近年来，由于抗生素在临床上的不规范使用以及在养殖业中的滥用，大量的抗生素随生活污水和养殖废水进入环境，在地表水中已经很难找到检测不到抗生素的区域^{[1, 2, 3]}. 抗生素残留对水环境的潜在风险越来越受到关注^{[4, 5, 6, 7]}. 除了抗生素类药物自身产生的化学污染以外，抗生素的使用还会加速抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)和耐药菌(antibiotic-resistant bacteria,ARB)的产生，导致临床和环境中微生物耐药水平不断上升，对人类健康和环境产生潜在的风险^[8].

人工湿地( constructed wetland,CW) 是20世纪70年代发展起来的一种新型废水处理技术，具有工艺简单、 经济高效等特点，已被广泛应用于环境修复和城镇生活污水、 养殖废水的处理^{[9, 10, 11, 12]}. 人工湿地主要依靠基质生物膜上丰富的微生物群落来降解有机物和去除污染物，同时基质生物膜也为污水中耐药基因的传播提供适宜的场所，有研究表明人工湿地中存在着一定水平的耐药菌和耐药基因^[13,14]. 整合子是一种基因重组表达系统，在整合酶的作用下，整合子能捕获、 整合及表达耐药基因，此外，整合子可以随着质粒转座子在不同的菌株间转移，导致ARGs在微生物之间传播和扩散.

目前，对环境细菌耐药性的研究主要集中在养殖废水、 污水处理厂以及河流水体等环境，其研究对象大多局限于人源或动物源的肠道菌和临床上常见的致病菌^{[15, 16, 17]}；而对于人工湿地中微生物耐药特征的研究尚不多，已有的研究也仅针对大肠杆菌、 肠球菌、 异氧菌等微生物^{[13, 18, 19]}. 对于在环境分布广泛且适应性强的土著菌的耐药特征则几乎没有研究. 葡萄球菌(Staphylococcus)、 假单胞菌(Pseudomonas)广泛分布于土壤、 淡水、 海水等环境中，专性需氧或兼氧，多数为非致病环境土著菌，少数为临床上的致病菌，并携带耐药性. 本研究选取不同构型人工湿地中葡萄球菌和假单胞菌为对象，考察人工湿地环境土著菌的耐药特征及其基质中整合酶基因的丰度，揭示人工湿地中土著耐药菌和耐药基因转移元件在人工湿地中的分布规律和影响因素，以期为评估人工湿地中耐药菌和耐药基因的环境风险提供依据，并为制定有效的ARGs环境污染控制方法提供理论基础.

1 材料与方法 1.1 模拟人工湿地概况

试验装置为9个独立的不同构型模拟人工湿地(构造如图 1 所示)，湿地床体为铸铁材质的方箱，规格为80 cm×60 cm×80 cm(长×宽×高)，填充粒径10 mm左右的砾石(孔隙率ε为0.4~0.5 )作为基质，湿地进水为校园生活污水(污水的理化参数见表 1)，污水经粗、 细格栅过滤后通过潜水泵进入各装置，流量为10L ·h^-1，水力负荷为0.25 m ·d^-1，运行时间为07:00~19:00.

图 1

Fig. 1

DVF为下行垂直流; SF为表面流; HF为水平潜流; 下同 图 1 9个人工湿地构造示意 Fig. 1 Schematic diagram of nine constructed wetlands

表 1(Table 1)

表 1 人工湿地进水的理化参数 (n=3) Table 1 Physical and chemical parameters of influent wastewater in constructed wetlands (n=3) 季节 温度/℃ pH DO/mg ·L-1 COD/mg ·L-1 SS/mg ·L-1 NH+4-N/mg ·L-1 TP/mg ·L-1 夏季 27.8±2.1 7.1±0.1 0.8±0.5 127.3±1.9 47.8±22.5 24.0±1.6 3.2±0.6 冬季 17.0±1.4 7.0±0.1 0.5±0.1 134.2±3.5 57.1±20.2 27.5±2.0 2.7±0.4

表 1 人工湿地进水的理化参数 (n=3) Table 1 Physical and chemical parameters of influent wastewater in constructed wetlands (n=3)

