黄连(Rhizoma coptidis)属毛莨科植物，根茎含有30余种的生物碱，其中小檗碱(berberine)含量最高，其次是黄连碱(coptisine)、 甲基黄连碱(worenine)、 掌叶防己碱(palmatisine)、 药根碱(jatrorrhizine)、 表黄连碱(epiberberine)等^[1]. 黄连生物碱易溶于水，在水产养殖中，黄连根茎和制剂广泛用于鱼类多种感染性疾病的防治^[2,3]. 此外，我国60%的黄连集中种植于三峡库区的石柱县^[4]. 黄连的生长周期3~5 a，根茎残体、 根细胞脱落和根系的分泌作用将黄连生物碱带入土壤^[5]，再经降雨淋溶进入地表或地下径流. 因此，黄连生物碱可直接或间接进入水体，作用于水生动物、 植物和微生物，对水生态系统可能产生持续影响.

黄连根茎对植物和微生物具有广泛的生物学毒性. 除杀灭或抑制人畜病原微生物之外，黄连根茎浸提物降低菜豆和绿豆的发芽率，抑制幼苗生长、 影响硝酸还原酶活性和根系生理代谢等^[6]； 在种植黄连的土壤中，细菌和放线菌数减少，真菌数增加，微生物多样性和均匀性指数降低，种群结构改变^[5]，类似雷公藤和黄花蒿等药用植物对植物生长和土壤微生物的影响^[7,8]. 值得注意的是，种植黄连后一般需要休耕多年，连作障碍严重^[9]，意味着进入土壤的化感物质不易分解，残效期较长. 绿藻能净化水体，是滤食性鱼类的主要饵料，具有多种多样的生理、 生化和生态功能，是评价水体生产力和健康质量的重要指标^[10]. 三峡库区是我国水资源保护的重点地区，其水质关系到下游4亿人民的生产生活和南水北调的水质安全. 当地水产养殖业发达，并大规模集中种植黄连，但黄连生物碱对水生植物的影响尚待研究. 为此，本研究以斜生栅藻和蛋白核小球藻为试验材料，分析了黄连根茎浸提物对它们的毒理作用，以期为评估水产养殖中黄连根茎或制剂过度使用和集约化种植可能引起的水生态风险提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 试验材料

供试黄连取自石柱县黄水镇5年生黄连根茎，(80±1)℃烘干，粉碎过2 mm筛，称取100.00 g，加去离子水37℃水浴，浸提24 h，过滤，定容至1000 mL(样品由西南大学药学院HPLC测定： 生物碱总含量为176.1 mg ·L^-1，其中，小檗碱101.1 mg ·L^-1，黄连碱28.7 mg ·L^-1，巴马汀26.6 mg ·L^-1，表小檗碱18.1 mg ·L^-1，药根碱1.6 mg ·L^-1)，配成质量浓度为100 g ·L^-1的黄连根茎浸提液(Coptis chinensis root extracts，CRE)，放入4℃冰箱避光保存备用.

斜生栅藻(S. oblique)和蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)均购自中国科学院武汉水生研究所，用SE培养基培养至对数生长期，用无菌水将斜生栅的藻密度稀释为1.15×10⁷个 ·mL^-1，蛋白核小球藻为1.40×10⁷个 ·mL^-1备用. 1.2 试验方法 1.2.1 绿藻预培养

取1200 mL的广口瓶12个，分别加入SE培养基900 mL，接种50.0 mL藻液，在温度(20±0.5)℃、 光照周期12 h ·d^-1、 光强1200 lx下进行预培养4 d. 1.2.2 试验设计

设置0.00、 0.05、 0.25、 1.00 g ·L^-1CER质量浓度的4个处理(依次用CK、 T1、 T2、 T3表示)，每个处理重复3次. 具体操作是： 在绿藻预培养4 d后，分别加入0、 0.5、 2.5、 10 mL的100 g ·L^-1CRE溶液，并用SE培养基补足至1 L(藻体密度为1.75×10⁶ 个 ·mL^-1)，构成CK、 T1、 T2、 T3等4个处理，各处理相当于含有黄连总生物碱(total alkaloid，TA)： 0、 0.088、 0.44和1.76 mg ·L^-1，再继续培养144 h. 1.2.3 测定指标及方法

