硝基芳香族化合物是一类重要的化工原料，广泛应用于染料、 农药、 医药、 塑料及合成材料的生产^[1]. 大多数硝基芳香族化合物具有致癌症、 致突变、 致畸的“三致”作用，部分硝基芳香族化合物还可经过肝脏和肠道细菌的代谢生成致癌物质或致癌物质前体^{[2, 3, 4]}. 因此，大多数硝基芳香族作为重要的环境污染物备受关注，严重地威胁着环境安全和人类健康. 对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)作为一种重要的单硝基芳香族化合物，大量应用于染料、 医药、 农药及木材防腐剂的生产^[5]. 对硝基苯酚在其生产和使用过程中被释放到环境中，同时由于杀虫剂对硫磷和甲基对硫磷，除草剂地乐芬与二硝基甲酚的水解而进入环境中^[6]. 对硝基苯酚在深层土壤和地下水中的残留时间较长且易在生物体内富集，作为呼吸链氧化磷酸化过程解偶联剂，浓度低于10 μmol ·L^-1就能改变细胞代谢过程，因而对人体健康、 动物和植物及微生物的生长产生巨大威胁^[7]. 早在1988年美国环保署(EPA)已将对硝基苯酚列为优先控制污染物之一，规定其在自然水体中的浓度应低于10 ng ·L^{-1[8]，也被列入我国68种水中优先控制污染物黑名单. 对此类污染物的降解研究已经成为国内外研究的热点之一.}

对于污染物的降解，常见的方法包括物理-化学结合降解和生物降解^{[9, 10, 11]}. 在许多报道中，生物降解以其高效、 廉价的特点作为物理-化学结合降解的替代方法而被广泛接受^{[12, 13]}. 芳香族化合物在其苯环上出现其他替代基团，如硝基或卤族元素，使得降解的难度加大^[14]. 尽管如此，已有较多关于细菌利用PNP作为唯一碳源和能源对PNP进行降解的报道^{[15, 16, 17]}. 然而，至今少有关于对硝基苯酚的降解动力学研究的报道. 利用生物降解对环境污染物受诸多环境因素的影响，如环境pH、 温度以及降解菌株的接入量等^[18]，此外适当的补充碳源或氮源物质也可明显促进降解菌株对污染物的降解^{[19, 20]}. 因此，深入研究降解菌株对对硝基苯酚的降解动力学对于降解菌株的实际利用和阐明降解机制都具有重要意义. 本文研究了环境因素对菌株Arthrobacter sp. CN2降解对硝基苯酚的影响，并对降解动力学进行分析，以期为对硝基苯酚污染的生物修复提供理论依据与技术支持.

1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 1.1.1 供试菌株

菌株为中国农业科学院研究生院生物学教研室保存菌株节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.CN2)，其中16S rRNA基因序列的GenBank登录号为EU266494.

对硝基苯酚，纯度大于99.0%，购自天津市天新精细化工开发中心. 对硝基苯酚用纯水溶解配制成浓度为2×10⁴ mg ·L^-1的母液备用. 高效液相色谱使用的甲醇和乙腈均为色谱纯级. 其余试剂均为国产分析纯.

普通培养基(LB)： 胰蛋白胨10 g，酵母粉10 g，NaCl 10 g，去离子水1 L，pH 7.2±0.2.

无机盐离子培养基(MSM)： (NH₄)SO₄ 2.0 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.2 g，CaCl₂ ·2H₂O 0.01 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.001 g，Na₂HPO₄ ·12H₂O 1.5 g，KH₂PO₄ 1.5 g，去离子水1 L，pH 7.2±0.2.

上述培养基中加入1.5%的琼脂粉即得到对应的固体培养基，所有培养基均在121℃灭菌30 min备用.

