环境科学  2015, Vol. 36 Issue (8): 2727-2734   PDF    
引用本文
王步英, 郎继东, 张丽娜, 方剑火, 曹晨, 郝吉明, 朱听, 田埂, 蒋靖坤. 基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征[J]. 环境科学, 2015, 36(8): 2727-2734.
WANG Bu-ying, LANG Ji-dong, ZHANG Li-na, FANG Jian-huo, CAO Chen, HAO Ji-ming, ZHU Ting, TIAN Geng, JIANG Jing-kun. Characterizing Beijing's Airborne Bacterial Communities in PM2.5and PM10 Samples During Haze Pollution Episodes Using 16S rRNA Gene Analysis Method[J]. Environmental Science, 2015, 36(8): 2727-2734.
基于16S rRNA基因测序法分析北京霾污染过程中PM2.5和PM10细菌群落特征
王步英1, 郎继东2, 张丽娜2, 方剑火2, 曹晨3, 郝吉明1, 朱听3, 田埂2 , 蒋靖坤1     
1. 清华大学环境学院,北京 100084;
2. 清华大学测序平台,北京 100084;
3. 清华大学生命学院,北京 100084
收稿日期: 2014-12-29; 修订日期: 2015-03-25.
基金项目： 国家自然科学基金创新研究群体项目(21221004); 国家自然科学基金重大项目(21190054)
作者简介：王步英(1989~),女,硕士研究生,主要研究方向为大气颗粒物中微生物,E-mail:wangbuying6666@163.com
通讯联系人,田埂,E-mail:tiangeng@biomed.tsinghua.edu.cn;蒋靖坤E-mail:jiangjk@tsinghua.edu.cn
摘要：2013年1月8~14日,北京出现了严重的霾污染. 霾污染时高浓度的大气颗粒物增加了暴露人群的健康风险,而大气中的微生物也可能带来一些风险,但目前对霾污染时大气中微生物组成了解较少. 本研究选取了2013年1月8~14日北京7 d的PM2.5和PM10采样样本,通过对细菌16S rRNA基因 V3区扩增和MiSeq测序,得到PM2.5和PM10中的细菌群落结构特征,并将结果与相同采样样本的宏基因组测序结果及三项国外基于16S rRNA基因测序方法的大气中细菌研究结果进行了比较. 研究发现7 d连续采样条件下,PM2.5中细菌群落结构在门和属的水平上均差别不大. 在属级别上,节杆菌属(Arthrobacter)和弗兰克氏菌属(Frankia)是北京冬季大气中细菌群落的主要类群. 16S rRNA基因测序与宏基因组测序结果对比分析发现,在属级别上,两种分析方法中有39个相同的属类群(两种分析方法丰度前50的细菌类群合并所得),弗兰克氏菌属(Frankia)和副球菌属(Paracoccus)在16S rRNA基因测序分析结果中相对含量较多,而考克氏菌属(Kocuria)和地嗜皮菌属(Geodermatophilus)在宏基因组测序结果中相对含量较高. 在门和属的水平上,PM2.5和PM10中细菌群落结构特征呈现出相似的规律. 在门水平上,放线菌门(Actinobacteria)在PM2.5中的相对百分比较大,而厚壁菌门(Firmicutes)在PM10中的相对百分比较大. 在属水平上,梭菌属(Clostridium)在PM10中的相对百分比较大. 与三项国外基于16S rRNA基因测序研究结果对比发现,尽管在采样地点和采样时间上有较大差异,大气中普遍存在一些相同的细菌类群,且近地面大气细菌群落结构特征相似度较高,区别于高空对流层中细菌群落结构特征.
关键词： 北京     霾污染     PM2.5     16S rRNA基因     细菌群落    
Characterizing Beijing's Airborne Bacterial Communities in PM2.5and PM10 Samples During Haze Pollution Episodes Using 16S rRNA Gene Analysis Method
WANG Bu-ying1, LANG Ji-dong2, ZHANG Li-na2, FANG Jian-huo2, CAO Chen3, HAO Ji-ming1, ZHU Ting3, TIAN Geng2 , JIANG Jing-kun1     
1. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China;
2. Sequence Platform of Tsinghua University, Beijing 100084, China;
3. School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Abstract: During 8th-14th Jan., 2013, severe particulate matter (PM) pollution episodes happened in Beijing. These air pollution events lead to high risks for public health. In addition to various PM chemical compositions, biological components in the air may also impose threaten. Little is known about airborne microbial community in such severe air pollution conditions. PM2.5 and PM10 samples were collected during that 7-day pollution period. The 16S rRNA gene V3 amplification and the MiSeq sequencing were performed for analyzing these samples. It is found that there is no significant difference at phylum level for PM2.5 bacterial communities during that 7-day pollution period both at phylum and at genus level. At genus level, Arthrobacter and Frankia are the major airborne microbes presented in Beijing winter samples. At genus level, there are 39 common genera (combined by first 50 genera bacterial of the two analysis) between the 16S rRNA gene analysis and those are found by Metagenomic analysis on the same PM samples. Frankia and Paracoccus are relatively more abundant in 16S rRNA gene data, while Kocuria and Geodermatophilus are relatively more abundant in Meta data. PM10 bacterial communities are similar to those of PM2.5 with some noticeable differences, i.e., at phylum level, more Firmicutes and less Actinobacteria present in PM10 samples than in PM2.5 samples, while at genus level, more Clostridium presents in PM10 samples. The findings in Beijing were compared with three 16S rRNA gene studies in other countries. Although the sampling locations and times are different from each other, compositions of bacterial community are similar for those sampled at the ground atmosphere. Airborne microbial communities near the ground surface are different from those sampled in the upper troposphere.
Key words: Beijing     haze pollution     PM2.5     16S rRNA gene     bacterial community    

