棕囊藻是我国广东沿海地区赤潮暴发的高发藻种,棕囊藻的暴发严重破坏海洋环境,已给我国沿海地区的经济和水产养殖业带来了严重的损失^[1],寻找控制及治理棕囊藻赤潮的有效方法及技术已迫在眉睫.基于高效、低成本和二次污染的考虑,利用溶藻细菌抑制或杀灭赤潮的生物控藻技术已成为赤潮治理最有应用前景的新热点.

溶藻细菌是指能够分解和抑制藻细胞生长的细菌,细菌溶藻有直接和间接两种溶藻方式.间接溶藻是指溶藻细菌通过分泌胞外活性物质导致藻细胞死亡,多数的报道表明细菌溶藻是以间接方式抑制或杀死藻细胞的^{[2, 3]}.目前对溶藻细菌的研究主要集中在溶藻细菌的筛选、胞外活性物质的分离鉴定及溶藻机制的探讨^{[4, 5, 6]},这些研究都是在实验室的水装置或烧杯中进行的.自然水体中的水环境是动态的,水质状况较为复杂.细菌在实际水体中的溶藻情况及水体水质参数的变化、环境因子的影响等,未见有相关报道.因此就会有以下情况:溶藻细菌虽然在实验室研究中有显著的溶藻效果,但在自然水体中的效果却并不好,有的溶藻细菌抑制藻细胞生长的同时,会增加水体中营养元素的浓度^[7,8].因此,研究溶藻细菌在自然水体中的溶藻作用对开发生物控藻技术、研发生物杀藻剂具有重要意义.

多数赤潮藻在暴发时会产生大量毒素物质,包括糖类^[9,10]、溶血毒素^[11]和脂肪酸类^[12,13].研究表明球形棕囊藻所含毒素是以1′-O-十七碳二烯酰基-3′-O-(6-O-α-D-吡喃半乳糖-β-D-吡喃半乳糖基)-甘油为主的糖脂混合物,分子中含有C_14:0、C_16:0和C_17:2的脂肪酸^[14],该毒素释放到水体中会造成鱼类大面积死亡.彭喜春等^[15]利用薄层层析法发现实验室培养的球形棕囊藻毒素中含有4种糖脂类化合物.赤潮藻在受到环境胁迫条件下,容易分泌藻毒素来抵抗外界环境的变化.溶藻细菌的投加,使赤潮藻的生长受到抑制,在抑制赤潮藻过程中,藻毒素是否也能够得到抑制或降解,目前还尚未见到相关的报道.

课题组前期研究已从珠海赤潮发生水体中分离得到1株能够抑制球形棕囊藻生长的芽孢杆菌B1,该菌株是通过分泌以氨基酸、肽类为主的胞外活性物质来抑制球形棕囊藻生长,该类物质具有热稳定、亲水性,在pH为6.0~9.0范围内具有较高溶藻率,对球形棕囊藻的最佳投加体积比是1:100^{[16, 17, 18]}.本研究通过模拟自然水体,探究B1菌胞外活性物质在自然水体中对球形棕囊藻的溶藻效果、溶藻前后水体水质参数的变化、藻毒素成分和含量的变化,以期为研制生物抑藻剂应用于赤潮治理提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 溶藻细菌及其胞外活性物质

芽孢杆菌B1(GenBank登录号是JN228893)由课题组从珠海香洲球形棕囊藻赤潮暴发水域中分离得到,用2216E固体培养基于4℃冷藏保存.细菌在1000 mL 2216E液体培养基中于160 r ·min^-1,30℃恒温振荡培养4 d后,以6000 r ·min^-1离心8 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤后得到胞外活性物质. 1.2 藻种

供试藻种为球形棕囊藻(Phaeocystis globosa),由暨南大学赤潮与水环境研究中心藻种室吕颂辉教授提供.藻种培养液采用f/2培养基,培养温度为20℃±1℃,光照强度为4000 lx,光暗比为12 h:12 h. 1.3 溶藻实验

