2015, Vol. 36
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
全氟化合物(perfluoroalkyl substances,PFASs)具有化学稳定性、 高表面活性、 疏水疏油和耐热性等优良特性. 自20世纪中期被广泛用于农药、 造纸、 黏合剂和石油化工等工业生产和民用领域[1,2]. 由于大规模的生产使用，PFASs已在全球范围内不同的环境介质以及野生动物和人体内被检出[1,3]. 其中全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA) 和全氟辛烷基磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)是目前应用最广泛的两种PFASs，也是多种其他PFASs 在环境中的最终转化产物[4]. 2009年PFOS及其盐类被正式列入《关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约》，成为一类使用和排放受到严格制约的PFASs，而PFOA虽受一些发达国家的管控，但在我国仍存在一定规模的生产和排放[5]. 目前，国内外关于PFOA和PFOS对生态系统的毒性研究多集中在针对模式动物的肝脏毒性、 遗传和免疫毒性、 生殖和发育毒性、 内分泌干扰效应和潜在致癌性等方面[7]，而其对植物和微生物生态效应的研究涉及不多，关于PFASs对细菌群落变化可能造成影响方面的研究更是几乎没有.
前期调查研究发现[6]，位于山东的小清河流域集中分布较大规模的PFASs类物质生产企业，环境样品中具有较高浓度的PFOA. 因此，本研究从该地区采集受不同程度PFASs污染的表层沉积物样品，分析沉积物中PFASs的含量和相关理化指标，采用第二代Illumina MiSeq测序技术分析细菌群落多样性[8]. 而且，采用冗余分析方法探索了PFOA污染和微生物群落结构变化之间的内在联系，以期为揭示PFOA对微生物群落的生态效应及风险评价提供相关理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况小清河位于山东省中部，发源于济南市，于寿光县羊口镇入海.据调查，山东省的氟聚合物生产企业主要分布在小清河沿岸，并在淄博市桓台县形成产业集聚(XQ5点位附近，图 1)，主要工业产品包括含氟制冷剂、 生产农药和药物的中间体、 聚四氟乙烯(PTFE)和四氟乙烯(TFE)等[6]. 截至2012年底，上游附近氟工业区平均年产3.7万t PTFE、 5万t TFE、 1万t六氟丙烯和超过20万t不同的氟化制冷剂[9]. 前期调查研究表明沉积物样品中所检测的17种PFASs，共12种有不同程度地检出，生产企业排放的工业废水使得小清河中PFOA的暴露水平高达3 648.6 kg ·a-1，显著高于国内外其它区域PFOA的暴露量[6].
1.2 样品的采集和处理分别于2014年4月和7月用底泥采样器(WHL15-HL-CN型)采集10个0~15 cm表层沉积物样品(图 1)，每一样点将2 m×2 m面积的四周及中间共5 份表层沉积物混匀，装入聚丙烯塑料瓶，样品立即置于冰盒保存和运输，返回实验室后取一部分置于－20℃保存，供细菌分子生物学分析，其余样品室内风干、 研磨、 过2 mm筛，用于PFASs 和理化性质分析.
 | 图 1 小清河流域沉积物采样点位分布示意
Fig. 1 Sediment sampling sites along the Xiaoqing River
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12种PFASs包括全氟丁酸(perfluorobutanoic acid，PFBA)、 全氟戊酸(perfluoropentanoic acid，PFPeA)、 全氟己酸(perfluorohexanoic acid，PFHxA)、 全氟庚酸(perfluoroheptanoic acid，PFHpA)、 全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)、 全氟壬酸(perfluorononanoic acid，PFNA)、 全氟癸酸(perfluorodecanoic acid，PFDA)、 全氟十一酸(perfluoroundecanoic acid，PFUdA)、 全氟十二酸(perfluorododecanoic acid，PFDoA)、 全氟丁烷磺酸(perfluorobutane sulfonate，PFBS)、 全氟己烷磺酸(perfluorohexane sulfonate，PFHxS)和全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS). PFASs和质量标记物纯度均＞98% (Wellington 实验室，加拿大). 乙酸铵(~98%)、 氨水(28%~30% NH3 basis)、 氢氧化钠和盐酸(HCl，≥37%)均购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis，美国)，色谱纯甲醇和乙腈购自J.T. Baker公司(Phillipsburg，美国).