在0～144 h培养期，每间隔12 h用显微镜-血球计数板观察藻细胞数^[11]，电导仪测定培养液电导率^[12]，精密pH计测定培养液pH^[13]. 在培养结束时，用考马斯亮蓝法和丙酮-分光光度法分别测定绿藻的蛋白质和叶绿素含量^[14]； 在48、 96和144 h这3个时段，每瓶各取100 mL藻液，4000 r ·min^-1离心15 min，收集绿藻细胞，分别用硫代巴比妥酸法、 氮蓝四唑法和碘量法测定丙二醛(MDA)含量、 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性^[14]. 1.3 数据处理

采用Excel对试验数据进行基本计算，SPSS 17.0软件进行方差分析，差异显著性检验用LSD法，显著性水平为P<0.05.

2 结果与分析 2.1 绿藻的生长繁殖

图 1可见，对照处理的两种绿藻生长曲线呈显著的对数增加趋势，其中，斜生栅藻 Y_CK=0.546 ln(t)+2.377,R²=0.79^**(式中，Y为绿藻细胞密度，t为时间，下同)； 蛋白核小球藻Y_CK=0.669ln(t)+1.322,R²=0.81^**. 但是，黄连根茎浸提液(CRE)显著抑制2种绿藻的生长繁殖，并表现出明显的药物剂量依赖关系. T1处理的绿藻生长曲线仍呈对数增长趋势，但单位时间藻细胞密度增加量明显下降(斜生栅藻 Y_T1=0.392 ln(t)+2.366,R²=0.90^**； 蛋白核小球藻Y_T1=0.515ln(t)+1.307,R²=0.60^**)，T2和T3处理已无对数增殖趋势，其中，斜生栅藻初始藻细胞密度与结束时(144 h)的差异不大，但蛋白核小球藻在144 h的密度仅为初始密度(0 h)的41.00%~59.00%，有大量藻体死亡. 随着CRE浓度的增加，绿藻生长繁殖量逐渐降低，中、 高浓度的CRE对蛋白核小球藻的毒性大于斜生栅藻.

图 1

Fig. 1

图 1 CRE对斜生栅藻和蛋白核小球藻生长繁殖的影响 Fig. 1 Effects of Coptis chinensis root extracts on growth and reproduction of S. oblique and C. pyrenoidosa

图 2可见，随着CRE浓度增加，T2和T3处理显著降低斜生栅藻和蛋白核小球藻的叶绿素和蛋白质含量. 在T3处理中，斜生栅藻的叶绿素和蛋白质含量分别比CK降低了50.00% 和41.27%； 蛋白核小球藻的叶绿素和蛋白质含量分别比CK降低了94.16%和59.56%.

图 2

Fig. 2

图 2 黄连浸提液对绿藻叶绿素和蛋白质含量的影响 Fig. 2 Effects of Coptic chinensis root extracts on chlorophyll and protein in green algae

图 3所示，在试验期间(0～144 h)，绿藻CK处理的pH值上升了1个单位(斜生栅藻CK处理的pH值从9.24上升至10.33； 蛋白核小球藻CK的pH值从9.27升高到10.53). 但是，CRE处理的pH值显著降低，在144 h，斜生栅藻T1、 T2和T3处理的pH分别比CK下降了25.95%、 30.61%和27.50%； 蛋白核小球藻T1、 T2和T3处理的pH分别比CK下降了19.30%、 29.11%和25.14%.

图 3

Fig. 3

T1、 T2、 T3已扣除背景值的影响，下同 图 3 CRE对斜生栅藻和蛋白核小球藻培养液pH的影响 Fig. 3 Effects of Coptic chinensis root extracts on pH in culture solutions of S. oblique and C. pyrenoidosa

在绿藻培养期间，溶液的电导率随培养时间延长而提高(图 4). 培养结束时，CRE处理的电导率显著高于CK. 在144 h时，斜生栅藻T1、 T2和T3处理的电导率比CK处理依次增加了7.72%、 7.76%和6.88%； 蛋白核小球藻CRE处理的电导率比CK依次提高了2.87%(T1)、 9.77%(T2)和11.15%(T3).