模拟水样取自珠海香洲棕囊藻赤潮高频暴发海域,水质指标见表 1.用100 μm筛网过滤掉悬浮物和漂浮物后,各取10 L过滤水样加入到2个20 L塑料水箱中,投加球形棕囊藻,控制初始浓度均为1.0×10⁶cells ·L^-1,培养条件与1.2节中藻种培养条件一致.一个水箱添加体积比为1:100的B1菌胞外活性物质作为处理组,另一个水箱不投加活性物质作为对照组.溶藻实验周期为14 d,每两天采集水样进行水质检测,检测方法参照《海洋监测规范》(GB 17378.4-2007),分析方法见表 2,取样检测时对照组与处理组光照强度同为4000 lx,实验设置3个平行.

表 1(Table 1)

表 1 采集水样的水质指标 Table 1 Water quality index of collecting water samples 指标 水温/℃ 盐度/‰ 浊度/NTU pH DO/mg·L-1 TN/mg·L-1 TP/mg·L-1 初始值 20 20 0.88 8.02 8.01 0.91 0.21

表 1 采集水样的水质指标 Table 1 Water quality index of collecting water samples

表 2(Table 2)

表 2 水质指标测定方法 Table 2 Methods for the determination of water quality index 指标 测定方法 指标 测定方法 叶绿素a 丙酮萃取分光光度法[19] NH4+-N 靛酚蓝分光光度法 pH pH计 NO2--N 萘乙二胺分光光度法 高锰酸钾盐指数 碱性高锰酸钾法 NO3--N 锌-镉还原法 DO 溶解氧测定仪 PO43--P 磷钼蓝分光光度法

表 2 水质指标测定方法 Table 2 Methods for the determination of water quality index

投加活性物质溶藻14 d后,分别从处理组和对照组中各取1000 mL水样,经4000 r ·min^-1离心10 min后收集藻细胞.加入氯仿:甲醇:水(体积比为13:7:5)混合溶液10 mL,450 W,4℃超声破碎30 min,静置.待完全分层后取下层溶液,真空干燥后即得脂肪酸粗提物,溶于1 mL甲醇于4℃保存待用. 1.4.2 脂肪酸甲酯化

取5 mg脂防酸粗提物,加入0.5 mL 0.1% NaOH-甲醇溶液,55℃加热15 min后加入1 mL 5% HCl-甲醇溶液,55℃加热15 min,再加0.5 mL H₂O.冷却后,脂防酸甲酯用6 mL正己烷萃取3次,合并提取液置于试剂瓶中,用氮气吹至0.5 mL进行GC-MS检测. 1.4.3 GC-MS分析

色谱条件:进样口温度250℃,检测器温度280℃;色谱柱及升温程序:TG-1MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),初始柱温75℃,保持1 min,以30℃·min^-1速度升温至150℃,然后以1.5℃·min^-1速度升温至250℃,保持5 min,再以10℃·min^-1升温至280℃,保持3 min;载气:氦气,恒流模式,流速1.2 mL ·min^-1,柱前压0.1 MPa;进样方式:不分流进样,进样量1 μL,溶剂延迟4 min.

质谱条件:EI离子源70 eV,阱温280℃,接口温度260℃,离子扫描范围为50~500 u,数据采集方式为全扫描模式. 1.5 数据统计分析

实验数据均以平均值±标准误表示,用Origin 8.0进行数据处理,用SPSS10.0软件进行数据统计分析,采用单因素方差分析比较不同数据组间的差异,P<0.05表明差异显著,P<0.01表明差异极显著. 2 结果与分析 2.1 叶绿素a的变化

水体中叶绿素a含量的变化可以反映藻生物量变化的情况,是测定藻生物量的一个指标.在模拟自然水体溶藻实验中,投加活性物质后,水体中叶绿素a的变化呈显著下降趋势(图 1).第14 d时,处理组叶绿素a的含量比对照组降低了82.3%(P<0.01).叶绿素a降低,表明芽孢杆菌B1胞外活性物质能有效抑制球形棕囊藻的生长,降低藻生物量.

