近年来大量工业废水和生活污水的排入，加速了湖泊水库的富营养化进程，“水华”频繁出现，面积逐年扩散，持续时间延长. 大规模的蓝藻水华暴发降低了水资源的利用效能，如引起水质腐败、 藻毒素通过食物链影响人类的健康、 一些藻类及其代谢产物在消毒中产生的“三致”物质、 藻类填塞自来水厂的过滤装置、 一些藻细胞破坏絮凝过程等. 因此，有效控制富营养化水体中的藻类，防止水华的发生成为目前环境领域的研究热点和前沿^[1].

20世纪70年代，Rice^[2]将化感作用定义为一种植物(包括微生物)通过向环境释放化学物质而对其他个体产生的有害或有益的作用. 研究表明，大多数化感物质不仅生物可降解，而且比合成的农药半衰期较短^[3]，较传统的除草剂污染较小^[4]. 植物化感作用被认为是一种新型的生物抑藻技术，具有高效、 经济、 生态学风险小等特点，近年来备受国内外关注^{[5, 6]}. 目前，利用水生植物控制水华的研究主要集中于沉水植物、 挺水植物和浮水植物，并取得了一定的进展^[7]. 20世纪80 年代以后，利用农作物秸秆抑藻的方法逐步得到了应用. 大麦秸秆控藻藻类过度生长的方法逐步得到推广，这也是迄今为止植物化感控藻方面应用效果最好的实例，无论在现场实验还是实验室实验，均证明了大麦秸秆抑制藻类生长的有效性^{[8, 9, 10]}. 稻草秸秆浸泡液对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长的化感抑制作用表明，在10.0 g ·L^-1投加量下，15 d稻草浸泡液对微囊藻的抑制率达70%以上^[11]. 然而，目前对陆生植物化感控藻的研究相对较少，相对于水生植物来说，陆生植物具有材料来源广、 数量大、 经济成本低、 生态相对友好，如利用落叶控藻，兼有废物利用等优点. 荔枝是中国南方分布较广的一种常绿乔木植物，具有种植面积广、 栽培粗放、 寿命长等优点，建立以荔枝落叶浸出液抑藻机制为基础的水体生态调控体系，具有潜在的实用价值.

本研究以黑叶荔枝品种为实验材料，将其落叶水浸出液作用于铜绿微囊藻，实验进行15 d，运用浮游植物荧光分类仪(Photo-PAM)对铜绿微囊藻的生长、 光合活性、 快速光反应曲线进行测定，荧光分光光度计分析藻培养过程中三维荧光光谱图变化，以期为荔枝落叶控藻的应用提供理论依据与实践指导.

1 材料与方法 1.1 材料

黑叶荔枝落叶采自于人工种植树种，采集地点位于广东省深圳市某高校校园(N22°35′23.86″，E113°56′50.87″)，树龄约10 a，收集地面脱落的较干净的树叶用于实验. 落叶用去离子自来水冲洗3～5 次，40℃下干燥5 d，人工尽量将干燥的落叶揉碎，取50 g粉碎的落叶，浸泡于装有500 mL 蒸馏水的1 L锥形瓶中，密封在26℃的人工气候箱放置5 d后，浸出液用0.22 μm滤膜抽滤以消除其他微生物的影响，贮存于冰箱(0～4℃)冷藏待用. 1.2 藻种及培养

藻种铜绿微囊藻由中国科学院武汉水生生物研究所提供，用BG-11培养基^[12]于光照培养箱中培养. 培养条件为： 光强约30 μmol ·(m² ·s)^-1，温度26℃±1℃，光暗比12 h ∶12 h，每天定时摇晃1~2 次. 1.3 实验方法

实验共设置1 个对照组和5 个质量浓度梯度组(0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0 g ·L^-1),在250 mL锥形瓶内加入100 mL BG-11培养基，接种处于对数生长期的藻1 mL，藻的初始密度约10⁴～10⁵ cell ·mL^-1，按照上述浓度添加荔枝落叶浸出液，添加体积为0~2 mL，对照组不加浸出液，实验体系均用蒸馏水定容到相同体积(103 mL)，每个浓度梯度3 个平行样. 分别于实验第1、 4、 7、 10、 15 d取样，进行藻生物量(叶绿素a浓度表示)和叶绿素荧光参数测定. 1.4 叶绿素荧光参数测定

采用德国Walz公司的浮游植物荧光分类仪(Photo-PAM)测定. 微囊藻样品暗适应2 min后进行测量，叶绿素荧光参数F_v/F_m(最大光合作用效率)、 Y Ⅱ (实际光合作用效率)、 藻细胞生物量叶绿素a浓度可在荧光仪上直接读出.