模拟人工湿地包括3种工艺类型：CW1~CW3 为下行垂直流(DVF)、 CW4~CW6为表面流(SF)、 CW7~CW9 为水平潜流(HF). DVF和HF的砾石基质填充高度为60 cm，水位为55 cm；SF基质填充高度为30 cm,水位为55 cm. DVF污水从基质表面的多孔布水管均匀分布在床体的整个表面上，随后污水垂直向下流过基质层，由底部出水口流出；SF污水由位于床体侧边的进水口流入，水平流过床体，再从位于另一侧的出水口流出；HF的构造与SF相同，差别为HF填满了基质. 湿地装置栽种了两种常见湿地植物(美人蕉Canna indica 和再力花Thalia dealbata.)，初始种植密度约16 株 ·m^-2，到装置运行3 a后采样，植物已达到100%覆盖. 1.2 样品采集

在模拟人工湿地装置正常运行3 a后，于 2014 年1 月中旬(冬季)和8月中旬(夏季)采样，分别在9个湿地各采集表(5 cm)、 中(20 cm)和底(40 cm)层基质共约100 g，放于无菌封口袋内，于4℃冷藏保存，24 h内完成实验. 1.3 细菌的分离纯化和耐药性检测

称取100 g的基质样品，加入到装有100 mL无菌生理盐水和数颗灭菌玻璃研磨珠的无菌聚乙烯瓶中，置于220 转 ·min^-1的摇床上摇匀30 min制成基质悬液，经适当稀释后分别涂布于葡萄球菌选择性培养基Baird-Parker琼脂和假单胞菌选择性培养基十六烷三甲基溴化铵琼脂(海博生物)平板上，37℃培养24 h. 葡萄球菌为具有沉淀环的黑色菌落，假单胞菌为黄色或绿色菌落，分别挑取两种特征菌落，用相应的选择性培养基进一步纯化后进行抗生素耐药性检测.

细菌的药敏性测试采用CLSI 2009药敏标准推荐的Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法. 所选用的抗生素纸片(缩写及含量)为：氨苄西林(AMP 10 μg)，四环素(TE 30 μg)，氯霉素(C 30 μg)，庆大霉素( CN 10 μg)，环丙沙星(CIP 5 μg)，头孢他啶(CAZ 30 μg)和复方新诺明(SXT 25 μg). 用E.coil ATCC25922作为质控菌.

用耐药率表示不同采样点大肠杆菌对某种抗生素的耐药水平. 耐药率的计算公式为 : A/B×100%，式中， A 为对抗生素耐药的菌数，B 为采样点中分离的细菌总数. 多重耐药指数(MRI)常用于评估环境中细菌的多重耐药特征和抗生素污染水平^[20]，其计算公式为：MRI=a/(b×c)，式中，a 代表采样点分离细菌的总抗生素耐药值，b 代表检测的抗生素种类数目，c 代表采样点分离的目标细菌菌株数. 01.4 基质生物膜上 int1 和16S rRNA的荧光定量PCR检测

基质总DNA提取：用孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜过滤50 mL基质洗脱悬浊液得到基质沉淀^[12]，沉淀用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒(MoBio,USA)提取基质的细菌总DNA，提取的DNA样品经电泳和吸光值测定检测其浓度和纯度后-20℃ 保存备用.

荧光定量检测的目标基因是湿地基质中的整合子 int1 基因，并以16S rRNA基因作为参比基因，所用引物见表 2，方法参照文献^[6]. 首先分别从 int1 阳性菌株和大肠杆菌(E.coli ATCC25922)克隆出 int1 、 16S rRNA基因，PCR产物经纯化后，将获得的 int1 和16S rRNA基因片段根据pTA2-vecto试剂盒操作说明书(TOYOBO,Japan)利用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行克隆. 克隆成功后，利用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit试剂盒(AXYGEN,USA)提取目标基因的重组质粒，纯化后测定260 nm吸光值得到质粒浓度，根据重组质粒片段大小计算出目标基因的拷贝数，经10倍稀释成一系列目标基因梯度标准品，用于目标基因QPCR测定标准曲线的构建. QPCR测定 int1 的标准曲线方程为:y=-3.643x+39.018(R2=99.8，扩增效率88.1% )，16S rRNA QPCR测定的标准曲线方程为y=-3.486x+38.403(R2=99.9,扩增效率93.6%)，产物溶解曲线均为单一峰，无非特异性扩增.