分别配制不同pH(5.0~10.0)、 NaCl浓度(0~100 g ·L^-1)和葡萄糖浓度(0、 5、 10 g ·L^-1)的MSM液体培养基备用，并加入对硝基苯酚至浓度50mg ·L^-1. 将菌株CN2接种至新鲜LB培养基中，在恒温摇床中30℃，180r ·min^-1条件下预培养至D600=0.8. 取2 mL预培养的菌液，6 000 r ·min^-1离心5 min收集菌体，用新鲜MSM培养基冲洗菌体并再次离心后重悬浮于2 mL新鲜MSM液体培养基中备用. pH 5.0~10.0每个处理设3个重复，分别向20 mL不同pH的培养基中接入2 mL制备的CN2菌液，以不接菌的含相同浓度对硝基苯酚的MSM培养基为对照处理. NaCl浓度梯度0~100 g ·L^-1每个处理设3个重复，分别向20 mL含不同NaCl浓度的培养基中接入2 mL制备的CN2菌液. 分别向含0、 5和10 g ·L^-1葡萄糖的培养基中接入2 mL制备的CN2菌液，每个处理设3个重复. 上述所有处理中，均以同等条件下不接菌的含相同初始浓度对硝基苯酚的MSM培养基为对照处理. 将处理组和对照组同时在恒温摇床中进行培养，培养条件30℃，180 r ·min^-1，黑暗培养. 每8 h取样一次测定对硝基苯酚浓度.

向20 mL无机盐离子液体培养基中分别加入适量对硝基苯酚，使其浓度分别为50、 100、 150、 200和300 mg ·L^-1. 分别接入2 mL预培养的CN2菌体(方法同上). 于30℃、 180r ·min^-1、 黑暗条件下培养. 以相同条件不接菌的处理作为对照. 每个处理设置3个重复. 每8 h取样一次分别测定对硝基苯酚浓度，对降解动力学进行拟合.

7.5 L的生物反应器(BioFlo 115，New Brunswick Scientific Co.，NJ，USA)被用于CN2的放大应用实验. 反应体积为3 L，模拟的PNP废水由含50 g ·L^-1 NaCl的MSM构成(加入适量的对硝基苯酚至终浓度为100 mg ·L^-1，并添加适量葡萄糖至浓度为5 g ·L^-1)，接菌量为10%，搅拌转速为200 r ·min^-1，通气比为0.8，培养温度为30℃. 反应液pH值和溶氧浓度(DO)通过反应器的操作系统监测. 每8 h取样检测对硝基苯酚浓度和细胞干重.

样品中对硝基苯酚的浓度通过高效液相色谱法测定. 样品经孔径为0.2 μm滤膜过滤后，通过高效液相色谱仪在320 nm处基于外标法进行对硝基苯酚浓度定量. 高效液相色谱仪为安捷伦1200(Agilent，USA)，色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C₁₈(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流动相为甲醇、 乙腈和水的混合物(42 ∶48 ∶10)，流速1mL ·min^-1，柱温30℃，进样量2 μL，二极管阵列复合波长检测器进行检测. 通过对硝基苯酚标准品绘制对硝基苯酚浓度与320 nm处吸收值关系的标准曲线(R₂=0.972 3).

实验数据均通过SPSS 15.0软件进行分析.

2 结果与分析 2.1 pH对降解率的影响

如图 1所示，菌株CN2在pH 5.0~7.0范围内，随着pH的升高，降解速率逐渐升高. 当pH为7.0时，CN2在72 h对对硝基苯酚的降解率达到最大为99.2%. 当pH>8.0以后，随着pH升高，降解效率逐渐下降. 且从中可以看出，过低或过高的pH值(pH＜7.0 或 pH＞8.0)时，降解出现延迟，在24 h以后对硝基苯酚才出现显著降解. 同时，pH 8.0条件下72 h的降解效率与pH 7.0条件下无显著差异； 在pH 6.0、 9.0和10.0条件下，对硝基苯酚72 h的降解率均大于68%，由此可判断Arthrobacter sp. CN2对环境pH有较宽的耐受范围，且在pH 7.0~8.0之间能够高效降解对硝基苯酚.