测量光合电子相对电子传递速率值与光强度绘图，可得快速光曲线，由于其测量时间短，对光合状态影响小，能反映细胞水平上样品的光合活性. 采用 Platt 等的方法^[13]，通过拟合快速光曲线，得到光合活性参数，包括光能利用效率α、 最大相对电子传递速率rETRmax和光饱和系数Ik. 1.5 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱采用F-7000 型荧光分光光度计(岛津日立，日本) 测定. 带通为激发波长E_x=5 nm，发射波长Em=5 nm； 扫描波长范围为E_x 200～600 nm，E_m 200~600 nm； 扫描光谱进行仪器自动校正. 分别取对照组和2 个质量浓度组(1.2 g ·L^-1、 2.0 g ·L^-1)，于实验第1、 7、 15 d取藻液检测. 1.6 EC₅₀的计算

EC₅₀是指半抑制浓度，采用SPSS 13.0软件包计算，方法参照文献^[14]. 1.7 统计分析

采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，应用独立样本t检验进行差异比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，双因子方差分析对实验结果进行统计分析.

2 结果与讨论 2.1 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻生长的抑制作用

采用不同浓度的荔枝落叶浸出液处理铜绿微囊藻，对藻的生长进行了15 d的监测. 处理组叶绿素a与对照组百分比表征暴露于0.4、 0.8、 1.2、 1.6 和2.0 g ·L^-1浓度下的荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻的抑制作用(图 1). 结果发现，处理组从第1 d开始，藻的生长没有多大的变化，并没有受到明显抑制，2.0 g ·L^-1浓度下的荔枝落叶浸出液对微囊藻生长有一定促进作用. 第1～10 d，随暴露时间的延长抑制效果增强，1.2、 1.6和2.0 g ·L^-1处理组叶绿素a浓度占对照组百分比分别由第1 d的101.5%、 93.1%和103.4%下降至第10 d的19.2%、 26.2%、 7.5%. 第10～15 d时，抑藻效果与前10 d相比有所减弱，上述3种浓度处理组占对照组百分比第15 d分别为54.7%、 59.3%和18.3%. 然而，从第10 d开始，浸出液对微囊藻的抑制作用减弱，第15 d各处理组抑藻效果均低于第10 d，这与Xiao 等^[15]在观察大麦秸杆提取液能对铜绿微囊藻的生长抑制作用相似. 第15 d时高浓度处理组(2.0 g ·L^-1) 抑藻效果仍可高达80%以上，与对照相比具有极显著差异(P＜0.01). 浸出液对铜绿微囊藻生长的抑制效果随着暴露浓度的增加而显著升高，暴露时间不同，其抑藻效果也不同. 在未灭菌稻杆中有同样的结果，可能原因是活性物质对氧气或微生物敏感，时间越长，抑藻效果越差^[16].

图 1

Fig. 1

图 1 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻暴露1、 4、 7、 10、 15 d 后的抑制作用 Fig. 1 Inhibition effect on the growth of M. aeruginosa cultures after 1，4，7，10 and 15 d exposure to L. chinensis defoliation

由图 2可知，第1 d时，处理组和对照组叶绿素a浓度为32~36 μg ·L^-1之间，差异无很大区别，落叶浸出液浓度为0.4 g ·L^-1时，第7 d铜绿微囊藻叶绿素a浓度为689.6 μg ·L^-1，对照组为1213.8 μg ·L^-1，其他处理组叶绿素a浓度为245 μg ·L^-1以下，当落叶浸出液浓度为2.0 g ·L^-1，叶绿素a浓度为108.4 μg ·L^-1，化感抑藻效果明显； 第7 d开始，各处理组抑制能力下降，第15 d时，对照组叶绿素a浓度为4650.8 μg ·L^-1，控藻能力最强的为浸出液浓度为2.0 g ·L^-1，叶绿素a相对浓度虽仅有对照组的18.3%，但其实际浓度有851.3 μg ·L^-1，在一定条件下，仍有可能发生水华.