利用提取的总DNA作为荧光定量检测的DNA模板，通过检测到的循环数，对照标准曲线，得到样品中目标基因的丰度. 荧光定量检测在Bio-Rad CFX96实时荧光定量仪运行(Bio-Rad,USA)，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ染料法荧光定量试剂盒，反应体系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，正反引物(10 mmol ·L^-1)各1 μL，DNA模板2 μL，补足ddH₂O至25 μL. PCR程序：①94℃预变性30 s；②94℃变性15 s，退火20 s(退火温度见表 2)，72℃延伸45 s，40个循环；③溶解曲线检测. 每个样品设置3个平行. 用 int1 /16S rRNA比值表示样品中 int1 的相对丰度，来矫正不同样品DNA提取效率的差异.

表 2(Table 2)

表 2 本试验所用引物 1) Table 2 Primers used in this study 靶基因 引物 基因序列(5′-3′) 扩增长度/bp 退火温度/℃ 文献 int 1 Int1-F ACGAGCGCAAGGTTTCGGT 565 52 [21] Int1-R GAAAGGTCTGGTCATACATG 16S rRNA 341-F CATTTGTGTTGTGGACGGC 193 60 [22] 434-R GACAGATACGTGTTTGGCAA 1)F：正向引物；R：反向引物

表 2 本试验所用引物 1) Table 2 Primers used in this study

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据整理统计，利用T检验比较分析不同基质采样点的耐药水平、 多重耐药指数MRI和整合子丰度的差异性，并借助单因素方差分析检验季节和人工湿地设计因素对耐药率、 多重耐药指数(MRI )和整合子丰度的影响. 结果用Origin 8.5软件绘制图表. 2 结果与分析 2.1 不同季节细菌对7种抗生素的耐药率分析

从9个不同构型人工湿地基质中共分离到葡萄球菌522株(夏季263株，冬季259株)，假单胞菌543株(夏季217株，冬季326株)，其对7种测试抗生素的耐药水平如表 3所示.

表 3(Table 3)

表 3 人工湿地夏冬季基质生物膜上土著菌的耐药水平 1) Table 3 Antibiotic-resistant level of bacteria isolated from biofilms on matrix of constructed wetlands in summer and winter 季节 采样点 2种土著菌对7种抗生素的耐药率/% MRI AMP TE C CN CIP CAZ SXT SA PA SA PA SA PA SA PA SA PA SA PA SA PA CW1 62 92 0 4 4 45 6 17 0 0 92 0 72 63 0.34 0.32 CW2 55 100 2 0 0 83 0 0 0 0 90 4 76 90 0.32 0.40 CW3 55 100 2 5 0 75 5 5 2 5 90 5 72 73 0.32 0.38 CW4 41 100 5 0 5 100 5 0 0 0 91 0 82 0 0.32 0.29 夏季 CW5 62 100 5 0 0 88 5 0 0 0 14 0 10 8 0.14 0.28 CW6 82 70 5 0 5 17 9 4 0 0 95 0 82 22 0.40 0.16 CW7 23 96 14 4 9 63 0 0 0 4 68 0 59 63 0.25 0.33 CW8 35 100 10 0 0 84 0 0 0 0 80 0 65 88 0.27 0.39 CW9 17 100 0 0 0 24 4 0 0 0 70 0 61 24 0.22 0.21 平均 50 96 4 2 2 65 4 4 0.3 1 80 1 66 55 0.29 0.32 CW1 3 98 0 8 35 2 0 0 0 0 43 0 49 52 0.19 0.23 CW2 18 100 0 4 39 6 0 0 0 2 58 2 54 54 0.24 0.24 CW3 40 92 0 10 10 9 0 2 3 0 77 7 30 81 0.23 0.29 CW4 0 77 0 0 4 9 0 0 0 0 4 0 0 45 0.01 0.19 冬季 CW5 30 35 0 0 15 0 0 4 0 4 50 0 50 12 0.21 0.08 CW6 0 55 0 5 36 0 0 0 0 0 0 0 14 27 0.07 0.12 CW7 5 96 5 0 9 0 5 0 0 0 59 4 59 89 0.20 0.27 CW8 13 84 0 0 10 0 0 0 0 6 45 6 13 22 0.12 0.17 CW9 14 93 0 4 0 7 0 0 0 4 29 4 5 21 0.07 0.19 平均 15** 85** 0.4* 4 20** 4** 0.4 0.6 0.4 1 45** 3 34** 49 0.16** 0.21* 1)CW1~CW9：1~9号模拟人工湿地基质生物膜；MRI：多重耐药性指数 SA：葡萄球菌属，PA：假单胞菌属；*表示P<0.05,**表示P<0.01，下同

表 3 人工湿地夏冬季基质生物膜上土著菌的耐药水平 1) Table 3 Antibiotic-resistant level of bacteria isolated from biofilms on matrix of constructed wetlands in summer and winter

在测试的7种抗生素中，葡萄球菌主要对AMP、 CAZ、 SXT表现出较高的耐药水平，其耐药率分别为33%、 64%、 50%；而假单胞杆菌主要对AMP、 C、 SXT表现出较高的耐药水平，其耐药率分别为90%、 27%、 51%. 而对于 TE、 CN和CIP 3种抗生素，两种土著菌的耐药率都极低(<3%)，甚至部分装置中没有分离到其耐药菌.