图 1

Fig. 1

图 1 添加活性物质对模拟水体叶绿素a的影响 Fig. 1 Effect of algicidal substance on chlorophyll-a in the simulative water

水体中pH、DO和高锰酸盐指数的变化如图 2.由图 2(a)可知,在溶藻的14 d内,处理组pH从初始值8.50降低至7.51.pH值的变化与藻类的光合作用有关,pH值越高表明藻类光合作用越强^[18].模拟自然水体的溶藻实验表明,投加活性物质后,球形棕囊藻的生长受到抑制、光合作用减弱,从而导致水体pH值的降低.

图 2

Fig. 2

图 2 添加活性物质对模拟水体pH、 DO和高锰酸盐指数的影响 Fig. 2 Effect of algicidal substance on pH, DO and permanganate index in the simulative water

水体中溶解氧的浓度变化如图 2(b),从中可知,随着实验时间的增加,对照组中DO浓度也增加,处理组中DO浓度下降.实验至14 d时,对照组中DO浓度由8.51 mg ·L^-1降低至7.14 mg ·L^-1,处理组中DO浓度由8.51 mg ·L^-1升高至10.12 mg ·L^-1,相对于对照组增加了29.5%(P<0.05).推测这可能是由于活性物质抑制或杀死了水体中藻细胞后,致使藻细胞消耗水中的DO能力下降,水体富氧能力增强、水体中溶解氧浓度增加.

投加活性物质的处理组,水体中高锰酸盐指数随实验时间的增加而降低;未投加活性物质的对照组中高锰酸盐指数随实验时间的增加而增加[图 2(c)].实验至14 d时,处理组中高锰酸盐指数由最初的7.40 mg ·L^-1减少到4.23 mg ·L^-1,比对照组降低了55.2%(P<0.01). 2.3 水体中N、P元素的变化 2.3.1 NH₄⁺-N、NO₃^--N和NO₂^--N的变化

溶藻过程中水体中N元素的变化如图 3.从中可知,在投加活性物质后,处理组的NH₄⁺-N和NO₃^--N的浓度呈增加趋势,在溶藻的第14 d,NH₄⁺-N由初始的0.30 mg ·L^-1增加至0.47 mg ·L^-1,比对照组增加了0.46倍[图 3(a)],处理组的NO₃^--N和NO₂^--N浓度随处理时间的延长而增加,第14 d时,处理组中NO₃^--N和NO₂^--N浓度分别增加到2.68 mg ·L^-1和0.05 mg ·L^-1,相对于对照组(0.37 mg ·L^-1和0.02 mg ·L^-1)分别增加了6.24和1.50倍(P<0.01)[图 3(b)和3(c)].

图 3

Fig. 3

图 3 添加活性物质对模拟水体中N元素形态的影响 Fig. 3 Effect of algicidal substance on N element forms in the simulative water

水体中PO₄^3--P浓度的变化如图 4所示.从中可知,处理组中PO₄^3--P浓度随处理时间的增加而增加,溶藻14 d后,由初始的0.12 mg ·L^-1增加至0.23 mg ·L^-1,比对照组(0.10 mg ·L^-1)增加了1.30倍(P<0.05).对照组中PO₄^3--P浓度变化不大,在0.05~0.10 mg ·L^-1附近浮动.

图 4

Fig. 4

图 4 添加活性物质对模拟水体中 Fig. 4 Effect of algicidal substance on PO3-4-P in the simulative water