Supelco ENVI-Carb 净化小柱(250 mg，3 mL)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis，美国)，Oasis WAX固相萃取小柱(6 cc，150 mg，30 μm)购自Waters 公司(Milford，美国，氮吹仪所用高纯氮纯度＞99.999%，安捷伦1290 高效液相系统串联安捷伦6460三重四级杆质谱系统(安捷伦科技，Palo Alto，美国)，超声清洗机(KQ5200型，中国昆山).
1.3.2 样品前处理及仪器分析称取2 g沉积物样品置于50 mL聚丙烯离心管，加入2 mL 100 mmol ·L-1 NaOH 的乙腈水溶液(乙腈 ∶水，8 ∶2)，超声30 min，然后加入20 mL 乙腈，振荡30 min，再加入2 mol ·L-1盐酸溶液0.1 mL 后在3 000 r ·min-1离心15 min. 取上清液置于另一50 mL离心管，剩余物质加入10 mL乙腈，重复上述步骤一次，两次获得的上清液置于同一个离心管，用高纯氮气吹至1 mL浓缩液. 该1 mL萃取液继续用ENVI-Carb和OASIS-WAX固相萃取小柱净化. Envi-Carb小柱用3次1 mL乙腈活化后，将1 mL浓缩液过柱收集，并再次用3次1 mL乙腈清洗小柱，将4 mL收集到的浓缩液加超纯水稀释至100 mL，再用OASIS WAX小柱净化. OASIS WAX小柱依次用4 mL 0.1%的氨水/甲醇溶液、 4 mL甲醇及4 mL超纯水活化后，将100 mL稀释液过柱，使溶液中的PFASs 吸附在柱上，而后用4 mL 25 mmol ·L-1醋酸铵淋洗. 风干小柱后用4 mL甲醇和4 mL 0.1%氨水/甲醇溶液洗脱，整个固相萃取过程将流速控制在每秒1滴. 将洗脱液高纯氮气吹至1 mL，过0.22 μｍ尼龙滤膜，进行HPLC /MS-MS 检测[6].
1.3.3 色谱-质谱条件液相系统所用色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm×100 mm，3.5 μm，前接3 μm在线过滤器，柱温40℃，进样量5 μL. 流动相为2 mmol ·L-1乙酸铵(A)和乙腈(B)，流速0.3 mL ·min-1，初始比例为80%A和20%B，保持0.5 min，经8 min变为10%A和90%B，保持2 min后，回到初始状态保持5 min. 质谱条件为电喷雾电离负源(ESI-)，雾化温度350℃，雾化器压力40 psi，辅助气(N2)流量9 L ·min-1，毛细管电压3 500 V.
1.3.4 质量控制及保证在样品采集过程中，除用聚丙烯瓶盛装外，另用3层聚丙烯袋做密封处理，并设置场地空白和运输空白. 分析过程中严格控制并避免了含氟材料特别是PTFE的使用. 所有实验容器和装置在使用前均经超纯水和甲醇预处理，分析过程加入程序空白、 试剂空白和回收率等质控处理. 采用内标法定量，PFASs基质加标回收率为75%~117%. 检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别设定为信噪比(S/N)＞3和＞10的浓度，其中LOD(以干重计)为0.002~0.01 ng ·g-1，LOQ(以干重计)为0.01~0.04ng ·g-1. 标准偏差均在合理范围内(±20%)，所有空白处理均低于检测限.
