河流不仅是全球水循环的重要环节，也是人类工农业生产和生活用水的重要水源之一. 由于河流生态系统在全球生源要素循环中起着重要作用，因此其可为全球环境质量状况提供早期预警^[1]. 近30年来，随着我国人口增长、 经济发展和城市化进程加快，大量氮、 磷及有机污染物等排放到河流水体，促使生态环境污染问题日益严峻，进一步加剧了水资源短缺，对人类的健康与社会发展构成了严重威胁^[2,3,4]. 生态环境恶化会导致水生生物(藻类、 无脊椎动物和鱼类)的物种灭绝和生物多样性减少，进而造成生态系统生态功能衰退^{[5, 6]}.

原核生物是水域生态系统的重要组成部分，在生源要素循环、 有机物分解和污染物净化等方面起着非常重要的作用^{[7, 8]}. 全面了解原核生物群落在河流生态系统中的时空分布特征及其生态功能作用，对于管理和维护河流生态环境具有深远意义. 基于16S rRNA基因的水生细菌群落研究表明，放线菌门(Actinobacteria)、 变形菌门(Proteobacterium)中的α-、 β-及γ-Proteobacterium、 拟杆菌门(Bacteroidetes)、 蓝细菌门(Cyanobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)等类群在淡水生境中广泛分布，且分化为适应淡水生境的特有种群，被统称为“典型淡水细菌类群”(typical freshwater bacteria)^{[8, 9]}. 然而，这一研究结果主要是基于对湖泊浮游细菌群落的调查，目前对河流细菌群落结构和多样性的认识还较为不足. 由于水生细菌群落演替与生态系统的环境质量变化息息相关，因此可替代水环境监测的传统指示生物^{[10,11,12,13]}. 然而，有关人为扰动(人类活动导致的环境变迁)影响河流细菌群落结构和多样性的研究还较少.

甬江水系是浙江省八大水系之一，是宁波的“母亲河”，流域面积4 572 km^2[14]. 甬江流域主要包括余姚江、 奉化江和甬江干流：前两者汇合于宁波市区三江口，构成甬江干流，全长26 km，向东于镇海流入东海^[14](图 1). 随着快速城市化进程的影响，人类活动对甬江流域水环境影响加剧，因此极有必要全面评估甬江水系的健康状况并了解该生态系统的关键组分. 然而以前研究多关注于甬江流域的水文状况^{[15, 16]}、 理化因子分析^[14]以及浮游植物群落特征^[17]，尚未有甬江流域原核生物群落研究的报道.

图 1

Fig. 1

图 1 甬江、余姚江和奉化江采样站位示意 Fig. 1 Location of Yongjiang River, Yuyao River and Fenghua River sampling stations

近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，基于原核生物16S rRNA基因PCR扩增-高通量测序联用技术极大地促进了环境微生物学研究的深度和广度^{[11, 18]}. 本研究综合水质理化因子分析、 16S rRNA基因-Illumina Miseq高通量测序和生物信息分析等技术，首次分析了甬江流域宁波三江口区域的水体原核生物群落，以期为后续甬江流域的环境监测和污染治理提供重要基础数据.

三江口地处宁波市闹市区，是该市的主要景观水体之一. 因此，三江口区域的水体环境质量监测与评价对于城市的可持续发展显得尤为重要. 为了填补三江口水域原核生物群落参数这一空白，于2014年4月采集该区域甬江(Yongjiang River，站位YJ1和YJ2)、 余姚江(Yuyao River，站位YY1)和奉化江(Fenghua River，站位FH1)的表层水体(0.5 m)样品，开展原核生物群落分析. 采样站位的地理位置见图 1. 水样用20 μm筛绢(Millipore公司)预过滤后，用0.22 μm Sterivex-GP过滤器(美国Millipore公司)收集微生物，样品带回实验室后置于-80℃冰箱保存. 同时采集水样用于水体营养盐测定，包括总氮(total nitrogen,TN)、 总磷(total phosphorus,TP)、 NH₄⁺-N、 NO₂^--N、 NO₃^--N和溶解态反应磷(souble reactive phosphorus,SRP). 表层水体的温度、 盐度、 电导、 pH和溶氧(dissolved oxygen，DO)用YSI 650MDS型水质分析仪(美国YSI公司)现场测定. 测定营养盐的水样经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，用QC8500型流动注射分析仪(美国Lachat公司)测定，测定方法及数据处理参见文献^[19].