图 4

Fig. 4

图 4 CRE对斜生栅藻和蛋白核小球藻培养液电导率的影响 Fig. 4 Effects of Coptic chinensis root extracts on conductivity in culture solutions of S. oblique and C. pyrenoidosa

表 1可见，在3个不同阶段，与各自的CK相比，CRE均显著增加绿藻的SOD活性，CRE处理的斜生栅藻SOD增加幅度为19%～310%，蛋白核小球藻为42%～732%. 其中，斜生栅藻T1和T2处理的SOD活性在96 h时最高，而T3处理的峰值出现在144 h； 蛋白核小球藻T1处理SOD峰值出现在48 h，而T2和T3处理的峰值滞后到144 h.

表 1(Table 1)

表 1 黄连根浸提液对绿藻SOD活性的影响 1) Table 1 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on SOD activity 绿藻 处理 处理方差分析 SOD活性/U ·g-1 时间进程方差分析 48 h 96 h 144 h F值 P 斜生栅藻 CK 16.72±0.06d 19.77±0.38c 19.41±0.75c 23.622 0.001 T1 19.85±1.39c 74.86±7.28a 27.88±0.90b 142.563 0.000 T2 31.85±1.28b 50.99±8.15b 40.70±0.17a 12.134 0.008 T3 35.28±1.30a 24.81±1.46c 40.47±2.14a 68.174 0.000 F值 174.041 64.041 216.104 P 0.000 0.000 0.000 蛋白核小球藻 CK 10.10±0.73d 13.81±0.26c 17.42±1.22d 57.739 0.000 T1 23.97±0.65a 14.95±2.29bc 23.79±0.90c 24.577 0.001 T2 22.08±0.84b 18.20±1.75b 28.63±0.73b 58.574 0.000 T3 14.31±0.30c 21.70±1.43a 31.82±2.26a 96.034 0.000 F值 291.766 11.078 59.365 P 0.000 0.000 0.000 1) 在同一列中，有不同字母表示差异显著(LSD法，P ＜ 0.05)，下同

表 1 黄连根浸提液对绿藻SOD活性的影响 1) Table 1 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on SOD activity

在2种绿藻的CK处理中，3个时段测定的CAT活性无显著变化(P＞0.05)； 但在CRE的处理中，时间和CRE均显著影响绿藻的CAT活性(表 2). 在48 h，3个CRE处理的CAT活性均显著低于CK，CRE的浓度越大CAT活性降低越多，4个处理CAT活性由高到低依次为CK＞T1＞T2＞T3； 在96 h和144 h，T1和T2处理的CAT活性又逐步升高，但在高浓度的T3处理中，绿藻CAT活性一直维持在很低的水平. 2种绿藻均有相似的现象.

表 2(Table 2)

表 2 黄连根浸提液对绿藻CAT活性的影响 Table 2 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on CAT activity 绿藻 处理 处理方差分析 CAT活性/mg ·(g ·min)-1 时间进程方差分析 48 h 96 h 144 h F值 P 斜生栅藻 CK 3.73±0.52a 3.78±0.75a 3.98±0.33a 0.348 0.719 T1 1.68±0.10b 3.57±0.01a 3.43±1.12a 295.853 0.000 T2 1.27±0.11b 2.88±0.10b 3.90±0.45a 72.513 0.000 T3 0.49±0.04c 0.46±0.01c 0.68±0.09b 12.908 0.007 F值 79.589 370.544 74.088 P 0.000 0.000 0.000 蛋白核小球藻 CK 1.91±0.03a 1.83±0.01a 1.48±1.05b 4.063 0.077 T1 1.20±0.12b 1.99±0.17a 3.78±0.76a 35.601 0.000 T2 1.21±0.12b 1.60±0.01b 1.82±0.13b 93.025 0.000 T3 0.23±0.05c 0.11±0.01c 0.25±0.02c 10.909 0.000 F值 195.305 230.577 34.647 P 0.000 0.000 0.000

