目前为止厌氧氨氧化被认为是一种有前途的生物脱氮途径^{[1, 2, 3, 4]}. 它是指在厌氧或缺氧条件下，微生物直接以氨为电子供体，以亚硝酸盐为电子受体，将两者转变成N₂的生物氧化过程^{[5, 6, 7, 8]}. 随着对厌氧氨氧化研究的深入，人们发现有时氨在厌氧环境中减少还伴随着硫酸盐的“丢失”. 如2001年，Fdz-Polanco等^[9,10]在以颗粒活性炭为载体的厌氧流化床反应器处理甜菜酒糟废水时发现氨和硫酸盐同时减少. 随后，Zhang等^[11]和Yang等^[12]研究表明，在厌氧环境中SO₄^2-和NH₄⁺化学性质稳定，两者间不发生化学反应，而当在反应器中接种微生物以后，发现SO₄^2-和NH₄⁺同步减少. 而Liu等^[13]则进一步证明了硫酸盐型厌氧氨氧化是在微生物的作用下完成的. 硫酸盐型厌氧氨氧化的存在得到了越来越多的证实^[14,15]. 近年来，人们又发现氨氮和硫酸盐的同步去除不仅可发生在实验室规模的人工强化系统中，自然界中也发现了类似的现象. Schrum等^[16]对海底沉积物的一项研究表明海底厌氧环境中也存在着硫酸盐还原厌氧氨氧化现象. 由于污水中多存在一定浓度的硫酸盐^[17]，因此硫酸盐型厌氧氨氧化的发生可以借助硫酸盐将氨态氮在厌氧环境中脱除，而不需要也不必像厌氧氨氧化那样，需要将氨态氮的一半转化为亚硝态氮(好氧亚硝化)才能和另一半氨态氮在厌氧环境下同时脱除. 硫酸盐厌氧氨氧化为污水直接厌氧脱氨奠定了基础.

目前已有不少研究关注到硫酸盐型厌氧氨氧化的发生，但对于硫酸盐型厌氧氨氧化的启动特性及污泥中微生物重要菌群的动态变化、 演替规律，尚未见报道. 基于此，本研究以实验室成功富集到的亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥启动硫酸盐型厌氧氨氧化，并从污泥中微生物的群落结构出发，分析其种群特性. 探求微生物群落改变与硫酸盐型厌氧氨氧化的内在联系，以期为新型生物脱氮除硫途径提供理论基础. 1 材料与方法 1.1 试验水质

试验装置采用直径10 cm，柱高60 cm，有效容积为6.3 L的升流式流化床反应器. 外侧为水浴保温层，保温层外包裹黑布进行避光. 亚硝酸盐型厌氧氨氧化阶段的运行参数：温度35℃±1℃，pH控制在7.6±0.5之间，HRT=1 d，回流比为5. 在进水氨氮和亚硝氮分别为137.8 mg ·L^-1和165.7 mg ·L^-1下，反应器对它们的去除率能达到94.8%和93.2%. 最大氮去除负荷达0.32 kg ·(m³ ·d)^-1.

图 1

Fig. 1

图 1 试验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the reactor

污泥为成功启动并稳定运行的传统厌氧氨氧化污泥. SS：5 487 mg ·L^-1，VSS：4 354 mg ·L^-1，MLVSS/MLSS：0.79； TN容积负荷为0.568 kg ·(m³ ·d)^-1. 废水采用人工配水，其组成如下：NH₄Cl、 NaNO₂和Na₂SO₄按试验需要配制； KHCO₃ 500 mg ·L^-1； KH₂PO₄ 27 mg ·L^-1； CaCl₂ 180 mg ·L^-1； MgCl₂ 200 mg ·L^-1； 微量元素^[18]. 1.3 测定方法 1.3.1 常规指标分析

氨氮、 亚硝氮、 硝氮等水质指标测定均采用国家环保总局颁布的标准方法^[19]. 硫酸盐采用离子色谱法； pH值采用玻璃电极法； MLSS、 MLVSS采用重量法； 污泥粒径采用激光粒度分布仪测定、 污泥微生物采用扫描电镜(SEM)观察. 1.3.2 微生物菌群分析

污泥微生物基因组总DNA提取采用OMEGA E.Z.N.A.^TM Soil DNA Kit D5625-01试剂盒. PCR扩增采用的上游引物为GC-968F：5′-CGCCCGCC GCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAA CGCGAAGAACCTTAC-3′，下游引物为1401R：5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′. 扩增程序为：95℃预变性5 min； 94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环； 72℃再延伸7 min. 扩增结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测.