两种土著菌对AMP、 C、 CAZ的耐药则表现出明显的差异，在夏冬两季，假单胞菌对AMP的耐药率均显著高于葡萄球菌(P<0.05)，而对CAZ的耐药率则低于葡萄球菌(P<0.05). 对于C，则是冬季葡萄球菌耐药率高于假单胞菌，而夏季结果相反，葡萄球菌耐药率低于假单胞菌(P<0.05).

总体上，人工湿地中土著菌的耐药性夏季高于冬季. 具体表现为：葡萄球菌的AMP、 TE、 CAZ、 SXT耐药率夏季显著或极显著高于冬季(P<0.05)，假单胞菌AMP和C的耐药率夏季极显著高于冬季(P<0.01). 两种土著菌的多重耐药指数均表现出夏季显著或极显著高于冬季(P<0.05). 但葡萄球菌对C的耐药率相反，冬季极显著高于夏季(P<0.01).

2.2 不同构型人工湿地细菌对7种抗生素的耐药率分析

从表 3中发现，两种土著菌对AMP和SXT均表现出较高的耐药水平，利用LSD多重比较分析人工湿地工艺和植被对其耐药率的影响(图 2、 图 3)，结果发现，工艺类型对细菌的AMP和SXT的耐药率有明显影响，而植物的影响不显著.

图 2

Fig. 2

小写字母a、 b代表差异显著,下同 图 2 3种工艺中对AMP耐药率的影响 Fig. 2 Effect of three types of CW constriction on AMP resistance rate

图 3

Fig. 3

图 3 3种工艺中对SXT耐药率的影响 Fig. 3 Effect of three types of CW construction on SXT resistance rate

不同工艺对两种土著菌的AMP耐药率影响如图 2所示，在夏季，葡萄球菌对AMP的耐药率在水平潜流显著低于下行垂直流和表面流(P<0.05)，而下行垂直流和表面流两种工艺之间差异不显著(P >0.05)；在冬季，葡萄球菌对AMP的耐药率在下行垂直流显著高于表面流和水平潜流(P<0.05)，而表面流和水平潜流之间没有显著差异(P >0.05). 对于假单胞菌，在夏季，假单胞菌对AMP的耐药率表现为：下行垂直流>水平潜流>表面流，但差异不显著(P >0.05)；在冬季，假单胞菌对AMP的耐药率表现为下行垂直流和水平潜流显著高于表面流(P<0.05).

不同工艺对SXT的耐药率从图 3可知，在夏冬两季，葡萄球菌对SXT的耐药率在不同工艺之间均表现为：下行垂直流>水平潜流>表面流，但差异不显著；假单胞菌对SXT的耐药率也表现出相同的趋势，但夏季表面流湿地中假单胞菌对SXT耐药率显著低于其他两种工艺(P<0.05).

工艺类型对两种土著菌MRI指数的影响如图 4，夏季时葡萄球菌的MRI指数在下行垂直流最高，其次是表面流，水平潜流最低，不同工艺之间差异不显著；冬季时则表现为下行垂直流>水平潜流>表面流. 而假单胞菌在夏冬两季皆表现为下行垂直流>水平潜流>表面流，冬季表面流显著低于下行流湿地(P<0.05).

图 4

Fig. 4

图 4 3种工艺对MRI指数的影响 Fig. 4 Effect of three types of CW construction on MRI index

在检测到有耐药性的410株耐药葡萄球菌中，有283株表现出对2种或2种以上抗生素耐药；481株耐药假单胞菌中，有327株表现出对2种或2种以上抗生素耐药，两种土著菌的多重耐药率达到68%以上，多重耐药情况如图 5所示.