滤膜DNA用FastDNA Spin kit for Soil试剂盒(美国MP Biomedicals公司)提取，提取步骤参考配套说明书. DNA的质量和浓度用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND-1000分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定.

原核生物16S rRNA基因V4-V5高变区用通用引物515F(5′-GTG YCA GCM GCC GCG GTA-3′)/907R(5′-CCG YCA ATT YMT TTR AGT TT-3′)扩增^[20]，515F引物5′端带有独特的序列标签用于样品区分. PCR反应程序如下：94℃预变性5 min； 94℃变性45 s，50℃退火60 s，72℃延伸90 s，共25个循环； 72℃延伸10 min. PCR产物用胶纯化试剂盒(Promega公司)纯化. 回收产物浓度用Qubit dsDNA BR Assay Kit(Life Technologies公司)精确定量、 等量混合后，送至上海美吉生物医药科技有限公司用Illumina Miseq平台进行高通量测序(PE250).

Miseq高通量测序数据用Mothur V1.33.3^[21]和QIIME V1.70软件^[22]分析. 为保证生物信息学分析质量，首先用Mothur软件的“Make.contigs”对Miseq双向测序数据进行匹配组装，并去除含有模糊碱基N以及PCR引物和识别标签有错的序列. 操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)以97%序列相似度划分，并用QIIME软件的“alpha_diversity.py”计算多样性指数(Faith PD,Chao1,Shannon-Wiener index和Gini index). “beta_significance.py”模块用于比较不同样品原核生物群落的差异(UniFrac significance test). 序列用RDP Classifier算法(80%置信度)基于Greengenes v13_08数据库^[23]进行种属分类，叶绿体(Chloroplast)的16S rRNA序列被剔除于后续分析之外.

本地病原菌数据库的构建参见本课题组已建立的方法，共收集283个代表性病原细菌的16S rRNA基因序列^[24]. 甬江流域Miseq测序数据，经BLASTN序列同源性比对(设定参数：e value≤1e-10； ≥95% coverage)，与病原菌参考数据库进行匹配分析，选取出与数据库中病原菌16S rRNA基因序列相似度大于97%(种)和99%(亚种)的序列.

研究结果表明，在2014年4月，奉化江、 余姚江和甬江这4个采样站位表层水体的水温范围为17.97~18.61℃，余姚江的水温略高. 奉化江、 余姚江站位的水体pH值分别为7.18和7.40，明显高于甬江站位的水体pH值； 但甬江的水体电导率略高于奉化江和余姚江，这可能预示了潮汐导致的海水入侵已经影响到了宁波城区的甬江水体(表 1). 总体上，采样站位的水体DO和DO饱和度(%)均较低，其浓度范围分别为2.65~5.35 mg ·L^-1和28.50%~58.20%.

表 1(Table 1)

表 1 甬江、余姚江和奉化江站位的表层水体环境参数及原核生物多样性指数 Table 1 Environmental parameters and alpha-diversity index of prokaryotic community in the surface water of Yongjiang River, Yuyao River and Fenghua River 项目 参数 FH1 YY1 YJ1 YJ2 经纬度 经度/(°) 121.555 121.550 121.559 121.566 纬度/(°) 29.866 29.882 29.883 29.892 环境参数 温度/℃ 18.01 18.61 17.97 18.01 pH 7.18 7.40 6.52 6.90 电导率/mS·cm-1 0.545 0.48 0.808 0.828 溶氧/mg·L-1 3.23 5.35 2.65 3.53 溶氧饱和度/% 34.20 58.20 28.50 37.60 多样性指数 序列数 59 949 45 398 54 955 55 202 OTU数量 3 851 3 177 4 463 3 043 Faith s PD指数 207 176 226 174 Chao1指数 10 665 9 017 13 984 6 671 Shannon指数 8.07 8.01 8.25 7.96 Gini指数 0.98 0.98 0.97 0.98