DGGE所用仪器为DCode^TM Universal Mutation Detection System (U.S.A，Bio-RAD Co). DGGE电泳胶浓度为8%，其变性梯度范围为40%～70%(100%的变性剂中含有7 mol ·L^-1的尿素和40%的去离子甲酰胺)，上量为15 μL的PCR产物，运行条件为：在1×TAE电缓冲液中，60℃条件下，130V预沉10 min，然后80V运行12 h，电泳完成后，Gel Red染色30 min，然后在紫外照射下观察电泳结果^[20,21].

为防止同一泳道上的非特异性条带干扰后续试验，本研究对明亮的特异性条带割胶回收并进行二次PCR后，将所得产物进行克隆转化测序. 2 结果与讨论 2.1 硫酸盐型厌氧氨氧化的启动

将传统厌氧氨氧化反应器转变为硫酸盐型厌氧氨氧化反应器. 进水氨氮浓度保持为100 mg ·L^-1不变，将进水中亚硝氮浓度由70 mg ·L^-1逐步减少到20 mg ·L^-1左右，同时增加硫酸盐浓度. 进出水中氨氮和亚硝氮浓度变化结果见图 2和图 3. 在开始的14 d里，氨氮的去除率为82.4%，亚硝氮的去除率达99.6%，而进、 出水中硫酸盐的浓度几乎无变化，说明此阶段系统主要发生了亚硝酸盐型厌氧氨氧化. 由于硫酸盐型厌氧氨氧化作用还未显现，在降低进水亚硝氮浓度过程中，为防止氨氮浓度相对过高，同时也减少进水氨氮浓度. 因此控制氨氮浓度为80 mg ·L^-1、 亚硝氮为25 mg ·L^-1，硫酸盐浓度提高为200 mg ·L^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 硫酸盐型厌氧氨氧化阶段氨氮和亚硝氮去除特性 Fig. 2 Removal of ammonium nitrogen and nitrite nitrogen in sulfate reducing anaerobic ammonium oxidation

图 3

Fig. 3

图 3 硫酸盐型厌氧氨氧化阶段硫酸盐去除特性 Fig. 3 Removal of sulfate in sulfate reducing anaerobic ammonium oxidation

由于进水中亚硝氮浓度的降低使得厌氧氨氧化菌因缺乏电子受体而导致出水氨氮浓度升高，此时氨氮的去除率为54.5%，亚硝氮的去除率接近100%，硫酸盐的去除率仅为2.7%. 从第29 d开始进水中不再添加亚硝氮，维持进水氨氮浓度为80 mg ·L^-1、 硫酸盐浓度为200 mg ·L^-1，此时氨氮的去除率下降至19.2%，经过61 d的培养，氨氮的去除率提高至35.5%，硫酸盐的去除率也增加至12.7%，Liu等^[13]研究指出硫酸盐型厌氧氨氧化的氮、 硫去除摩尔比为2，而本阶段氮、 硫去除摩尔比为2.42. Fdz-Polanco等^[22]研究表明硫酸盐型厌氧氨氧化过程中会产生NO₂^-等中间产物. 因此可以认为，此时系统中氨氮是在厌氧氨氧化菌和硫酸盐型厌氧氨氧化菌的共同作用下去除的. 提高进水氨氮浓度为100 mg ·L^-1、 硫酸盐为300 mg ·L^-1，进水负荷的提高使得出水中氨氮和硫酸盐浓度迅速上升，然而经过37 d的培养驯化，出水中氨氮和硫酸盐浓度又回落到一个较低水平并趋于稳定.

第126 d时氨氮的去除率为48.6%，硫酸盐的去除率为18.6%，氮、 硫去除摩尔比为2.06，表明此过程中主要以硫酸盐型厌氧氨氧化为主. 为了进一步提高氨氮和硫酸盐的去除效率，再次提高进水中氨氮和硫酸盐浓度分别为130 mg ·L^-1和500 mg ·L^-1. 再经过48 d的驯化培养至177 d时氨氮和硫酸盐的去除率分别为58.9%和15.7%，氨氮和硫酸盐的去除负荷分别为74.3 mg ·(L ·d)^-1和77.5 mg ·(L ·d)^-1，氮、 硫去除摩尔比为2.19，约为2. 氨氮和硫酸盐按摩尔比N/S为2 ∶1的同步去除，表明硫酸盐型厌氧氨氧化已成功启动. 2.2 启动过程硝氮和pH的变化

