填埋气是垃圾填埋场运行的主要二次污染问题之一^[1]. 填埋气中不但含有温室气体CH₄，加剧“温室效应”；同时更含有大量的恶臭气体，严重干扰填埋场周边的居民的生活. 垃圾填埋场恶臭气体的有机组份大致包括烃类及芳香烃、 含硫化合物(如硫醇、 硫醚等)、 含氮化合物(如氨、 胺类、 吲哚等)、 卤素及衍生物(如卤代烃等)、 含氧有机物(如醇、 酚、 醛、 酮等)^{[2, 3, 4, 5, 6]}，其中具有“三致性”的苯系物浓度相对较高可达到1000~1500 μg ·m^-3，是最主要的恶臭贡献者之一^[3].

利用生物技术控制填埋气中有害成分气体的释放是最为经济、 有效的方式. 填埋气通过填埋场覆盖层向大气排放的过程中，覆土中的微生物可吸附-降解一部分气体. 根据报道和本课题组的前期研究：厌氧条件下，填埋覆土中的CH₄可通过与NO₃^-、 NO₂^-和SO₄^2-还原耦合进行厌氧氧化^{[7, 8, 9, 10, 11]}，从而有效削减CH₄排放；与此同时，有报道表明某些混合厌氧菌具有利用多种电子受体，如NO₃^-、 SO₄^2-、 Fe³⁺/Mn^{4+[12, 13, 14, 15, 16]}降解苯系物的功能. 鉴此，本研究探索了电子受体SO₄^2-共存条件下，NO₃^-和CH₄对填埋覆土中苯系物(以甲苯、 二甲苯和异丙苯为代表)厌氧氧化去除的影响及其相互作用，以期为填埋场同步控制CH₄和恶臭气体排放提供理论参考. 1 材料与方法 1.1 供试样品

本试验所用土样取自广州市某简易垃圾填埋场的最终覆盖层，属于黏土土质. 该垃圾填埋场主要收纳周边的居民垃圾以及少量的建筑垃圾，已封场12 a 以上，覆土厚度约为 1 m，表层植被密布(主要为杂草). 取样时随机选取5个采样点进行采样. 采样时，先将上层杂草拔除，采集0.5~1 m 处的覆土，将各个点采集的覆土混合均匀后装入带盖塑料桶中，然后运回试验室.

土样运回试验室后，样品放于阴凉通风处风干. 风干后，用四分法将样品缩分，其中一部分过60目筛用于测定样品理化性质(表 1)，另一部分置于干净塑料盆储存备用.

表 1(Table 1)

表 1 填埋覆土的理化性质 Table 1 Physico-chemical property of landfill cover soils used in the experiment 项目 pH 含水率/% TC/% NO3--N/mg ·kg-1 NO2--N/mg ·kg-1 NH4+-N/mg ·kg-1 SO42-/mg ·kg-1 测量值 8.50~8.59 11.80±0.03 15±0.08 14.70±0.23 0.30±0.01 34.21±1.59 590.46±3.75

表 1 填埋覆土的理化性质 Table 1 Physico-chemical property of landfill cover soils used in the experiment

1.2 试验设计

本研究设置两组试验，一组为灭菌试验，一组为无灭菌试验；每组试验中设置8组处理，每组处理设3个平行. 灭菌试验主要是观察土壤对苯系物的吸附. 不同处理中添加的CH₄的体积分数约为14%，NO₃^--N含量为110 mg ·kg^-1. 具体处理条件见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 各处理因素及水平 1) Table 2 Factors and levels in the experiment 项目 无灭菌处理 灭菌处理 NO3--N/mg ·kg-1 CH4 /% 甲苯/μg ·m-3 二甲苯/μg ·m-3 异丙苯/μg ·m-3 NO3--N/mg ·kg-1 CH4/% 甲苯/μg ·m-3 二甲苯/μg ·m-3 异丙苯/μg ·m-3 空白 / / / / / / / / / / FA / 14 / / / / 13.5 / / / FB 110 / / / / 110 / / / / FAB 110 14 / / / 110 13.5 / / / FC / / 2500 2200 2500 / / 2000 1400 1400 FAC / 14 2500 2200 2500 / 13.5 2000 1400 1400 FBC 110 / 2500 2200 2500 110 / 2000 1400 1400 FABC 110 14 2500 2200 2500 110 13.5 2000 1400 1400 1)F表示覆土；A表示CH4；B表示NO3--N；C表示苯系物(甲苯、 二甲苯、 异丙苯)；下同