表 1 甬江、余姚江和奉化江站位的表层水体环境参数及原核生物多样性指数 Table 1 Environmental parameters and alpha-diversity index of prokaryotic community in the surface water of Yongjiang River, Yuyao River and Fenghua River

营养盐分析结果表明，采样站位的水体TN浓度范围为14.75~17.32 mg ·L^-1，其中溶解无机氮(dissolved inorganic nitrogen，DIN)约占总氮的54.10%±11.70%. 奉化江FH1站的DIN、 NH₄⁺-N和NO₃^--N浓度最高，分别为11.44、 3.28和7.87 mg ·L^-1； 而余姚江的DIN浓度最低，但其NH₄⁺-N浓度略高于甬江[图 2(a)]. 在甬江YJ1和YJ2站，NO₃^--N是水体DIN的主要形态(>85%). 采样站位的水体TP浓度范围为0.59~0.98 mg ·L^-1，其中奉化江FH1站最高，甬江YJ2站最低. SRP的浓度范围为0.11~0.20 mg ·L^-1，仅占TP的22.89%±8.04%[图 2(b)]. 与以往研究对比分析发现，甬江流域的水体营养盐浓度与包薇红等^[14]在甬江开展的营养盐监测数据相近^[14]，要略高于长江流域^[25]，稍低于与国内污染河流，如子牙河^[26]、 神定河^[27]、 北运河^[28]和九龙江^[19]的水体营养盐浓度.

图 2

Fig. 2

图 2 甬江流域表层水体的营养盐浓度 Fig. 2 Nutrient concentrations in surface waters of the Yongjiang River Watershed

Miseq高通量测序共获得215 504条高质量原核生物16S rRNA基因序列，奉化江FH1、 余姚江YY1、 甬江YJ1和YJ2站位分别获得59 949、 45 398、 54 955和55 202条序列. 为避免测序深度不一导致分析误差，每个样本随机挑取40 000条序列进行多样性指数计算和群落结构比较分析. 以97%序列相似度为OTU划分标准，共获得9 756个OTUs，每个样品平均获得(3 633±656)个OTUs. 多样性指数分析表明，甬江YJ1站的原核生物群落遗传多样性(Shannon指数)和丰富度(Chao1和Faith s PD指数)最高，而甬江YJ2站的原核生物群落多样性和丰富度最低(表 1). 由于与其他研究的测序深度不一致，因此难以比较不同河流原核生物群落的多样性及丰富度的差异. 然而，计算OTUs/Chao1指数比值发现，OTUs指数(获得OTU数)仅占Chao1指数(预测OTU数)的37.22%±5.88%(表 1)，说明甬江流域的原核生物群落多样性较高，本研究获得的海量序列数据依旧未完全揭示覆盖三江口水域分布的全部原核生物种群.

RDP Classifier分析表明，甬江水体原核生物群落由68个细菌门和3个古菌门构成(图 3). 细菌门类数目远超过九龙江及其他河流，这可能是由于16S rRNA基因Greengenes数据库大幅更新而导致的^[23]. 总体上，β-Proteobacterium、 Actinobacteria和Bacteroidetes是相对丰度最高的3个门(或纲)，分别占总序列的43.09%、 19.97%和15.82%(图 3). α-Proteobacterium、 浮霉菌门(Planctomycetes)、 γ-Proteobacterium、 Verrucomicrobia、 绿菌门(Chlorobi)和厚壁菌门(Firmicutes)是甬江流域原核生物群落的次优势类群，其相对丰度分别占总群落的4.87%、 4.10%、 3.47%、 1.96%、 1.55%、 1.33%和1.04%(图 3). 其他的细菌门及古菌门的相对丰度均低于1%.

