土壤石油烃降解和不同微生物类群PLFAs总生物量进行Spearman相关性分析,结果如图 7.
![]() | 图 7 石油烃降解与不同土壤微生物类群生物量 Fig. 7Spearman correlation coefficient of the degradation ratio of total petroleum hydrocarbons (TPH) to the biomass of different microorganism in the sample soils |
由图 7可知,CK土壤中石油烃的降解与SAT标识的细菌生物量具有高度正相关关系,相关系数为r=0.92;与MONO标识的G-菌生物量有中度正相关关系(r=0.60);与PUFA标识的真菌生物量有低度正相关关系(r=0.19). 根际土壤中,只有中、低度正相关(0<︱r︱<0.8)的微生物类群. 其中,与TBSAT标识的G+(r=0.56)、MONO(r=0.50)和CYCLO标识的G-(r=0.07).
3 讨论 3.1 紫茉莉种植对石油污染盐碱土壤微生物群落结构的影响紫茉莉根际土壤与CK相比较,微生物PLFAs种类变异率在33.3%~71.4%之间,尤其是在春、夏生长旺盛季节,变异率均超过60%.根际土壤微生物生物量在3个生长季节表现为“升降波动”式变化,而CK土壤微生物生物量表现为逐渐增加的趋势.根际土壤微生物生物量与CK相比,春季增加28.3倍,夏季降低71.5%,秋季增加10.8%.CYCLO/MONO的比值均有所增大,尤其是夏季增加77.1%.土壤微生物的环丙磷脂脂肪酸(CYCLO)与其前体类型单不饱和磷脂酸(MONO)的比值(CYCLO/MONO)往往随着环境营养、污染等胁迫作用的大小而发生改变.真菌/细菌的比值标识微生物群落中两种群的相对多度[23].真菌/细菌的比值在根际土壤中,春季和秋季均高于对照组,但夏季没有检测到真菌PLFAs,而CK土壤在春季没有检测到真菌PLFAs. 真菌更易受到轻微改变的环境因子的影响[24],因此,使其在不同生长期和根际土壤微生物群落中的变化较为复杂.由于紫茉莉根系分泌物对根际微生物具有一定的积累性化感胁迫作用,同时,又由于微生物具有对环境变化的诱变适应能力.因此,紫茉莉生长初期,根的分泌活动增加了土壤有机质含量,根际土壤微生物群落的种类和生物量均发生较大变化.随着植物生长期的延长,分泌物在根际土壤中的积累量逐渐增加,根际分泌物的化感作用增强,引起敏感微生物类群的死亡,微生物种类与生物量均减少,表现为夏季明显降低. 由于微生物对环境具有适应性[25],秋季土壤微生物群落种类和生物量均有所增加. 有研究认为植物根系分泌物[26],一方面能为根际微生物提供养分,另一方面,某些成分能够作为信号分子调控根际微生物的行为,从而对根际土壤微生物群落结构与功能产生影响. 赵金莉等[27]研究发现,紫茉莉根际分泌物不断改变土壤养分的供求平衡,影响某些代谢酶的活性,从而影响到土壤养分的转化和根际土壤微生态的平衡.同时,由于紫茉莉根系分泌物的化感作用,能够引起土壤细菌和放线菌数量明显减少.其中,中等浓度的分泌物能促进真菌数量增加,低浓度和高浓度下均导致真菌量减少. 刘明久等[28]用生长速率法证明了紫茉莉浸提液能抑制桃软腐病菌菌丝生长. 王永飞[29]通过体外实验证明,紫茉莉根含有的蛋白成分,对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和大肠杆菌具有抑制作用.
3.2 土壤微生物与石油烃降解的相关性研究表明,紫茉莉根际土壤TPH降解率显著(P<0.05)提高,且随生长期的不同而不同.与CK相比,在春、夏、秋季分别提高47.6%、28.3%、18.9%. 土壤石油烃降解与21.1%的根际土壤微生物PLFAs类型有高度正相关关系(r≥0.8),与CK土壤相比减少41.6%.根际土壤与TPH降解正相关的微生物类群主要是TBSAT标识的G+和MONO标识的G-,而CK土壤主要是SAT标识的细菌和PUFA标识的真菌. Joynt等[30]发现根际土壤G+菌增加,土壤中有机污染物转化速度明显加快. Liste等[31]研究发现种植植物的土壤中,芘的移除率比对照组土壤提高34%;Sicilian等[32]经通过连续两年的植物修复作用研究发现,种植植物的污染土壤中TPH去除量是未种植植物的两倍.随着紫茉莉生长期的延长,TPH降解率降低的主要原因可归结为:①紫茉莉生长加速了土壤微生物对石油烃的代谢作用,土壤中容易降解的石油烃组分减少,而难降解组分的相对增多,增大了土壤微生物对TPH的代谢分解难度;②根际分泌物化感作用的增强,杀死或降低了敏感微生物类群的生长代谢活性;③根的呼吸、代谢与分泌活动对土壤微环境的影响,如根系分泌物能够提高土壤有机质含量,而降低土壤碱解氮、有效磷和钾的含量. 同时,根系代谢活动能够提高土壤蛋白酶活性,而降低土壤脲酶、碱性磷酸酶和纤维素酶活性[33].不同酶活性的变化,影响植物、土壤微生物对有机物或无机离子的代谢吸收或络合等生物和化学过程,使土壤环境pH、EC发生改变,从而影响微生物的代谢活动.该结果与紫茉莉根际土壤微生物群落结构的变化具有一致性.
有研究认为紫茉莉对环境污染表现出一定的抗性[34, 35, 36],能吸收土壤中的重金属离子,可作为污染土壤修复植物,但关于紫茉莉对盐碱土壤石油烃污染物作用的报道较少.石油烃的降解是否与紫茉莉自身吸收、降解或富集等作用有关还有待今后进一步深入研究.
4 结论(1) 紫茉莉种植对根际土壤微生物群落种群和生物量均有较大影响. 与对照组土壤相比,紫茉莉生长的3个生长季节里PLFAs标识的微生物种类变异率均超过30%;微生物生物量在不同生长季节有较大波动,春季增加28.3倍,夏季减少71.5%,秋季增加10.8%.
(2) 紫茉莉种植能够加速根际土壤石油烃的降解,且在不同生长季节有显著差异(P<0.5).根际土壤石油烃的降解率,在春季为57.2%,夏季为38.5%,秋季为30.6%;与CK相比,春季提高47.6%,夏季提高28.3%,秋季提高18.9%.
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