表 2 各处理因素及水平 1) Table 2 Factors and levels in the experiment

具体操作步骤为：首先，取10.0 g覆土土样于50 mL厌氧瓶中，加入2.5 mL KNO₃溶液或去离子水使其含水率维持在25%左右，且处理组中土壤NO₃^--N含量约为110 mg ·kg^-1；其次，通过反复抽真空-充纯氩气过程置换瓶中空气后，立即用异丁基橡胶塞密封并平衡气压后检测瓶中氧气含量，确保瓶内保持厌氧/兼氧状态；灭菌处理方法：先称取10.0 g覆土土样于厌氧瓶内，用异丁基橡胶塞密封，并在每个橡胶塞上插一个注射器针头，以防厌氧瓶在灭菌过程中爆炸；然后放入灭菌锅内灭菌6 h以上. 灭菌完成后，其余操作同未灭菌处理. 然后，根据设定的CH₄体积分数和苯系物的浓度，用注射器抽出一定量的氩气后，注入相应量的纯CH₄和(或)苯系物混合标准气体，使得瓶内CH₄体积分数为14%；甲苯、 二甲苯和异丙苯含量分别为2500、 2200和2500 μg ·m^-3左右；最后，将处理好的样品置于30℃恒温箱中培养，分别在1、 2、 6、 10、 17、 24、 31、 38 d抽取1 mL气体，测定CH₄、 N₂、 CO₂、 N₂O、 甲苯、 二甲苯、 异丙苯的含量. 培养结束后，分析土壤样品中NO₃^--N、 NO₂^--N、 NH₄⁺-N、 SO₄^2-等离子含量. 1.3 测定指标及方法

土样中NO₃^--N、 NO₂^--N、 SO₄^2-测定方法：称取2.5000 g土样用10 mL蒸馏水提取1 h后在4000 r ·min^-1下离心5 min后采用离子色谱法(DIONEX ICS 2500,IonPac As15 2 mm× 250 mm)；NH₄⁺-N测定方法：称取2.5000 g土样用20 mL 2 mol ·L^-1的KCl溶液提取1 h后采用纳氏试剂分光光度法；TOC采用重铬酸钾-外加热法；同时测定土壤含水率.

CO₂、 N₂、 CH₄、 N₂O体积分数采用浙江福立仪器有限公司生产的GC9790型气象色谱仪(TCD+双填充柱进样系统)测定，载气为99.999%氩气，进样口、 色谱柱和检测器温度分别为50 、 50 和85℃. 甲苯、 二甲苯、 异丙苯含量采用GC9790Ⅱ型色谱仪(FID检测器)测定，载气为99.999%氮气，进样口、 色谱柱温和检测器温度分别为50、 200和220℃. 文中数据统计采用SPSS 20.0 for Windows软件，数据作图采用Origin version 8.0软件.

2 结果与分析 2.1 各处理样品中CH₄,N₂ ,CO₂和N₂O变化

图 1为不同处理下各气体含量随时间的变化.

整个试验过程中N₂O含量均在检出限以下(无数据显示). 由图 1(a)、 1(b)、 1(c)可知，经过灭菌处理的土样，前17 d N₂,CO₂含量非常低，24 d后略有增加，而CH₄含量前期略有降低，后期趋于稳定，说明灭菌后的土壤微生物活动非常少，且土壤能吸附少量的CH₄,4组处理CH₄吸附量在0.5%~0.6%之间，FA和FABC吸附量略大，而FAB和FAC略低. 图 1(A)、 1(B)、 1(C)表明未灭菌的各土样中CH₄含量随时间延长明显降低，而N₂和CO₂含量明显升高；不同处理间CH₄下降量为FA≈FABC>FAB>FAC，分别约为2.0%、 1.9%、 1.8%和1.3%. 可见不外加NO₃^-时，苯系物抑制CH₄的降解，加入NO₃^-后，苯系物共存反而有利于CH₄的去除；N₂产生量FBC处理最多，FAC、 FAB处理中N₂含量较低，说明苯系物能促进能促进N₂的产生，而CH₄共存不利于NO₃^-直接转化为N₂；各处理中CO₂含量差别不大，都在2%左右. 对比灭菌和不灭菌土样中各气体的变化可知，土样中CH₄减少，N₂和CO₂增加主要是由于土壤中的微生物活动所致，CH₄先被土壤吸附，然后被土壤中微生物的微生物利用，转化.