球形棕囊藻在赤潮暴发时会分泌脂肪酸类毒素,对海洋生物造成危害.利用溶藻细菌胞外活性物质抑制球形棕囊藻生长时,测定溶藻前后脂肪酸类毒素的变化对其未来的安全性应用具有重大意义.在溶藻实验的第14 d,分别测定了对照组和处理组水体中球形棕囊藻分泌的藻毒素--脂肪酸成分和浓度的变化(表 3).由表 3可知,未投加活性物质的对照组中球形棕囊藻分泌的藻毒素总共含有7种脂肪酸,为C_14:0、C_16:0、C_16:1、C_18:0、C_18:1、C_18:2和C_18:3,总含量为2.29 mg ·L^-1,以C_18:2、C_16:0和C_18:1的含量最高,分别为0.63、0.44和0.41 mg ·L^-1.投加活性物质的处理组中,在溶藻后的第14 d,只检测出6种脂肪酸,其中C_18:2未检测出来,脂肪酸的总含量只有0.38 mg ·L^-1,相比对照组降低了83.4%(P<0.01),其中C_16:0降低了97.7%,C_18:1降低了85.4%(P<0.01),表明芽孢杆菌B1胞外活性物质在模拟自然水体中能有效降低球形棕囊藻毒素--脂肪酸的含量.

表 3(Table 3)

表 3 活性物质对球形棕囊藻脂肪酸的影响 Table 3 Effect of algicidal substance on fatty acids from Phaeocystis globosa 脂肪酸 对照组/mg·L-1 处理组/mg·L-1 降解率/% 14:0 0.37±0.05 0.15±0.03 59.5 16:0 0.44±0.03 0.01±0.01 97.7 16:1 0.11±0.02 0.06±0.02 45.5 18:0 0.10±0.01 0.06±0.03 40.0 18:1 0.41±0.03 0.06±0.01 85.4 18:2 0.63±0.06 未检出 100 18:3 0.20±0.01 0.03±0.02 85.0 其他 0.03±0.01 0.01±0.01 66.7

表 3 活性物质对球形棕囊藻脂肪酸的影响 Table 3 Effect of algicidal substance on fatty acids from Phaeocystis globosa

赤潮暴发过程水体中pH、DO和COD等都会随着赤潮的生消过程发生变化,如pH值和COD在赤潮暴发时较高,赤潮消退后降低^[20].利用溶藻细菌治理赤潮,通过监测水体水质参数的变化,可反映其溶藻特性,反映赤潮受到抑制后的消退过程.本研究中,投加活性物质到模拟自然水体溶藻14 d后,叶绿素a降低82.3%(P<0.05),DO升高29.5%(P<0.05),pH降低至7.51,高锰酸盐指数降低55.2%(P<0.01).李蔷等^[16]研究表明,在实验室理想条件下,芽孢杆菌B1胞外活性物质在5 d内能使球形棕囊藻的叶绿素a降低94.9%.活性物质在模拟自然水体中的溶藻效果相对在实验室理想条件下有所下降,可能是由于球形棕囊藻在复杂水体的耐受力比在单一水体中更强.DO升高一方面可能是由于活性物质溶解藻细胞后,水体浊度降低,大气向水体复氧增强,另一方面是由于藻细胞溶解,藻类呼吸作用减弱,氧的消耗量降低.pH降低,可能是由于球形棕囊藻受到活性物质的抑制,光合作用减弱,藻类对水体中CO₂的吸收降低,水体酸度增加,pH下降.高锰酸盐指数降低一方面可能是由于活性物质在溶解藻细胞的过程中,氧化降解了水中的还原性物质,与水中有机物发生反应,有机物被分解,有机物含量下降.另一方面可能是由于投加的活性物质含有氨基酸,氨基酸类营养物质可直接被微生物吸收利用,促进水体中净化功能微生物的生长,进一步使水体得到净化.Kurbanoglu等^[21]研究表明,投加蜡芽孢杆菌NRRL B-3711后,可使水体中COD显著下降,通过对其细胞内物质检测发现含有大量的氨基酸.本研究结果与Schmack等^[22]类似,其在水槽实验中研究表明,利用生物制剂来控制藻华时,水体中DO升高,pH和高锰酸盐指数降低.