Jetten等^[23]研究指出，厌氧氨氧化过程会产生少量的硝氮. 因此硝氮的产量可以从侧面反应出厌氧氨氧化菌的增殖情况. 硫酸盐型厌氧氨氧化启动阶段硝氮的变化情况如图 4所示. 整个阶段硝氮的生成量逐渐降低，说明传统亚硝酸盐型厌氧氨氧化因缺少电子受体而受到抑制. 当进水中停止添加亚硝氮，出水仍有8.36mg ·L^-1的生成量，说明此时系统中仍以亚硝酸盐型厌氧氨氧化反应为主. 厌氧氨氧化菌利用硫酸盐型厌氧氨氧化过程中所产生NO₂^-，并将其氧化为硝氮，从而使得出水硝氮含量高于进水.

图 4

Fig. 4

图 4 硫酸盐型厌氧氨氧化阶段硝氮及pH值的变化 Fig. 4 Variation of nitrate and pH in sulfate reducing anaerobic ammonium oxidation

随着反应时间的进行，亚硝酸盐型厌氧氨氧化菌受到抑制，硝氮的生成量逐渐降低. 赖杨岚等^[24]认为硫酸盐型厌氧氨氧化过程中产生的硫化物会和硝氮反应生成氮气和硫酸根或单质硫，从而使得出水硝氮浓度降低. 在本试验中，第105 d首次检测到出水硝氮浓度低于进水硝氮浓度，到174 d时硝氮的去除量达8.7 mg ·L^-1.

前期反应器出水pH值比进水pH值略高，进一步降低进水亚硝氮浓度后，出水pH值也逐渐降低，但出水pH值始终高于进水. 唐崇俭等^[25]认为传统厌氧氨氧化反应消耗H⁺能引起pH上升，因此在0～29 d里反应器主要以传统厌氧氨氧化为主. 当反应进行到44 d时，首次检测到出水pH值低于进水pH. 在44～177 d阶段里，出水pH值进一步降低，说明硫酸盐型厌氧氨氧化是一个pH下降的产酸过程，同袁怡等^[26]研究结果一致. 因此可以将pH值的变化作为硫酸盐型厌氧氨氧化反应强弱的指标. 2.3 污泥及微生物形态特征

污泥性状如表 1所示，0～29 d由于进水亚硝氮浓度的降低，使得亚硝酸盐型厌氧氨氧化菌逐渐受到抑制，此时还未完全向硫酸盐型厌氧氨氧化的转变，因而MLVSS/MLSS降低到0.73. 经过61 d的驯化培养，到90 d时MLVSS/MLSS提高了0.01，这主要是因为硫酸盐型厌氧氨氧化的标准吉布斯自由能变化值ΔG为-45.35 kJ ·mol^-1，而Zhang等^[11]认为在低基质浓度下，ΔG为正值，而在高基质浓度下ΔG为负值. 因此，反应物浓度可显著影响硫酸盐型厌氧氨氧化反应. 而本阶段由于硫酸盐浓度还较低，因此微生物增长较慢. 到177 d时MLVSS/MLSS提高到0.77，说明微生物在高基质浓度条件下增长较快.

表 1(Table 1)

表 1 转变过程中污泥性状 Table 1 Sludge characteristics during the transformation 时间/d MLSS/g·L -1 MLVSS/g·L -1 MLVSS/MLSS 0 5.487 4.354 0.79 29 5.214 3.798 0.73 90 5.372 3.960 0.74 177 5.253 4.052 0.77

表 1 转变过程中污泥性状 Table 1 Sludge characteristics during the transformation

从亚硝酸盐型厌氧氨氧化向硫酸盐型厌氧氨氧化转变过程中污泥粒径如表 2所示，颗粒污泥粒径变化较小，粒径主要分布在0.3～0.8 mm之间.

表 2(Table 2)

表 2 反应器中颗粒污泥粒径变化 Table 2 Change of size of granular sludge during the transformation 时间/d 比例/% <0.3 mm 0.3～0.8 mm 0.8～1.0 mm 1.0～2.0 mm >2.0 mm 0 16.5 34.7 18.4 17.4 13.0 90 18.3 37.9 15.7 16.2 11.9 177 17.1 35.3 18.4 18.8 10.4

表 2 反应器中颗粒污泥粒径变化 Table 2 Change of size of granular sludge during the transformation

采用扫描电镜(SEM)对污泥进行观察，如图 5所示，(a)为亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥中微生物，主要以球菌为主； (b)为经过177 d驯化后的硫酸盐型厌氧氨氧化污泥中微生物，主要以短杆菌为主，长约2～3 μm. 亚硝酸盐型厌氧氨氧化和硫酸盐型厌氧氨氧化可能是由于不同细菌作用的结果.