图 1

Fig. 1

图 1 不同处理下CH4,N2,CO2含量随时间变化 Fig. 1 Changes of CH4,N2 and CO2 contents over time

2.2 各处理样品中苯系物含量变化

图 2为不同处理土样中甲苯、 二甲苯和异丙苯含量随时间的变化.

图 2

Fig. 2

图 2 不同处理样品顶空中苯系物浓度随时间变化 Fig. 2 Changes of toluene,xylene,isopropyl benzene concentrations in the headspace of different samples over time

由图 2可知，灭菌土壤中的苯系物浓度培养后迅速降低，略有波动后逐渐趋向稳定，说明土壤对苯系物的吸附也是一个动态平衡过程. 在未灭菌的土样中，3种苯系物浓度均呈随培养时间先快后慢持续下降的趋势；而且，各处理中甲苯浓度在培养20 d后出现一个短暂的先增后减过程，可见土壤中同时进行着吸附和生物降解过程，甲苯浓度的增加可能是由于二甲苯和异丙苯在微生物的作用下降解生成甲苯产物所致. 培养结束时不同处理中甲苯去除率分别为：FC，53.0%；FAC，57.0%；FBC，55.0%，FABC，为65.0%；二甲苯去除率分别为：

FC，76.0%；FAC，83.0%；FBC，83.0%；FABC，88.0%；异丙苯去除率分别为：FC，31.0%；FAC，63.0%；FBC，67.0%，FABC，82.0%. 以FAC和FABC两组处理甲烷下降量和4组处理中以不同处理为因素，对甲苯、二甲苯异丙苯降解率进行单因素方差分析，结果表明各组处理两两之间均有显著性差异(P<0.05). 可见，单独添加CH₄和NO₃^-均有利于苯系物的去除，同时添加CH₄和NO₃^-能更好地促进苯系物(尤其是二甲苯和异丙苯)的去除. 结合灭菌处理中CH₄及苯系物的吸附情况可知，CH₄和NO₃^-对苯系物去除的促进主要是生物作用，它们可促进苯系物的厌氧降解. 本试验中各苯系物的降解效率为二甲苯>异丙苯>甲苯，与邓栋等^[12]报道的苯系物厌氧条件下降解的难易顺序“二甲苯>甲苯”的结果也基本吻合. 2.3 不同处理土样中各离子含量变化

试验结束后开瓶取土样进行NO₃^--N、 NO₂^--N、 NH₄⁺-N和SO₄^2-测定，各离子的变化结果见图 3.

图 3

Fig. 3

a、 b、 c、 d表示各离子含量/消耗量在a=0.05水平上差异显著 图 3 不同处理下各离子含量/消耗量变化 Fig. 3 Changes of ion contents/consumption during incubation in different treatments

由图 3可知，未灭菌试验中不同处理组各离子含量及消耗量发生了明显的变化，而灭菌后不同处理土样间的离子仅略有差异. 结合试验后期灭菌处理样品有少量CO₂和N₂产生的情况，分析可能是由于后期一些未完全灭活的微生物芽孢萌发导致试验后期有少量微生物活动所致.

进一步对为灭菌处理样品中的离子消耗量/含量进行方差分析的结果表明，处理后样品各离子含量/消耗量与原始土样存在显著差异. 添加CH₄的4组处理的NO₃^-消耗量为FAB>FABC>FA≈FAC；NO₂^--N含量为FABC>FAB>FA≈FAC，相较于空白，FABC和FAB的NO₂^-含量增加，FA和FAC的NO₂^-含量略有减少；NH₄⁺-N含量为FAC>FAB>FABC>FA，与空白相比均有所降低；SO₄^2-消耗量为FABC>FAB≈FA>FAC. 结合培养过程CH₄降低量为FA≈FABC>FAB>FAC的情况. 可知，苯系物与CH₄共存时，加入NO₃^-明显有助于CH₄的去除，而且此过程中NO₃^-和SO₄^2-的消耗量明显增加；不外加NO₃^-时，加入苯系物明显抑制了CH₄的降解；加入NO₃^-后，苯系物反而有利于CH₄的去除；结合离子和N₂数据可知，添加苯系物虽未增加NO₃^-的消耗，但有助于土壤中的N转化为N₂；而且，NO₃^-共存时，添加苯系物明显促进了SO₄^2-还原.