氮、磷营养物质是海洋生源要素,为藻类的生长提供物质条件.海水中N、P浓度随赤潮的发生呈规律性变化,其含量在赤潮潜伏期较高,高峰期下降,消散期回升^[23].本研究表明活性物质在抑制球形棕囊藻生长的同时,能使水体中N、P浓度增加.原因可能是:①在富营养化条件下藻细胞了吸收大量营养元素,活性物质作用后,藻细胞解体,N、P元素被释放到水体中.赵玲等^[5]研究发现芽孢杆菌B1胞外活性物质能使球形棕囊藻丙二醛含量(MDA)显著上升,降低其超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,通过降低机体中保护酶的活性和加剧膜脂质过氧化的程度等来抑制球形棕囊藻的生长.李蔷等^[16]研究表明,B1菌活性物质抑制球形棕囊藻的过程是:细胞壁分解→细胞外边缘物溶出→细胞膜破裂→细胞质内含物溢出→藻体死亡(图 5).②由于水箱条件的限制,释放出来的N,P营养物质无法经过完整的食物链进行物质循环,始终残留在水体中,导致N,P浓度增加.③水箱缺乏底泥沉积物对N,P元素的吸收,底泥中底栖生物对去除水体中营养元素具有重大的贡献^{[24, 25]}.张木兰等^[26]研究表明改性沉积物能使富营养化水体中TN、TP分别降低70%和80%.Jung等^[8]将荧光假单胞菌HYK0210-SK09投加到硅藻水体中进行小试,结果表明该细菌能增加水体N、P元素浓度.

图 5

Fig. 5

(a)~(h)分别为B1菌活性物质作用于球形棕囊藻0、8、16、24、32、40、48、56 h后的藻细胞图 5 溶藻过程中球形棕囊藻细胞的显微结构 Fig. 5 Microstructure of Phaeocystis globosa in the lysing process (10×100)

球形棕囊藻暴发时会产生大量毒素,对海洋生物造成危害^[27],何家苑等^[14]研究表明其毒素中含有脂肪酸.脂肪酸的毒性与不饱和键的数目有关,随不饱和键的增加而增加^[28].投加芽孢杆菌B1胞外活性物质到模拟自然水体中处理14 d后,总脂肪酸浓度降低83.4%(P<0.01),3种主要脂肪酸C_18:2、C_16:0和C_18:1分别降低了100、97.7和85.4%(P<0.01).推测一是由于球形棕囊藻的生长受到活性物质的抑制,藻生物量降低,合成脂肪酸也降低;推测二可能是投加的活性物质能够降解球形棕囊藻脂肪酸,导致脂肪酸含量降低.另外,C_18:2又称亚油酸,9,12-十八碳二烯酸,结构如图 6.亚油酸是一种重要的化感物质,能够对海洋浮游植物产生抑制^{[29, 30]},对多刺裸腹蚤具有毒性作用^[31].投加芽孢杆菌B1胞外活性物质后,球形棕囊藻脂肪酸C_18:2得到了完全抑制或降解,研究结果为芽孢杆菌B1作为生物控藻剂应用于棕囊藻赤潮的治理生态安全性提供理论依据.

图 6

Fig. 6

图 6 9,12-十八碳二烯酸的结构 Fig. 6 Chemical structure of 9, 12-Octadecadienoic acid

(1)在模拟自然水体中,芽孢杆菌B1分泌的胞外活性物质能有效抑制球形棕囊藻的生长,溶藻14 d时,相对于对照组,处理组中pH降低至7.51,叶绿素a降低82.3%(P<0.05),DO增加29.5%(P<0.05),高锰酸盐指数降低55.2%(P<0.01),活性物质的存在对水质指标会产生影响.

(2)投加芽孢杆菌B1胞外活性物质后,水体中N,P浓度随处理时间的增加而增加,14 d时,NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N和PO₄^3--P浓度分别增加了0.46、1.50、6.24和1.30倍.

(3)活性物质抑制球形棕囊藻生长后,总脂肪酸含量降低83.4%(P<0.01),主要脂肪酸C_18:2、C_16:0和C_18:1含量分别降低了100%、97.7%和85.4%(P<0.01),表明芽孢杆菌B1胞外活性物质能有效降低球形棕囊藻藻毒素物质脂肪酸的含量,实验结果为其安全性应用提供理论依据.