2013年1月我国中东部地区(包括北京)发生了多次严重的霾污染事件，北京最严重的一次霾污染过程发生在1月8~14日. 其中，1月12日北京PM2.5日均值浓度值超过500 μg ·m-31]. 霾污染导致一系列健康风险，但已有研究多关注大气颗粒物理化特性的健康影响[2,3]，对大气中微生物的群落特征以及其致病性了解甚少. 而细菌和真菌在近地面大气中普遍存在[4]，数量能达到103~106 cells ·m-35]. 一些动物和植物的致病菌会引起人类的过敏和哮喘[6]，致病菌及病毒的大范围传播会引起全球性的疾病[7].

传统对大气中细菌群落结构特征的认识多基于培养的方法[8, 9, 10, 11]，但可培养的细菌仅占总微生物量的一小部分(0.1%~10%)[12,13]，且大气中细菌菌属对营养以及生长因子的需求比较多样，这就导致了培养基选择上的困难[14]. 从公众健康的角度来看，基于培养方法获得的微生物信息可能会遗漏一些重要的致病菌或过敏源[15].

16S rRNA基因(16S)是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，遗传信息丰富，既有反映物种间亲缘关系的保守区，也存在可判定种间变异的可变区，适合于进行种群分类和系统发育研究. 16S测序分析方法通过提取样品中的基因组DNA，扩增16S rRNA基因，并对其进行测序分析，以得到大气中细菌群落组成、结构和多样性特征. 16S分析作为细菌系统分类的主要依据已得到了广泛的应用，已成为大气中细菌的一种有效分析技术[16].