添加苯系物的4组处理中，NO₃^-消耗量顺序为FABC>FBC≈FAC≈FC；NO₂^--N含量为FABC>FBC>FC≈FAC；NH₄⁺-N含量为FC>FAC>FABC>FBC，FC高于空白，FAC等于空白，而FABC和FBC低于空白；SO₄^2-消耗量为FABC>FC>FBC>FAC；苯系物中甲苯、 二甲苯和异丙苯降解大小顺序为FABC>FBC≈FAC>FC. 可见，不外加NO₃^-时，CH₄促进苯系物去除过程中并未伴随着NO₃^-和SO₄^2-同步消耗；而外加NO₃^-时，CH₄促进苯系物去除中过程伴随更多NO₃^-和SO₄^2-的同步消耗，说明高、 低两种NO₃^-浓度下，CH₄促进苯系物去除的机制不同. 高浓度NO₃^-共存时，SO₄^2-和NO₃^-可能作为电子受体参与了苯系物的氧化过程. 当体系中不存在CH₄时，加入NO₃^-促进了苯系物去除，但此过程未增加NO₃^-或SO₄^2-消耗量，但体系中NO₂^--N含量增加，且更多NH₄⁺-N被去除，N₂产量增加；而当CH₄共存时，添加NO₃^-促进苯系物去除的同时NO₃^-和SO₄^2-还原量增加.

添加NO₃^-的4组处理中，NO₃^-消耗量为FAB>FABC≈FB>FBC；NO₂^--N含量为FABC>FAB>FBC>FB；NH₄⁺-N残留含量为FAB>FB≈FABC>FBC，均低于空白对照；SO₄^2-消耗量为FABC≈FB>FAB≈FBC. 高浓度NO₃^-存在时，不是苯系物而是CH₄的存在明显促进NO₃^-还原，但苯系物的存在明显促进了SO₄^2-的消耗，可见SO₄^2-还原与苯系物氧化关系更密切. 但是，外加NO₃^-且CH₄共存时，苯系物去除量增加的过程中伴随着NO₂^--N含量增加，且部分NH₄⁺-N同时去除，N₂产生量增加，有利于离子态氮的无害化转化.

3 讨论

苯系物和CH₄在覆土中的去除都遵循吸附-降解模式. 单独添加NO₃^-或CH₄都能促进覆土中苯系物的去除；同时添加NO₃^-和CH₄对覆土中苯系物的去除有更好的促进作用. 而且，CH₄和NO₃^-主要通过促进苯系物的厌氧降解，从而加速苯系物的去除. 当不外加NO₃^-时，苯系物明显抑制CH₄的去除，这可能可能是由于苯系物对CH₄代谢微生物的毒性所致苯. 然而，外加CH₄却能促进苯系物降解，但此过程中并未伴随SO₄^2-或NO₃^-的同步还原，说明CH₄对苯系物的协同代谢存在多种途径. 当外加NO₃^-使土壤中维持较高的NO₃^-浓度时，苯系物不是抑制，而是促进CH₄去除；而CH₄促进苯系物去除过程中伴随更多NO₃^-和SO₄^2-还原，说明NO₃^-是驱动CH₄和苯系物共同降解的重要媒介，且SO₄^2-还原也与NO₃^-还原，CH₄及苯系物的降解密切相关.