图 5

Fig. 5

图 5 细菌多重耐药的组成 Fig. 5 Composition profile of multi-antibiotic resistance among resistant isolates

葡萄球菌在冬季主要表现为对1种、 2种和3种抗生素耐药，其比例分别为：46%、 36%和18%，以对1种和2种抗生素耐药的菌株为主；而在夏季，对3种抗生素耐药的比例上升到40%，以对2种和3种抗生素耐药的菌株为主，并出现对4种抗生素耐药的菌株. 对于假单胞菌，在冬季主要对1种(40%)和2种(54%)抗生素具有耐药性，少数对3种抗生素耐药(6%)；在夏季则以对3种抗生素耐药为主，其比例增加到56%. 2.4 int1 和16S rRNA荧光定量结果分析

根据荧光定量PCR检测结果可知：湿地基质中 int1 基因的绝对丰度范围为1.14×10⁵~5.66×10⁵ copies ·g^-1，16S rRNA基因的绝对丰度比 int1 约高两个数量级，为9.70×10⁶~3.91×10⁷ copies ·g^-1. int1 基因的相对丰度范围为0.54%~3.68%.

int1 基因相对丰度在不同季节具有显著差异，夏季平均相对丰度为2.61%，显著高于冬季的1.06%(P<0.05)，且3种不同工艺湿地均表现为夏季显著高于冬季(P<0.05)(如图 6). 在不同工艺类型之间 int1 基因的相对丰度也具有明显差异，表现为水平潜流>表面流>下行垂直流，尤其 在冬季水平潜流(1.54%)的 int1 基因相对丰度极显著高于表面流(1.10%)和下行垂直流(0.54%)(P<0.01).

图 6

Fig. 6

图 6 int 1 的相对丰度 Fig. 6 Distribution of relative abundances of int1 gene

本文研究了人工湿地中葡萄球菌和假单胞菌的两种环境土著菌的耐药特征，发现两者耐药特征具有一定的差异，假单胞菌对AMP和 C的耐药水平要远远高于革兰氏阳性的葡萄球菌，而对CAZ的耐药水平要远远低于葡萄球菌. 其原因在于两种土著菌的细胞结构差异及抗生素的理化性质、 作用机制的不同. 假单胞菌为革兰氏阴性杆菌，而葡萄球菌为革兰氏阳性菌，两者细胞结构的差异以及抗生素的作用途径和机制的不同导致其耐药特征的差异. 同时，人工湿地基质土著菌的耐药特征与已报道的肠道菌有明显的差别，对比杨芳等^[18]、 陆孙琴等^[23]的研究结果发现，土著菌对AMP、 SXT的耐药率与生活污水中的肠道细菌相当，均表现出较高的耐药水平；而对TE、 CIP、 CN耐药率要远远低于生活污水中的肠道细菌. 分析其原因：AMP、 SXT使用历史较久、 使用范围相当广泛，肠道菌的耐药水平普遍相当高，且本研究中的人工湿地已经稳定运行3 a，从而导致其环境土著菌对这两种抗生素有较高的耐药性；同时目前已有的研究发现环境中整合子基因盒中携带的耐药基因主要以磺胺类和氨基糖苷类抗生素的耐药基因为主^[6,15]. 此外，土著菌耐药性的获得与肠道菌的场所不同，人和动物体内抗生素的剂量水平(mg ·kg^-1)要比环境中高几个数量级，土著菌在较低抗生素残留环境中获得耐药性的压力和概率要远远低于肠道菌，因此对某些抗生素的耐药率要远低于肠道菌.

本研究中，葡萄球菌的多重耐药率达到69%，高于Faria等^[24]研究的自来水处理厂和污水处理厂葡萄球菌的多重耐药率(53%和 34%)；假单胞菌主要对AMP、 SXT表现出较高的耐药水平，耐药率分别为90%和51%，而对于 TE、 CAZ、 CN和CIP 的耐药率极低(<3%). Igbinosa等^[25]从污水和淡水环境分离出来的假单胞菌对TE、 CAZ和AMP的平均耐药率分别为47%、 82%和92%；对CIP和CN则100%敏感，AMP、 CIP、 CN的耐药情况与本研究的结果一致，而TE、 CAZ的耐药远高于本研究. 两种土著菌的总体耐药率约为84%，低于污水处理厂活性污泥中细菌的耐药率^[17]和养殖场细菌的耐药率^[26]，与某些自然水体中细菌的耐药水平相当，Su等^[27]检测东江水体中大肠杆菌的耐药率达到89%，南非德班的两条河流分离菌株的耐药率为71%~97%^[28]. 此外，本研究人工湿地基质土著菌的多重耐药指数MRI范围为0.01~0.40，平均0.22，低于畜禽粪便细菌的MRI值0.56^[26]，与自然河流水体的0.19大致相当^[29]，但高于该人工湿地进水中大肠杆菌的多重耐药指数0.14^[18]，表明在人工湿地基质的土著菌长期暴露在一定浓度抗生素和耐药肠道菌的生活污水环境下获得了耐药性，Gao等^[30]通过系统发育分析发现水体中 sul1 可以从肠道菌转移到土著菌中. 有研究表明当菌株暴露在抗生素频繁使用的环境中MRI>0.2，而在抗生素很少使用或从不使用的环境中MRI<0.2^[31]，因此研究中的人工湿地所暴露的环境中抗生素水平较高. 而人工湿地能够有效地去除生活污水中抗生素^[32,33]，基质生物膜上的微生物在降解抗生素的过程中，逐渐适应环境而获得耐药性.