而宏基因组(metagenomics，Meta)分析测序方法，是直接获取环境样品中全部微生物的所有DNA序列信息，可以在种的水平上确定致病菌. 本研究小组首次采用宏基因组分析测序的方法分析了北京2013年1月8~14日连续7 d的采样样本，在种的水平上确定了致病菌的存在，并且发现一些致病菌的相对丰度会随着霾污染浓度的增加而增加[17]. 但该方法尚未得到广泛应用，目前已有的关于大气细菌群落结构特征的研究多使用16S分析的方法[18, 19, 20, 21, 22, 23]. 对北京地区而言，使用16S测序分析方法对大气细菌群落特征的研究较少[24]，更没有专门针对北京冬季霾污染时大气中细菌群落结构特征的16S研究. 并且由于气象因子、土地利用类型等的不同，不同时间地点的细菌群落结构特征会有所不同[18,22]. 不同粒径范围内细菌群落结构特征也存在差别[6,23].

因此，本研究使用基于16S的测序分析方法获得了北京2013年1月8~14日连续7 d采样条件下大气中细菌群落结构特征，对比了PM2.5和PM10中细菌群落结构特征的异同. 同时，将此结果与相同采样样本的宏基因组测序结果[17]进行了对比分析. 最后，将北京霾污染时细菌群落特征与三项国外基于16S分析的大气中细菌研究[分别为意大利米兰城市空气中(米兰)［18]、美国纽约地铁空气中(纽约)[19]和大西洋中西部上层对流层大气中(对流层)[20]采样样本］数据上传至同一数据库进行分析比较，以探究国内外大气颗粒物中细菌群落结构的异同. 1 材料与方法 1.1 样品采集

PM2.5和PM10样品采样点位于清华大学环境科学实验室楼顶(40°00′17″ N，116°19′34″ E，采样口距地面10 m)，采样点距最近的河流和医院的距离分别约为20 m和690 m. 样品采集于2013年1月8~14日，采样持续时间为23 h(上午10:00~次日上午09:00)，采样仪器为两台PM2.5大流量采样器，一台PM10大流量采样器(RFPS-1287-063、赛默飞世尔科技公司、美国麻省)，流量均为1.13 m3 ·min-1. 采样前后分别记录每个滤膜的质量，滤膜采样前后的质量差除以23 h采样体积得到采样地点PM2.5和PM10的质量浓度估值(为防止微生物污染，并未将滤膜恒温恒湿处理). 采样所用石英滤膜(10 inch×8 inch)使用前在500℃马弗炉烘烤5 h. 为了避免微生物污染，所有的实验用具，如膜托、切割头、镊子、剪刀等用75%酒精消毒或者进行高压蒸汽灭菌. 在进行16S分析前，采集样品后的滤膜放置于-80℃冰箱存储. 样品采集地点及采样具体信息可参见文献[17]. 1.2 DNA提取

DNA提取的具体步骤如文献[17]所述. 将1/4 PM10滤膜以及7/4 PM2.5滤膜分别剪碎并放入50 mL离心管中，之后向管内注满0.1 mol ·L-1的磷酸盐缓冲盐溶液(1×PBS，pH 7.4)，在200 g下离心2 h. 上清液用0.2 μm孔径的聚醚砜(PES)滤膜(PALL，美国纽约)过滤，将过滤膜剪碎，用MO-BIO PowerSoil DNA试剂盒提取(卡尔斯巴德，美国加州)，相关的步骤依照该试剂盒的说明书进行. 其中，为提高DNA提取效率，将柱纯化改为磁珠纯化. 用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Qubit分别测定所提取DNA的质量和浓度. 空白膜采用相同的提取方法进行操作，未检测到DNA. 提取后所得DNA样品，均放在-80℃条件下存储. 1.3 16S rRNA 基因V3区PCR扩增

将14个滤膜样本(7个PM2.5样本，7个PM10样本)所提取DNA样品分别作为PCR反应的模板，对16S rRNA 基因的V3区进行扩增,上下游引物的序列(引物两侧加上适用于Illumina平台测序的序列)[25]如表 1所示. PCR反应采用25 μL体系[10 μmol ·L-1的上下游引物各1.5 μL，Taq酶(Q5 Master Mix)12.5 μL，DNA模板和ddH2O共9.5 μL，每个样品的DNA总量约为5 ng]. PCR反应程序为：98℃预变性30 s，98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s扩增25个循环，72℃延伸7 min. PCR产物分子量通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测.