NO₃^-在CH₄共存或不共存的情况下均能促进苯系物的降解，但两者机制可能不同. 当不添加CH₄,NO₃^-促进苯系物去除时并未导致NO₃^-或SO₄^2-还原量增加，但是体系中NO₂^-含量明显增加，而且该过程有利于NH₄⁺-N去除和N₂形成；而当CH₄共存时，NO₃^-添加促进苯系物去除的同时NO₃^-和SO₄^2-还原量增加，说明只有NO₃^-和CH₄共同作用时，苯系物的降解才能与NO₃^-和SO₄^2-耦合，CH₄也是驱动苯系物协同降解必不可少的媒介. 文献^{[13, 17]}在NO₃^-还原条件下对苯降解的微生物特性研究结果表明，与苯的厌氧降解较为相关的过程是NO₃^-还原为NO₂^-，而不是NO₂^-进一步还原为N₂的过程. 因此，可以推测单独添加NO₃^-可能为苯系物的降解提供电子受体，促进其降解，且产物NO₂^-可能通过厌氧氧化转化成N₂；而CH₄共存时，更多的NO₃^-作为电子受体被还原低价态，但并未完全转化为N₂.

此外，高浓度NO₃^-存在时，不是苯系物而是CH₄的存在明显促进NO₃^-还原，但苯系物的存在明显促进了SO₄^2-的消耗. SO₄^2-能为苯系物氧化提供电子受体^[18,19]，未添加NO₃^-的处理FAC和FC均有较高的SO₄^2-还原量表明土壤中共存的高浓度SO₄^2-被利用为电子受体. 从电子受体还原产生的能量的角度，一般认为NO₃^-的利用优先于SO^{2-[20]₄，而根据本课题组前期的研究和文献报道[21]，厌氧条件下，一些自养反硝化细菌能利用NO₃-氧化SO₄2-还原的产物S2-/S0，NO₃-和SO₄2-还原之间能相互促进. 据此推测NO₃-在耦合状态下对苯系物降解的促进作用很可能是通过促进SO₄2-还原，从而间接驱动苯系物降解.}

不外加NO₃^-时，CH₄促进苯系物去除过程中并未伴随着NO₃^-和SO₄^2-同步消耗；而外加NO₃^-时，CH₄促进苯系物去除中过程伴随更多NO₃^-和SO₄^2-的同步消耗，这可能是由于高、 低两种NO₃^-浓度下，CH₄促进苯系物去除的机制不同. 本课题组前期的试验结果表明在厌氧条件下，甲烷氧化能与硝酸盐还原和硫酸盐还原发生耦合反应(DAOM和SAOM)，而这两个过程对于甲烷去除的贡献程度取决于NO₃^--N与SO₄^2-的浓度比. Xu等^[22,23]研究报道硝酸盐和硫酸盐可以在高浓度有机物质存在的情况下两者之间可以相互促进，发生共同的还原作用. 也有研究表明，在CH₄/苯系物单独或共同存在的情况下，经过一段时间的培养后，微生物群落是不相同的^[24]. 因此在高、 低两种NO₃^-浓度下，CH₄协同代谢苯系物去除的机制有可能不同. 在高NO₃^-浓度下，NO₃^-起主要作用，可能与厌氧甲烷氧化发生耦合反应通过内好养途径生成氧原子^[8,25]，从而氧化苯系物；在低NO₃^-浓度下，SO₄^2-起主要作用，细菌ANME-2氧化甲烷的同时将硫酸盐还原为零价硫(S⁰)^[21]，从而降解苯系物.

总之，CH₄和苯系物共存时，二者能同时利用NO₃^-、 SO₄^2-作为电子受体发生氧化反应，从理论上来说，苯系物应较容易反应. NO₃^-、 SO₄^2-的存在，主要可能是作为电子受体促进苯系物厌氧降解，或者通过耦合CH₄厌氧氧化，协同代谢苯系物；至于单独添加CH₄促进苯系物降解原因还需要进一步的研究.

4 结论

覆土对苯系物的去除是先吸附后降解；单独添加NO₃^-或CH₄都能促进填埋覆土中苯系物的降解. 同时添加NO₃^-和CH₄能更好地促进苯系物的去除，且不降低CH₄去除率；甲苯、 二甲苯和异丙苯的去除率最高可达65%、 88% 和82%，远高于不添加NO₃^-和CH₄对照处理的53%、 76%和31%. NO₃^-和CH₄对苯系物降解的共同作用很可能是NO₃^-还原耦合CH₄厌氧氧化过程中促进了SO₄^2-还原，从而间接驱动了苯系物降解.