图 1

Fig. 1

图 1 Arthrobacter sp. CN2在不同pH条件下降解对硝基苯酚的速率 Fig. 1 Effect of pH on the PNP degradation rate of Arthrobacter sp. CN2

由图 2可知，在NaCl浓度为10~60 g ·L^-1时，对硝基苯酚的降解率无显著差异(P＞0.05)； 当NaCl浓度＞60 g ·L^-1时，随着NaCl浓度的提高，对硝基苯酚的降解率逐渐降低； 当NaCl浓度＞80 g ·L^-1时，对硝基苯酚基本不降解. 且当NaCl浓度为70 g ·L^-1和80 g ·L^-1时，降解率分别为55.3%和14.7%. 由此说明，菌株Arthrobacter sp. CN2具有较好的耐盐能力，能在较高盐浓度(≤60 g ·L^-1)条件下高效降解对硝基苯酚.

图 2

Fig. 2

图 2 不同NaCl浓度对降解率的影响 Fig. 2 Effect of different salinity on the PNP degradation rate of Arthrobacter sp. CN2

额外添加葡萄糖对CN2降解对硝基苯酚和CN2生长的影响如图 3所示，额外添加碳源显著促进CN2的增长. 额外添加葡萄糖5 g ·L^-1和10 g ·L^-1培养72 h后，菌体的浓度均大于同时期不添加葡萄糖的菌体浓度. 同时，不添加葡萄糖时菌株的生长存在迟缓期(0~16 h)；而随着葡萄糖的添加，迟缓期的时间逐渐缩短至无明显的迟缓期(5 g ·L^-1时为0~8 h，10 g ·L^-1时无迟缓期). 但额外添加碳源对降解的影响却存在不同的表现. 当葡萄糖浓度为5 g ·L^-1时，对硝基苯酚的降解率在第48 h即达到最大值95.5%，而不添加葡萄糖的情况下则需要64 h才能达到同样的降解率； 但当葡萄糖浓度为10 g ·L^-1，对硝基苯酚的降解受到明显的抑制，0~72 h对硝基苯酚浓度无明显变化. 该结果说明，额外添加的碳源，能够显著地促进CN2生长并缩短迟缓期； 同时，额外添加的碳源在一定浓度范围内能够显著促进对硝基苯酚的降解，缩短降解周期； 但当额外碳源浓度过高时，对硝基苯酚的降解受到显著抑制，甚至完全抑制.

图 3

Fig. 3

图 3 额外添加碳源对降解率与菌株生长的影响 Fig. 3 Effect of additional carbon source on the PNP degradation rate and cell growth of the strain

酶促反应动力学方程被广泛应用于酶促反应分析，主要研究酶催化的反应速率及影响反应速率的各种因素. 其中，一级动力学方程在污染物的生物降解研究中被广泛应用. 一级动力学方程描述为：

进一步根据一级动力学方程获得半衰期公式：

图 4

Fig. 4

图 4 菌株CN2对不同浓度对硝基苯酚降解曲线的线性拟合Fig. 4 Linear fitting of degradation curves of Arthrobacter sp. CN2 at different initial concentrations of p-nitrophenol

表 1(Table 1)

表 1 菌株CN2对不同浓度对硝基苯酚降解的动力学参数 Table 1 Parameters of the degradation kinetics of Arthrobacter sp. CN2 at different initial concentrations of p-nitrophenol 对硝基苯酚初始浓度/mg ·L-1 R2 k t1/2/h 50 0.958 0.025 0 27.7 100 0.972 0.022 7 30.5 150 0.961 0.021 7 31.9 200 0.987 0.022 1 31.4

表 1 菌株CN2对不同浓度对硝基苯酚降解的动力学参数Table 1 Parameters of the degradation kinetics of Arthrobacter sp. CN2 at different initial concentrations of p-nitrophenol

菌株CN2在生物反应器中降解对硝基苯酚的效率如图 5所示，在反应器中处理72 h后，对硝基苯酚的降解率达到94.9%； 菌株CN2的细胞干重逐渐提高，在72 h之后细胞干重达到1.47 g ·L^-1. 降解的效率与速率和实验室条件下(三角瓶小试)基本相同. 由此可判断，在生物反应器中菌株CN2能够高效地降解对硝基苯酚，同时可耐受较高浓度的NaCl(≤50 g ·L^-1).