图 3

Fig. 3

图 3 甬江流域水体原核生物群落组成 Fig. 3 Relative abundance of dominant bacterial groups in water samples obtained from the Yongjiang River Watershed

深入分析表明，甬江流域原核生物的群落组成与其水体环境特征是相对应的：β-Proteobacterium和Actinobacteria是典型的淡水细菌门，已有众多学者观测到这两个细菌门在不同淡水生境中有着较高丰度的分布^[8]. 此外，甬江水体中分布的高丰度Bacteroidetes则与一些河流^[29,30,31]、 湖泊^{[32, 33]}原核生物的研究报道也基本一致. 以往研究已证实，Bacteroidetes多倾向于附着生长^[8]，甬江水体中含有的大量泥沙或悬浮颗粒物可能为Bacteroidetes提供了良好的附着微环境. 虽然本研究在此并未测定甬江水体中的悬浮颗粒物含量，但相对较低的溶解态营养盐(DIN和SRP)比例(表 1)，现场采样时的实时观测，以及前人的研究工作^{[15, 16]}都间接反映了这一特征. 然而，Jackson等^[34]比较了Mississippi河浮游和颗粒附着细菌群落发现，浮游群落中的Bacteroidetes比例更高，因此对于Bacteroidetes在河流中原位分布状况还有待于进一步的研究. 对比4个站位的原核生物群落发现，β-Proteobacterium随着河流流向，其相对丰度逐渐减低，而奇古菌(Thaumarchaeota，在海洋中的丰度较高)的分布趋势则与其相反，沿河流流向(电导率升高)，其相对丰度逐渐增大(图 4)，这可能反映海水入侵导致了甬江流域水体原核群落组成的演替. 实际上，通过分析Thaumarchaeota不同类群的分布提供了更为充足的证据. 以往研究表明，Thaumarchaeota已分化为适应不同生境的类群，例如，Nitrosopumilus属(别名：Group 1.1a)和Nitrosophaera属(别名：Group 1.1b)分别主要分布于海水和土壤环境^[35]. 在甬江流域，Nitrosophaera属仅在奉化江FH1站有微量检出，而Nitrosopumilus属在高电导率(相对于FH1和YY1站位而言)甬江YJ1和YJ2站的相对丰度明显高于奉化江FH1和余姚江YY1站(图 4).

图 4

Fig. 4

图 4 甬江流域水体Thaumarchaeota和Crenarchaeota群落组成 Fig. 4 Relative abundance of Thaumarchaeota and Crenarchaeota in water samples obtained from the Yongjiang River Watershed

维恩分析表明，共有817个OTU在4个采样站位均有分布，仅占OTU总数的8.37%，但其所代表的序列可占总序列量的88.97%(图 5). 两两样品对比分析表明，两两站位之间共有OTU数约为1 304±96，约占总序列的46.00%±0.24%； 而任意3个站位之间的共有OTU数约为964±38，其代表序列约占总原核生物群落的67.53%±0.17%(图 5). 站位之间的稳定的共有OTU及共有序列数量(标准偏差波动较小)，说明奉化江FH1、 余姚江YY1、 甬江YJ1和YJ2站的原核生物群落之间的相似度较高.

图 5

Fig. 5

图 5 维恩分析展示奉化江、余姚江、甬江这4个站位原核生物群落的共有OTU数量 Fig. 5 Venn diagrams showing the number of OTUs shared among four sampling stations of the Yongjiang River Watershed