1.4 主要环境因子的测定沉积物pH 值、 总氮(TN) 分别用pH 计(W样品 ∶超纯水=1 ∶2.5)、 凯氏定氮法测定，全磷(TP)选用酸溶-钼锑抗比色法(LY /T 1232-1999)[10]和紫外可见分光光度计(UV2700，日本岛津公司)比色测定，有机碳(TOC)采用催化燃烧法[11]并用总碳分析仪(型号：Multi N/C 3100，德国Analytik jena公司)测定，沉积物的颗粒组成根据土壤粒级划分标准[12]用激光衍射系统Malvern Master Sizer 2000 (MalvernCo，英国)测定，水体电导率和溶解氧采用智能多参数水质分析仪(5B-2H，北京连华)进行测定.
1.5 微生物群落结构分析 1.5.1 DNA提取和MiSeq测序流程DNA提取：称取沉积物样品0.5~0.7 g，采用DNA提取试剂盒Fast DNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，美国)，按说明书步骤提取总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度和浓度，最终使用无菌水稀释样品至1 ng ·μL-1.
PCR扩增：16S rDNA的V4去扩增[13]，使用带Barcode的特异性引物515F: 5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′，引物806R:5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′. PCR的反应体系为每30μL反应混合液包含：15 μL Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs，美国)，细菌DNA模板10 μL，引物3 μL和2 μL的H2O. PCR扩增在Bio-rad T100梯度PCR 仪上进行，反应条件为: 98℃预变性1 min； 随后进行30个PCR扩增 (98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 min)； 最后72℃延伸5 min. PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测. 根据PCR 产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，割胶回收目标条带. 使用NEB Next UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒(New England Biolabs，美国)进行文库构建，经Qubit 荧光定量和Agilent Bioanalyzer 2100 system文库检测合格后，使用Illumina公司的MiSeq平台进行250 bp/300bp双末端测序法上机测序.
1.5.2 信息分析流程和OTU列表生成利用双末端(Paired-End)测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据. 首先对原始数据进行拆分，去除末端接头序列和引物序列，并截去barcode序列和PCR扩增引物序列，再将拆分的数据使用FLASH (V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样品进行拼接[14]，过滤去除序列集合中长度小于平均长度70%的序列，并去除其中的嵌合体序列，最终得到有效数据(Clean Tags). 用QIIME[15]和UPARSE软件(http://drive5.com/uparse/)[16]对序列进行聚类，根据97%相似性将序列聚类成OTU(Operational taxonomic units)，并为每个OTU选取代表序列进行注释[13]，从而得到每个样品的OTU和分类谱系的基本分析结果.
1.5.3 微生物群落结构分析对样品OTU进行丰度、 多样性指数等分析，其中Chao 指数和Observed_species分析均是对物种丰富度的直观反映，Shannon指数既考虑到样品中分类总数，也包含每个分类所占的比例. 结合三方面不同alpha多样性指数的整合分析，可知样品内群落的多样性、 均匀度等信息. 在以上分析基础上，进行聚类分析、 RDA统计比较分析，挖掘样品间的物种组成差异和环境因子的相关性.
1.6 数据处理和分析采用Microsoft Excel和SPSS 19.0软件(Pearson相关性分析)对数据进行分析. 使用CANOCO 5.0软件对MiSeq测序揭示的细菌群落结构与环境因子进行冗余分析(redundancy analysis，RDA).
2 结果与讨论 2.1 小清河表层沉积物中PFASs的暴露水平沉积物样品中所检测的12种PFASs，均有不同程度检出. 如图 2所示，两次采样PFASs含量分别为8.5～465.6 ng ·g-1和1.3～803.5 ng ·g-1，平均值分别为109.5 ng ·g-1和104.3 ng ·g-1. 各个沉积物样点浓度最高的PFASs均是PFOA，含量分别为3.8～456.2 ng ·g-1和0.6～748.7 ng ·g-1，平均值为103.1 ng ·g-1和96.3 ng ·g-1. PFASs浓度最高的XQ5点位在两个月份PFOA的含量分别达456.2 ng ·g-1和748.7 ng ·g-1，占PFASs的97.9%和93.2%. 高浓度的PFOA证明该区域存在点源污染且已证实污染源位于XQ5上游[6]，其它点位PFOA浓度相对低应是由于小清河主河道的稀释作用. 沉积物中较高水平的PFOA暴露与前期该流域水体研究结果相一致[6,17].