表 1 16S V3区 PCR扩增引物序列组成 Table 1 Primers sequence of 16S V3 area's PCR amplification
1.4 MiSeq 测序分析

将磁珠纯化后的PCR产物用2100 Bioanalyzor(安捷伦，加利福尼亚州)检测目的片段(16S V3区)的存在. 采用Illumina的MiSeq测序平台，对细菌16S的V3区序列进行高通量测序，得到的数据量如表 2所示. 测序由清华大学测序中心完成，从原始下机数据去接头、去污染、去低质量，得到可信数据，根据索引号对比至各个样品，得到每个样品完整的基因序列. 将序列上传至MG-RAST(Metagenomics analysis server http://metagenomics.anl.gov/)服务器[26]. 在一定的限定条件下(Max. e-value Cutoff=1e-5,Min.% Identity Cutoff=99%,Min. Alignmnet Length Cutoff=32)对比至Greengenes数据库[27]，得到每个样品的细菌群落结构特征. 有研究表明，16S可以提供足够大的信息量捕获细菌群落结构的差异[28, 29, 30].

表 2 PM2.5和PM10样本的 MiSeq测序数据量 Table 2 MiSeq sequence data of PM2.5 and PM10
2 结果与讨论 2.1 北京霾污染时PM2.5中细菌群落组成

2013年1月8~14日，采样点膜称重所获得的PM2.5和PM10质量浓度估值如图 1所示. 其中，1月8日颗粒物浓度最低，而1月12日颗粒物浓度最高.

图 1 2013年 1月 8~14日 PM2.5和 PM10质量浓度估值 Fig. 1 Mass concentration of PM2.5 and PM10 during 8th-14th January,2013

在门水平上，7 d PM2.5样品中，放线菌门、厚壁菌门、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对百分比相差不大，且其相对百分比之和均达到97% 以上. 将7 d PM2.5细菌数据汇总，得到放线菌门所占比例达到62.34%，其次是厚壁菌门(14.64%)、变细菌门(11.47%)、蓝藻门(5.45%)和拟杆菌门(3.46%)，剩余的其他16种细菌，包括梭杆菌门(Fusobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)等，相对百分比总和为2.63%.

而在属水平上，取7 d PM2.5样品中丰度排在前10的细菌类群进行合并分析，共得到17个菌属，其相对百分比如表 3. 从中可知，在连续7 d采样条件下，PM2.5中所含细菌菌属的相对百分比差别不大，7 d样品的主要菌属均为节杆菌属，其次为弗兰克氏菌属. 这与本研究小组用Meta测序分析方法分析同一批样本所得的结果[17]相同，即大多数细菌菌属在连续7 d采样时间内相对百分比变化不明显. 但1月13日中，乳球菌属(Lactococcus)和束村氏菌属(Tsukamurella)的相对百分比含量与其余6 d相比较高.

表 3 7 d PM2.5 样本前10丰度的细菌菌属的相对百分比/% Table 3 Relative abundance of top 10 bacterial genera of PM2.5 during 7 sampling days/%

2.2 16S与Meta结果对比

将16S与Meta测序所得序列上传至MG-RAST，在属水平上对比至Greengenes数据库，对每天的数据选择丰度排在前50的细菌类群，然后将7 d的数据合并，分别得到16S PM2.5、16S PM10的数据及Meta PM2.5、Meta PM10的数据. 将这四者(16S PM2.5、16S PM10、Meta PM2.5、Meta PM10)再次合并，在属的级别上，得到39个16S与Meta共有的细菌类群，对丰度排在前10属的共有类群作出其相对百分比柱状图，如图 2.