Weighted UniFrac显著性检验进一步证实了维恩分析的结果：仅甬江YJ1和YJ2站位的原核生物群落之间存在显著差异(P<0.001)，其他站位之间均无统计差异(P<0.1,表 2). 这与Jackson等^[34]的研究结果不太一致，他们发现Mississippi河的支流细菌群落与主干流的细菌群落组成显著不同. 此外，Portillo等^[29]分析了科罗拉多山脉Boulder Creek流域的支流细菌群落发现，不同站位的细菌群落组成差异较大. 而本课题组在九龙江西溪、 北溪开展研究的表明，两个支流的细菌生物群落结构之间存在统计差异(ANOSIM analysis,R=0.8,P<0.001)^[11]. 但对于本研究，由于采样站位之间的距离较近(约为0.89~3.15 km)，上游河流站位(FH1和YY1)的原核生物可能会在较短时间内被水流输送到下游站位(YJ1). 此外，由于甬江受不规则半日潮影响，涨潮带来的海水侵入会推动下游江水“逆流”，会促使上下游江水的混合，从而导致邻近站位FH1、 YY1和YJ1原核生物群落的同质化，但海水侵入也会导致河流原核生物群落的淡水特征逐渐向海水特征转换，这可能是甬江YJ1和YJ2站原核生物群落存在统计差异的重要因素之一，也印证了群落组成的分析结果. 然而，同样由于本研究选择的站位较为临近，因此可能并未完全解析奉化江、 余姚江和甬江各自的原核生物群落，因此进一步扩大采样区域，并开展季节研究，是揭示甬江流域原核生物群落时空分布特征的重要基础.

表 2(Table 2)

表 2 甬江流域4个站位原核生物群落结构的Weighted UniFrac显著性检验 Table 2 Weighted UniFrac significance test of prokaryotic community structure in the surface water of Yongjiang River, Yuyao River and Fenghua River FH1 YY1 YJ1 YJ2 FH1 — YY1 >0.5 — YJ1 >0.5 >0.1 — YJ2 >0.1 >0.1 <0.001 —

表 2 甬江流域4个站位原核生物群落结构的Weighted UniFrac显著性检验 Table 2 Weighted UniFrac significance test of prokaryotic community structure in the surface water of Yongjiang River, Yuyao River and Fenghua River

最近，美国威斯康星大学McLellan研究组通过比较分析人类、 动物肠道及污水细菌群落的宏基因组数据研究发现，不动杆菌属(Acinetobacter)、 弓杆菌属(Arcobacter)和束毛球菌属(Trichococcus)是污水细菌群落的核心类群，而拟杆菌科(Bacteroidaceae)、 紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、 梭菌科(Clostridiaceae)、 毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)在人类肠道微生物群落中稳定存在^{[36,37,38,39]}. 因此，它们可分别作为污水(sewer)和粪便(fecal)污染的指示菌群. 在甬江流域的4个站位，除Acinetobacter外，其他污染指示菌在各个站位均有检出，其中余姚江YY1站的污水和粪便指示菌相对丰度最高，分别占总原核生物群落的2.41%和2.77%； 奉化江FH1站的粪便指示菌的相对丰度次高，约为1.35%，但该站位污水指示菌的相对丰度最低(0.12%，图 6).

图 6

Fig. 6

图 6 甬江采样站位水体中分布的粪便和污水指示菌群 Fig. 6 Relativeabundance of sewer- and fecal-associated bacterial indicators in waters of Yongjiang River Watershed

McLellan研究组在美国密歇根湖的研究表明，污染水体的污水和粪便指示菌在总群落中的相对丰度一般高于2%^[39]. 而在甬江流域，仅余姚江YY1站的污水和粪便指示菌的相对比例略高于2%(图 6)，这远低于九龙江水体中分布的污染指示菌群^[11]，说明宁波城区甬江水体的受污水和粪便污染的风险程度较低，但余姚江水质状况需要进一步评估. 进一步通过定量PCR技术获得污染指示菌的绝对丰度数据，是进行该流域水体环境质量风险评估的重要基础之一.

为考察甬江流域潜在病原菌的分布状况，以本实验室已构建的病原菌16S rRNA基因数据库^[24]为查询数据库，对甬江Miseq高通量测序数据进行BLASTN同源性比对分析. 分析结果表明，甬江流域共有4 729和857条序列与病原菌数据库参考序列的相似度高于97%(种水平)和高于99%(亚种水平)，约占总序列的2.19%和0.40%(图 7). 奉化江FH1、 余姚江YY1、 甬江YJ1和YJ2站分别有1.92%、 2.44%、 2.42%和2.06%的序列可比对到种水平，而在亚种水平，这4个站位分别比对到0.24%、 0.39%、 0.58%和0.40%的序列.