表 2 黄连根浸提液对绿藻CAT活性的影响 Table 2 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on CAT activity

表 3所见，在2种绿藻的CK处理中，3个时段测定的MAD含量均无显著变化(P＞0.05)； 但在CRE的处理中，时间和CRE均显著影响绿藻的MAD含量. CRE使2种绿藻的MDA含量极显著提高(P＜0.01)，尤其在处理后48 h出现明显的峰值(如斜生栅藻3个CRE处理的MDA含量比CK增加了7～14倍)； 在96 h和144 h，各CRE处理的MDA含量又显著下降. 此外，低浓度的CRE对MDA的影响大于高浓度的CRE. 如在48 h时，斜生栅藻T1处理MDA含量是4.94 μmol ·mg^-1，T2和T3处理分别是2.36 μmol ·mg^-1和2.54 μmol ·mg^-1，但均显著高于CK. 蛋白核小球藻也存在相似现象.

表 3(Table 3)

表 3 黄连根浸提液对绿藻MAD含量的影响 Table 3 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on MAD content 绿藻 处理 处理方差分析 MDA/μmol ·mg-1 时间进程方差分析 48 h 96 h 144 h F值 P 斜生栅藻 CK 0.33±0.07c 0.36±0.06c 0.36±0.09c 1.959 0.204 T1 4.94±0.05a 1.67±0.10a 1.62±0.09a 1534.427 0.000 T2 2.36±0.44b 0.85±0.13b 0.92±0.04b 31.615 0.001 T3 2.54±0.36b 0.53±0.11c 0.76±0.02c 93.953 0.000 F值 131.182 75.279 235.846 P 0.000 0.000 0.000 蛋白核小球藻 CK 0.09±0.07c 0.11±0.01c 0.15±0.03d 1.294 0.341 T1 1.76±0.09a 0.50±0.07a 0.49±0.06b 209.215 0.000 T2 0.83±0.05b 0.31±0.00b 0.66±0.03a 66.946 0.000 T3 0.81±0.00b 0.13±0.00c 0.35±0.01c 389.50 0.000 F值 367.980 79.981 44.370 P 0.000 0.000 0.000

表 3 黄连根浸提液对绿藻MAD含量的影响 Table 3 Effects of Coptic chinensis fibrous root extracts on MAD content

3 讨论

绿藻是水体生态系统的重要组成部分. 作为地球上最重要的有机质初级生产者，它们通过光合作用，吸收CO₂，释放O₂，生产出7倍于陆生植物形成的光合碳水化合物，并为水生动植物提供氧气和饵料，在水生态系统中扮演极其着重要的角色^[15]. 需要指出的是，绿藻对外界环境反应敏感，pH、 温度、 光照、 养分、 污染物等因素都会影响其生长^[16]. 因此，绿藻常作为监测水体污染的指示植物. 黄连根茎或制剂具有消炎杀菌等作用，在集约化水产养殖中，黄连根茎或制剂单独和配合用于防治鱼、 虾、 蟹、 贝类、 海参的多种细菌和病毒引起的疾病^[2,3]. 一般每公斤鱼体的黄连根茎(或制剂)用量约为20 mg，连续或隔日投药，持续7 d^[17]，相当于水箱养鱼水体中含有黄连总生物碱(TA)0.95 mg ·L^-1. 试验表明，当培养液中黄连TA浓度为0.088 mg ·L^-1时(T1处理)，斜生栅藻的生长繁殖速率显著降低； 当TA浓度为0.44 mg ·L^-1时(T2处理)，斜生栅藻停止生长繁殖，蛋白核小球藻出现藻体死亡. 换言之，当水体中的黄连TA浓度达到鱼病用药量的10%，就可能影响到集约化水产养殖中绿藻的正常生长繁殖； 当水体中黄连TA浓度为鱼病用药量的一半，就会导致绿藻生长停止，这意味着进入水体的黄连生物碱将降低水体初级生产力，对水环境产生破坏作用. 在逆境条件下，水生植物的生长繁殖状况是反映其抗性最重要和直接指标^[18]，蛋白核小球藻对中、 高浓度的CRE比斜生栅藻更为敏感，暗示进入水体的黄连生物碱还可能改变绿藻的群落结构，影响水体的生态平衡. 因此，水产养殖滥用黄连制剂，集约化大规模种植黄连，其根系残体腐烂经地下和地表径流进入水体均可能存在直接和间接的生态风险.