图 5

Fig. 5

图 5 菌株CN2在生物反应器中的应用Fig. 5 Application of CN2 in bioreactor

工业废水的生物处理所直接面对的问题是工业废水恶劣的条件，如污染物浓度较高、 高盐、 极端pH、 溶氧较低等^{[21, 22, 23]}. 因此，在工业废水生物处理过程中，降解菌株对于恶劣条件的耐受能力就显得尤为重要. 菌株良好的耐盐能力能够降低废水除盐的成本并提高处理的效率，因此耐盐菌株的分离受到广泛关注与研究. Jin等^[24]分离获得的降解菌Dietzia natronolimnaea JQ-AN在盐浓度0~60 g ·L^-1之间能够高效地降解苯胺，降解率在60%以上. 本研究针对性地选择了环境pH和盐浓度作为条件以探究对硝基苯酚降解菌Arthrobacter sp. CN2的应用潜力. 降解菌株对于环境pH良好的耐受能力对于菌株在实际生产中的应用具有重要意义^[15]. 菌株CN2在较宽范围的pH(7.0~8.0)和盐浓度(0~60 g ·L^-1)条件下均能高效的降解对硝基苯酚，表现出良好的环境适应能力与应用前景. 同时，适量的添加额外碳源可以显著的促进对硝基苯酚的降解和提高降解速率，当添加5 g ·L^-1的葡萄糖时，对硝基苯酚降解率达到90%时所需的时间较不添加葡萄糖条件下缩短16 h. 这意味着菌株CN2可以以共降解的形式降解对硝基苯酚，对菌株CN2的实际应用具有重要意义. Cyco Dn＇ 等^[25]同样发现在额外添加碳源后，菌株Serratia sp.和Pseudomonas sp.对二嗪农的降解速率显著提高. 但额外添加碳源在某些情况下却会抑制微生物对污染物的降解，如Singh等^[20]发现毒死蜱降解菌Enterobacter sp. B-14在额外添加碳源后降解完全受到抑制. 额外添加的碳源对于降解过程通常具有积极的效应，在降解的初期微生物通过利用额外的碳源增加了生物量同时缩短了迟缓期，从而促进了污染物的降解^[19]； 少数情况下，由于额外碳源的快速利用，导致酸性物质的产生和积累使得环境pH降低，从而抑制酶活使污染物的降解受到抑制^[17]. 因此，菌株CN2在额外添加 5 g ·L^-1葡萄糖后降解过程受到显著促进，这对于CN2的应用具有重要意义.

降解动力学的研究为实际生产过程中工业废水的处理提供了理论参考，从而达到了减少能耗和缩短降解周期的目的^[26]. 本研究发现，对硝基苯酚浓度低于300 mg ·L^-1时，菌株CN2降解对硝基苯酚符合一级动力学方程，降解动力常数在0.021 7~0.025 0之间. 当对硝基苯酚浓度≥300mg ·L^-1时，降解不再符合一级动力学方程，且表现出较低的降解速率. 因此，在菌株CN2的实际应用中可通过稀释等手段调整废水中对硝基苯酚浓度，使其低于300mg ·L^-1，从而实现对硝基苯酚的快速高效降解.

菌株CN2在生物反应器中能够对模拟含对硝基苯酚工业废水进行高效降解，这对于菌株CN2的中试放大与实际应用具有重要意义. 目前，通过微生物对工业废水的处理大多处于降解机制研究阶段，少有关于实际应用的报道. 而生物反应器作为对生产条件的模拟能够有效地反映降解菌株的实际应用潜力，为工业废水的生物治理提供参考.

菌株Arthrobacter sp. CN2能够高效地降解对硝基苯酚，对环境pH和盐离子浓度有较宽的耐受范围，同时适量添加额外碳源可显著地促进菌株CN2对对硝基苯酚的降解. 对菌株CN2降解对硝基苯酚进行动力学分析，当对硝基苯酚浓度低于300mg ·L^-1时降解符合一级动力学方程. 进一步模拟废水处理，菌株CN2在生物反应器中对3 L含对硝基苯酚废水(100mg ·L^-1)在72 h的降解率大于90%. 且菌株Arthrobacter sp. CN2具有良好的应用前景.