本研究中，微生物的耐药性和 int1 的丰度在人工湿地中呈现出季节性的差异. 细菌的耐药率和MRI在夏季居高，且多重耐药的方式也说明了夏季基质生物膜上土著菌的多重耐药性比冬季更加复杂. 夏季湿地中 int1 的丰度也显著高于冬季. 其原因在于夏季较高的温度下，微生物繁殖快，催化整合酶基因表达的酶类活性高，从而促进耐药基因的转移和表达. Hardwick等^[34]研究发现整合酶的表达与环境因子有关，还有研究指出在一定范围内温度的升高可明显提高整合子对耐药基因的重组效率^[35]，使耐药基因的交流传播更活跃，从而导致耐药率的升高.

工艺类型对湿地基质土著菌的耐药和基质中 int1 基因丰度也有一定程度的影响. 细菌对抗生素的耐药率总体表现为下行垂直流最高，这可能由于下行垂直流湿地通气性能良好，具有一定的富氧能力^[36]，有利于基质生物膜上好氧土著菌的生长，从而使得下行垂直流湿地中细菌的耐药率较高，这与杨芳等^[18]的研究结论相似. 而 int1 基因丰度在水平潜流湿地中最高，其原因在于水平潜流湿地的水流速度较慢，具有相对稳定的生物膜环境^[14]，使得其中基因的整合与交流更容易发生，有利于 int1 基因的表达. 有研究表明整合酶的表达跟所处环境有关，杨维青指出铜绿假单胞菌在生物膜状态的 int1 表达量远远高于游离状态^[37].

平均每个细菌的染色体中携带4个16S rRNA基因拷贝^{[38, 39, 40]}，每个样本中细菌携带 int1 基因的比率约为 int1 相对丰度的4倍^[34]，本研究通过 int1 的相对丰度对人工湿地基质生物膜上的细菌 int1 携带率进行了有效的估计，结果发现全部样品中平均约有7.3%的细菌携带 int1 ，且夏冬两季有6个样品的细菌 int1 携带率超过了10%. 已有的研究揭示环境中 int1 的携带率约为1%~5%^{[15, 41, 42]}，例如，悉尼河流沉积物样本中细菌 int1 携带率为2.65%^[34]，珠江口典型水产养殖区中，水体中的 int1 携带率为0.22%~19.28%，沉积物中为0.48%~1.60%^[43]，本研究中人工湿地的基质土著菌的 int1 携带率在2.16%~14.72%范围内，高于河流等自然水体，与养殖环境中细菌的 int1 携带率相当. int1 的存在导致ARGs的捕获和整合，并在微生物之间转移，导致微生物产生耐药性和多重耐药性，有研究表明 int1 在环境中是介导ARGs水平传播的重要因素之一^{[44, 45, 46]}. 本研究中的人工湿地基质微生物具有较高 int1 携带率，耐药基因传播的污染风险较大.

4 结论

(1)人工湿地基质中土著菌存在一定程度的耐药性，其耐药率、 MRI处于较高的水平，与环境中肠道菌相当，但其耐药特征与肠道菌有一定的差异. 人工湿地基质的土著菌长期暴露在一定浓度抗生素和耐药肠道菌的生活污水环境下获得了耐药性.

(2)季节差异对湿地中土著细菌耐药和整合基因 int1 分布均有较大影响，夏季细菌的耐药率、 MRI值及 int1 丰度显著高于冬季.

(3)细菌耐药和整合基因 int1 分布受湿地工艺的影响也不可忽视，耐药率和MRI值在下行垂直流湿地中最高，而 int1 相对丰度则在水平潜流湿地中最高.