共有类群中的前10属在16S与Meta中的相对百分比有所不同. 弗兰克氏菌属和副球菌属在16S的结果中相对百分比较高，而考克氏菌属和地嗜皮菌属在Meta中相对含量较高. Yooseph等[31]在其研究中指出，基于16S分析的细菌菌属的数量不同于Meta分析的结果. 这可能是一些特定的群落导致了基于16S分析与Meta分析的不同. 16S分析可以在属及属以上的水平鉴定微生物，且个别菌属的扩增效率在16S分析和Meta分析中的差别比较大. 而Meta分析是对从环境中提取出的DNA直接进行建库、测序和分析，可以在种的水平上测定微生物，以提供更多的致病菌信息. 本研究小组基于同一批样品采用宏基因组的分析方法在种的水平上识别出颗粒物中大部分微生物类群是不致病的，

图 2 16S与 Meta分析结果中前 10属共有类群的相对百分比Fig. 2 Relative percentage of bacterial community based on 16S and Meta analysis (the top ten genus)

但是一些呼吸道病原体微生物(肺炎链球菌)的序列也出现在Meta分析结果中，且其丰度随着颗粒物污染浓度的增加而增加. 本研究基于16S测序的方法在属的水平上也发现了肺炎链球菌所在属类别上链球菌属的存在. 2.3 PM2.5和PM10的细菌群落特征对比

为比较PM2.5和PM10中细菌群落结构特征的差异，将7 d PM2.5和PM10 样品分别汇总后在门和属的水平上进行对比分析. 在门水平上，放线菌门、厚壁菌门、变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门的相对百分比含量在两种粒径范围内差别不大，如图 3所示. 但放线菌门在PM2.5中相对百分比含量大于PM10，而厚壁菌门在PM10中的相对含量大于PM2.5. 可能原因是放线菌主要以孢子状态存在于大气颗粒物中，这也使得其在细颗粒物中相对量较多，而厚壁菌门在大气中更倾向以细菌聚合物形式存在，因而与大颗粒更相关[23].

图 3 门水平上 PM2.5和 PM10中细菌群落相对百分比 Fig. 3 Relative percentage of bacterial community in PM2.5 and PM10 at phylum level

在属水平上，各取PM2.5和PM10中丰度前10的菌属合并后，作相对百分比图如图 2所示. 从中可以看出，节杆菌属、弗兰克氏菌属、地嗜皮菌属等在PM2.5和PM10中的相对百分比含量差别不大，而梭菌属在PM10中的相对百分比含量较大，可能原因是梭菌属本身粒径比较大，因此在PM2.5中的相对含量比较少[6]. 由此可知，霾污染时PM2.5和PM10样品中细菌群落结构差别不大，这也与其他研究结果相一致. Franzetti等[23]研究了米兰冬夏两季大气PM2.5和PM10中细菌群落结构特征，发现不同粒径间的细菌类群差异小于不同季节间细菌群落结构的差异，即同一季节不同粒径范围细菌类群有较大的相似性. Bowers等[6]分析了美国科罗拉多州近地面城市和农村地区大气中粗颗粒物和细颗粒物中细菌的多样性，结果表明不同地区的细菌群落相对丰度的差异大于不同粒径段间的细菌类群的差异. 2.4 北京与国外其他三项研究结果的对比

为更好地对国内外大气颗粒物中细菌进行对比分析，特将米兰、纽约和对流层采样样本测序分析的原始数据上传到MG-RAST，设置相同的限定条件(Max. e-value Cutoff=1e-5,Min.% Identity Cutoff=99%,Min. Alignmnet Length Cutoff=32)，得出其细菌类群的丰度. 米兰的研究采用250 L ·min-1的大流量采样器，于2010年春夏秋冬4个季节每个季节连续采集10 d的样品，每次采样持续24 h，共得到40个采样滤膜样品[18]. 纽约的研究采用液体撞击器，采样流量为250~300 L ·min-1，每次采样体积为5~6 m3，于2007年3月、8月及2008年8月这3个时间段在7个地铁站和3个临近公园进行采样，得到共26个采样样品[19]. 对流层的研究，于2010年8月至9月，平均每次采集3 h，采样体积约6 m3，采集了距海平面10 km高海拔处的9个空气样品[20].