总体上，甬江流域在种和亚种水平上分别检出76和18种潜在病原菌，主要隶属于7个门或纲，包括Actinobacteria、

图 7

Fig. 7

图 7 甬江流域水体中检测到的潜在病原菌(种水平)序列数量 Fig. 7 Reads number of potential pathogenic bacteria recovered in the sampling stations of the Yongjiang River Watershed

Bacteroidetes、 Firmicutes、 Fusobacteria、 α-、 β-、 ε-和γ-Proteobacterium(图 7). 在种水平，Mycobacterium fortuitum、 Delftia acidovorans、 Bordetella parapertussis、 Legionella pneumophila和Mycobacterium malmoense的丰度最高，分别检测到1 259、 696、 502、 461和456条序列(图 7). 在亚种水平上，Mycobacterium malmoense、 Aeromonas hydrophila、 Mycobacterium fortuitum、 Enterobacter aerogenes和Bacteroides fragilis是最丰富的5个种，与种水平不完全一致，分别检测到383、 284、 68、 43和28条序列. 这些潜在病原菌多属于第三类危害程度的病原微生物^[40].

与以往研究对比分析表明，甬江流域检测到的潜在病原菌种和亚种的种类均高于本课题组之前在九龙江的研究报道，且其潜在病原菌的序列总量和相对丰度也略高于九龙江样品^[24]. 此外，甬江流域检测到的潜在病原菌种类也与九龙江分布的潜在病原菌不完全一致，说明河流潜在病原菌的分布可能与当地的人类活动和气候环境有一定的联系. Ye等^[41]基于16S rRNA基因454焦磷酸测序技术分析了14个污水处理厂污泥细菌群落，发现约有1.30%的细菌16S rRNA基因序列与已知病原菌序列的相似度高于97%. 与此相似，Cai等^[42]分析了24个污水处理厂进水、 出水及污泥宏基因组数据的研究表明，约有1.0%~2.3%污泥和4.3%~7.6%进水、 出水样品的细菌16S rRNA基因序列可能隶属于潜在病原菌. 因此，甬江的潜在病原菌相对丰度与污泥中分布的潜在病原菌比例相当，但低于污水处理厂进水和出水. 虽然病原菌的致病性在很大程度上取决于其基因组中含有的毒力因子，基于16S rRNA而非毒力因子基因的病原菌可能并不能反映实际病原菌的分布，然而Cai等^[42]的研究结果表明，基于16S rRNA基因的分析与基于毒力基因的分析是基本吻合的，验证了这一分析的有效性.

(1)本研究采用16S rRNA基因-Illumina Miseq高通量测序技术，首次分析了甬江流域宁波三江口区域的水体原核生物群落，结果表明该流域原核生物群落的遗传多样性较高. β-Proteobacterium、 Actinobacteria和Bacteroidetes是该流域的主要优势类群. 其中β-Proteobacterium的相对丰度随着河流流向逐渐减低，而奇古菌，尤其是海洋Nitrosopumilus属在高电导率甬江站位的比例较高，说明潮汐带来的海水入侵可能影响了甬江流域的微生物群落组成.

(2)维恩分析表明，宁波三江口区域的水体原核生物群落相似度较高，共有817个OTU(代表 88.97%的序列)同分布于4个采样站位. UniFrac显著性检验分析的结果与维恩分析大体上相互印证.

(3)甬江流域分布有多种污水和粪便污染指示菌，其中余姚江受污染的风险较高. 与病原菌参考数据库对比分析表明，甬江流域分布有76和18种潜在病原菌种和亚种，约占总序列量的2.19%和0.40%. Mycobacterium fortuitum、 Delftia acidovorans、 Bordetella parapertussis、 Legionella pneumophila和Mycobacterium malmoense是种水平上最为丰富的5个潜在病原菌.

致谢： 感谢侯丽媛硕士在营养盐测定方面的帮助.