 | 图 2 4月和7月沉积物样点PFASs浓度
Fig. 2 PFASs concentrations of sediments samples in April and July, 2014
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有研究表明，环渤海11条水系河道内和沿海沉积物中PFAS平均值为0.535 ng ·g-1和0.578 ng ·g-1，且最高值均未超过2 ng ·g-1，PFOA仅占其中的8%和30%[17]. Meng等[18]根据平衡分配预测沉积物中PFOA的无效应浓度参考值为0.70 μg ·g-1. 据此可知，小清河流域PFOA浓度显著高于其它环渤海水系，且7月污染源附近浓度已高出参考值，由此带来的危害和生态风险不容忽视.
2.2 小清河表层沉积物中细菌多样性分析PFOA浓度最高的XQ5点位在4月细菌的丰富度和均匀度指数为研究区沉积物各样点最低(表 1). XQ4和XQ5点位物种分类树(图 3)选取相对丰度前10的物种，4月PFOA浓度最低的XQ4其优势菌种为变形菌门(Proteobacteria)的硫杆菌属 (Thiobacillus)、 Dok59、 Sulfurimonas、 Sulfuritalea，分别占所选取物种的比率为45.78%、 19.2%、 10.10%、 10.09%； PFOA浓度最高的XQ5其优势菌种为变形菌门(Proteobacteria)的硫杆菌属 (Thiobacillus)和Sulfurimonas，分别占所选取物种的比率为47.56%和47.97%. 表明受高浓度PFOA污染点位的优势菌种类减少，均匀度降低. 优势菌种硫杆菌属(Thiobacillus)在XQ4和XQ5占所有物种的比率为4.52%和22.81%，说明当PFOA浓度较高时硫杆菌属 (Thiobacillus)的含量和比重会明显升高. 7月XQ5 样点PFOA的污染最重，达到748.7 ng ·g-1，但细菌微生物的丰富度和均匀度和其它样点相比没有显著降低.
 | 表 1 4月和7月沉积物细菌群落多样性统计结果 Table 1 Summary of the richness and diversity of bacterial community in the sediment in April and July, 2014 |
 | 圆圈的大小表示该分类的相对丰度大小，分类名下方数字前者表示占所有物种的比分率，后者表示占所选取物种的百分率图 3 4月XQ4和 XQ5物种分类树
Fig. 3 Species classification trees of XQ4 and XQ5 in April, 2014
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有研究表明，硫杆菌属 (Thiobacillus)中的一些种在去除环境中重金属和相关生产工艺上发挥着重 要作用，如氧化亚铁硫杆菌 (Thiobacillus ferrooxidans)和氧化硫硫杆菌 (Thiobacillus thiooxidans)对重金属具有良好的沥滤效果，这种微生物浸矿技术可用于冶炼金属[19]、 废旧线路板中黄金和铜的浸出[20]以及废旧催化剂加工程序[21]； 脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)在废水同步脱硫反硝化处理工艺中起主要作用[22]. 同时有研究证实用于浸铀实验的Thiobacillus thiooxidans适应培养体系的氟浓度能力可达40 mg ·L-1，且其耐氟能力通过驯化可以提高[23]. 以上关于硫杆菌属 (Thiobacillus)在环境中作用和耐氟能力的研究表明该菌属有作为PFOA污染指示菌种和生态效应研究的潜质.