在门级别上，对四项研究的细菌群落结构作相对百分比，结果如图 4所示. 北京、米兰和纽约细菌群落结构比较相似，细菌类群依照相对百分比含量从大到小排列依次为：放线菌门、厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门等. 而对流层所发现的细菌类群依照相对百分比含量从大到小排列依次为：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门.

图 4 门级别上北京与米兰、纽约、对流层的细菌群落相对百分比 Fig. 4 Relative percentage of bacterial community in Beijing,Milan,New York and troposphere at phylum level

在属级别上，各个地点呈现出特有的细菌群落结构特征. 分别取4个城市丰度为前10的菌属合并分析，得到相对百分比的柱状图，如图 5所示. 节杆菌属、里氏杆菌属(Riemerella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属分别为北京、米兰、纽约和对流层最主要的细菌类群. 除了采样地点的差异，这可能也受到采样季节等因素的影响.

图 5 北京、米兰、纽约与对流层共有类群的相对百分比(前10属合并) Fig. 5 Relative percentage of bacterial community of Beijing,Milan,New York and troposphere (merge of top 10 genus)

北京霾污染时采集的14个样品(PM2.5与PM10汇总所得)16S测序分析的细菌多样性较高，Alpha多样性为：67~164，而对流层测序分析得到的细菌群落的多样性最低，Alpha多样性为：5~26. 导致多样性差别的可能影响因素之一是各研究的测序深度不同.

Fierer等[32]发现尽管他们的大气微生物样品的采样地点和采样气象条件同其他地点所采集的样品不尽相同，但是当采用相同分析方法时各样品的微生物群落结构之间存在很好的相似性. 本研究结果 与米兰、纽约、对流层的测序结果对比分析也得出相似的结论，即尽管在属级别上各采样地点存在特有的群落结构特征，在门级别上的群落结构有很高的相似性，即一些细菌菌属在不同大气环境中普遍存在. 这可能是由于这些特定的细菌菌属比较容易气溶胶化，并能在一些相对不利的环境中生存，另外大气输运过程也有助于微生物的长距离传输.

3 结论

(1)北京霾污染时7 d连续采样条件下，细菌群落结构特征在门和属的水平上均变化不大.

(2)16S序列与Meta基因组两种分子生物学分析结果比较表明，丰度前50的细菌类群中有39个相同的属类群,部分细菌类群在两种测序结果中的相对百分比有所差别，弗兰克氏菌属和副球菌属在16S结果中相对含量较高，而考克氏菌属和地嗜皮菌属在Meta结果中相对含量较高. 并且在16S测序分析中发现了宏基因组测序分析结果中识别出的肺炎链球菌所在属：链球菌属.

(3)PM2.5和PM10之间细菌群落结构在门和属水平上均差别不大，部分类群在不同粒径中的相对百分比有所差别. 如在门水平上，放线菌门在PM2.5中的相对百分比较大，而厚壁菌门在PM10中的相对百分比较大. 而在属水平上，梭菌属在PM10中的相对百分比较大.

(4)与国外三项基于16S的研究结果相比，北京大气中检测出的细菌多样性最高. 四项研究尽管有着不同的采样地点、时间和采样条件，其细菌群落中都存在放线菌门、变形菌门、厚壁菌门等类群. 其中，对流层呈现出变形菌门和拟杆菌门占主导的细菌群落结构特征. 节杆菌属、里氏杆菌属、葡萄球菌属和梭菌属分别为北京、米兰、纽约和对流层最主要的细菌类群.

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