斜生栅藻等6种淡水藻适宜的pH范围在8~10^[19]，在CRE胁迫下，两种供试绿藻培养液的pH值显著降低，源于绿藻分泌过多的氢离子引起，这种现象类似于重金属胁迫促进低等植物分泌氢离子^[20]. 在适合的pH条件下，绿藻的抗性最强，不适宜的pH将加重Cr的危害^[21]，故降低培养液的pH可能进一步加重CRE的危害. 此外，CRE提高培养液电导率，说明绿藻细胞膜结构破坏，透性增加，细胞内含物流出.

CRE显著降低绿藻叶绿素含量；蛋白质含量也因CRE的加入而显著降低. 众所周知，在光合作用中，叶绿素参与光能的吸收，其含量降低影响光合速率^[22].CRE降低绿藻叶绿素含量必然抑制光合作用，减少光合产物积累，导致绿藻生长停滞. 蛋白质是细胞的重要组成分，CRE降低藻体蛋白质含量意味着抑制藻蛋白合成，进而影响了绿藻细胞分裂与生长.

在逆境条件下，生物体可通过多种方式建立生物防御体系而减少伤害^[23]. 其中，诱导产生系统抗性是植物减少逆境伤害的重要方式之一，涉及到超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等催化的多种生物化学反应^[24]. SOD和CAT分别能清除游离氧和过氧化氢，减少它们对生物细胞和器官的伤害作用^[25]. 在CRE胁迫下，绿藻SOD活性显著提高，说明CRE激活了SOD酶的活性，也暗示细胞内游离氧增多； 在高浓度CRE的环境中，随着暴露时间延长，SOD活性降低表明SOD酶系统遭到破坏，即CRE对绿藻细胞危害加重. 这种现象也可在其它毒物危害中发现^[26]. 两种绿藻SOD活性对CRE的响应各异. 其次，暴露在低、 中浓度CRE的绿藻，初期CAT活性显著降低，随后又逐步升高，但高浓度CRE使绿藻CAT活性一直维持在很低的水平. 推测CRE对绿藻CAT酶系初期有明显的抑制，后期又有所恢复； 但高浓度的CRE对CAT酶系统有不可逆的破坏作用. 其三，CRE极显著增加2种绿藻体内的MDA含量，与CK相比，在48 h斜生栅藻增加了7~14倍. 在生物体内，MDA是细胞膜磷脂氧化最终产物之一，其含量与细胞膜“磷脂双层”的破坏程度呈显著正相关^[27]. 因此，在培养液中加入CRE之后，绿藻MDA含量显著增加意味着细胞膜磷脂氧化. 植物在干旱、 患病、 重金属等逆境条件下，产生大量活性氧，使细胞膜发生过氧化作用，最终形成MDA^[28]. 在本试验中，随着CRE浓度的增大，斜生栅藻SOD活性提高，CAT的降幅显著低于蛋白核小球藻，有益于减少前者体内游离氧和过氧化氢的积累，这可能是CRE对蛋白核小球藻的危害大于斜生栅藻的原因之一.

总之，CRE对斜生栅藻和蛋白核小球藻有明显的毒害作用，研究黄连根茎提取液对绿藻的毒理作用，有助于警示在水产养殖中黄连根茎或制剂滥用； 同时，黄连合理栽培及科学布局也有利于降低水生态风险.

4 结论

黄连根茎浸提液对斜生栅藻和蛋白核小球藻产生急性毒害，显著抑制其生长繁殖，导致藻体培养液pH降低而电导率升高，藻体叶绿素和蛋白质含量降低，脂质氧化严重. 抗氧化酶SOD活性显著升高而CAT活性降低.