图 5

Fig. 5

图 5 扫描电镜下污泥形态 Fig. 5 Sludge morphology of scanning electron microscope

采用PCR-DGGE技术对反应器运行前后生物菌群的变化情况进行了研究，如图 6所示. A、 B分别为亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥和硫酸盐型厌氧氨氧化污泥微生物DNA的DGGE图谱. 将DGGE图谱中的明亮条带band1～band6割胶回收采用二次PCR并进行克隆测序. 其测序结果登录GenBank进行BLAST比对，结果显示band2序列同Candidatus brocadia sinica (AB565477)的相似度为100%，同时将此序列信息提交GenBank数据库，命名为Uncultured Candidatus brocadia sp.clone YLJ-1，基因序列登录号KM583866. Band1序列和Bacillus benzoevorans 16S rRNA gene (Y14693)的相似度为100%，在GenBank数据库中命名为Uncultured bacillus sp.clone YLJ-2，基因登录号KP336392. 运用软件ClustalX及MEGA构建16S rRNA序列系统发育树如图 7所示.

图 6

Fig. 6

图 6 PCR-DGGE指纹图谱 Fig. 6 PCR-DGGE fingerprint

图 7

Fig. 7

图 7 16S rRNA序列发育树 Fig. 7 Molecular phylogenetic tree

BLAST结果表明6条条带均与已知菌属序列表现出了较高的相似度，其中band3与已知菌属Anaerolineaceae(厌氧绳菌)序列相似度为100%； band4与Bacteroidetes(拟杆菌)序列相似度分别为91%； Band5同已知菌属Nitrospira(硝化螺旋菌)序列相似度为96%，band6与已知菌属Thiobacillus(硫杆菌)序列相似性度93%. 从DGGE图谱中条带的亮度强弱可知，band5(硝化螺旋菌)随着硫酸盐取代亚硝氮后而被淘汰，相反band6的出现说明硫杆菌属能够更好地适应新环境并最终得以增殖； band3、 band4在A、 B条带中均有所出现，变化不明显，在整个阶段始终存在，表明该类菌属对反应器中进水环境的改变具有较强的适应能力，不属于系统中功能性微生物菌群. band1、 band2条带亮度发生最为明显的变化，表明Bacillus(芽孢杆菌)能够适应氨氮和硫酸盐共存的环境，并成为反应器中优势菌群； 而Candidatus brocadia属则无法适应新环境致使数量逐渐减少. 蔡靖等^[27]研究发现，Bacillus能够在无分子态氧存在的条件下，以硫酸盐为电子受体氧化氨，具有硫酸盐型厌氧氨氧化能力. 试验中反映出硫酸盐型厌氧氨氧化的出现很可能是由于Bacillus的增殖引起的. 当Bacillus增殖并成为优势菌属后，系统中便出现硫酸盐型厌氧氨氧化现象. 发育树表明，Uncultured Candidatus brocadia sp.clone YLJ-1同Uncultured bacillus sp.clone YLJ-2 16S rRNA gene分别位于两个不同分支，亲缘关系较远，属于不同种属. 3 结论

(1)以传统亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥为污泥源可以实现硫酸盐型厌氧氨氧化反应器的启动. 历时177 d成功实现了硫酸盐型厌氧氨氧化. 进水氨氮和硫酸盐浓度分别为130 mg ·L^-1和500 mg ·L^-1下，反应器对氨氮和硫酸盐的去除率分别达到58.9%和15.7%，对氨氮和硫酸盐的去除负荷为74.3 mg ·(L ·d)^-1和77.5 mg ·(L ·d)^-1，氮、 硫损失摩尔比为2.19. 出水pH值低于进水.

(2)污泥中细菌从以球菌为主转变成以短杆菌为主，菌群中细菌由Candidatus brocadia为优势种转变为以Bacillus benzoevorans为优势种. 说明完成这两种厌氧氨氧化的优势菌不同，两种厌氧氨氧化并非同一种菌参与完成的.