2.3 环境因子与微生物群落关系分析 2.3.1 表层沉积物的环境因子分析水体及沉积物环境因子值如表 2所示，研究区沉积物整体呈弱碱性，两个月平均温度分别为22.2℃和31.3℃. 整体上，两个月pH值、 含水量、 颗粒物粒度含量差异不大，但DO、 盐度、 氮、 磷营养盐浓度则表现出4月高于7月，4、 7月TN平均浓度分别为0.90 g ·kg-1和0.82 g ·kg-1，全磷平均浓度分别为0.96 g ·kg-1和0.75 g ·kg-1. 大多数样点有机碳含量在7月含量高于4月，尤其是XQ5由14.5 g ·kg-1波动到62.2 g ·kg-1. 4月XQ5环境因子指标与其它样点比无明显差异，而7月该点的有机碳和总氮含量明显高于其它样点，分别为62.2 g ·kg-1和2.7 g ·kg-1. 产生这种现象的原因可能有三点：一是由于年中是氟化工行业生产旺季[24]，含大量有机物的工业废水被排放并沉积在河底； 二是微生物生理活动，如对C,N的矿化作用，表现出随着受污染程度加深其周转效率越低[25]； 三是水体沉积物PFOA的吸附行为主要受沉积物中有机碳的影响，化合物的富集随有机碳的增加而增加[26,27].
| 表 2 4月和7月沉积物样品环境因子 Table 2 Environmental factors of sediment samples in April and July, 2014 |
对环境因子和细菌群落数据(OTU、Chao、Observed_species、Shannon)进行Pearson相关性分析，并对环境因子进行多次CCA筛选. 结果表明，TOC、 盐度和PFOA浓度是影响该区域4月细菌群落结构的主要环境因子. 基于此进行RDA冗余分析，可以看出，细菌多样性信息的72.4%能够为以上3个变量所解释. 其中，第一排序轴解释信息量达65.5%，第二排序轴为6.9%，群落数据与环境因子排序轴的相关系数为0.8616和0.8186，能够较好地反映样点细菌群落数据与环境因子之间的关系. 由RDA排序图可知(图 4)，PFOA是影响细菌群落分布的关键因素，有机碳次之，PFOA与OTU，Chao和Observed_species均呈负相关，与Shannon指数呈极显著负相关(r=-0.780，P＜0.01)，表明PFOA能显著影响小清河细菌群落丰富度和均匀度. XQ5点位受PFOA影响最为显著，XQ10(位于入海口)受盐度影响最为显著，PFOA次之，其它点位(PFOA浓度低于100 ng ·g-1)与有机碳关系较为密切. 7月环境因子与细菌群落结构之间没有发现明显的相关关系，PFOA对细菌群落影响亦不显著，尚有待进一步研究.
 | 图 4 4月RDA分析结果
Fig. 4 RDA analysis results of sediments in April, 2014
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(1) 小清河流域沉积物中普遍检出PFASs，并以PFOA为主，4月和7月采样点PFOA含量分别为3.8～456.2 ng·g-1和0.6～7548.7 ng·g-1. XQ5样点位于污染源附近，其PFOA 浓度在4、 7月分别达最高值456.2 ng ·g-1和748.7 ng ·g-1. 该流域PFOA浓度显著高于环渤海其它水系，且7月污染源附近沉积物中PFOA浓度已高出有关参考值. (2) PFOA是小清河4月影响微生物群落结构的关键因子，与群落丰富度和均匀度均呈显著负相关. PFOA污染最重的XQ5点位细菌群落丰富度和均匀度指数为各样点中最低. 但PFOA在浓度较低时(＜100 ng ·g-1)，对微生物群落结构的影响并不显著. 7月PFOA对细菌群落结构影响不显著. (3) 硫杆菌属(Thiobacillus)在低浓度PFOA条件下数量较少，但在高浓度PFOA下数量较高且成为优势菌种，初步证明硫杆菌属 (Thiobacillus)是PFOA污染响应的敏感物种，有作为指示微生物的潜质.
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