图 2

Fig. 2

图 2 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻暴露1、 4、 7、 10、 15 d 后叶绿素浓度的影响 Fig. 2 Chl-a content of M. aeruginosa after 1，4，7，10 and 15 d exposure to the L. chinensis defoliation extract

藻类叶绿素a浓度与其光合作用密切相关. 水生植物对藻类化感抑制作用表明，共生培养的情况下，金鱼藻能明显降低铜绿微囊藻的叶绿素a含量^[17]，黄菖蒲和狭叶香蒲可以诱导铜绿微囊藻产生氧化胁迫，导致叶绿素分解^[18]，穗花狐尾藻能显著抑制铜绿微囊藻的叶绿素荧光参数和快速光响应曲线^[19]. 当培养液中添加荔枝落叶浸出液时，其叶绿素a浓度在第15 d均有大幅降低，浸出液含有的化感物质可能对叶绿素a具有破坏或抑制光合作用，或两者兼有，进而影响藻的生长，浸出液中的化感物质究竟起何作用，仍有待于进一步研究. 然而，浸出液中的化感物质可能为非稳定物质，在培养后期，由于化感物质的分解，抑藻能力减弱. 因此，在实际生产中，必须定期添加浸出液，才有可能较长期抑制藻类的生长作用. 2.3 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻PS Ⅱ光合作用效率的影响

光合作用效率反映藻细胞将光能转化为化学能量的能力，是光合作用的重要指标，荔枝落叶对藻细胞最大光合作用效率(F_v/F_m)和实际光合作用效率(Y Ⅱ)的影响如图 3所示. 第1 d时，对照组和处理组的F_v/F_m均在 0.6左右波动，第4 d时，F_v/F_m的值急剧上升，

接近0.8，可能原因是藻进入新环境引起F_v/F_m和Y Ⅱ 下降，需1~4 d的适应期，才可能恢复； 第4~10 d，对照和各处理组变化不是特别明显，保持在近0.8，而对照组和0.4 g L^-1的浸出液浓度作用下的处理组，在第10 d 后开始呈略微的下降趋势，在第15 d,其F_v/F_m分别为0.63和0.68[图 3(a)]. 各荔枝落叶浸出液处理组的Y Ⅱ 值与F_v/F_m值呈现相同的变化趋势，但相对来讲，Y Ⅱ 值比

F_v/F_m值较小[图 3(b)]. H₂O₂^[20]、 铜离子^[21]和铁离子^[22]的环境压力引起藻细胞光化学量子产量降低，高剂量UV-C辐照能完全抑制藻的能量转化过程^[23]. 本研究表明，浸出液可能在早期影响光合作用活性，在后期影响不大，甚至有轻微的促进作用. 这种差异的原因可能与实验中所用的实验材料、 藻起始密度、 藻株、 浸出液的种类和浓度等不同有关.

图 3

Fig. 3

图 3 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻PS Ⅱ 最大和有效光合作用效率的影响 Fig. 3 Time courses of the maximal efficiency (Fv/Fm) and efficiency of photosystem Ⅱ (Y Ⅱ) of M. aeruginosa in different extract treatments

将各测量光强度下的光合电子相对电子传递速率值与光强度绘图，可得到快速光曲线，由快速光曲线得到光合活性参数，包括光能利用效率α、 最大相对电子传递速率rETRmax、 光饱和系数Ik，结果如图 4所示. 对照和处理组的α值变化不大，保持在0.2~0.3 m² ·s ·μmol^-1之间，对照组和低浓度处理组0.4 mg ·L^-1分别从第7 d和第10 d开始下降，但下降幅度不明显[图 4(a)]，且与落叶浸出液浓度存在一定的正相关性，相关系数为0.843(表 1)； 无论是处理还是对照组，rETRmax值从第4 d时开始均表现上升，至第15 d时，由起始的100左右上升到150~200之间[图 4(b)]，且与落叶浸出液浓度存在一定的负相关性，相关系数为-0.866； Ik值分别由第1 d的450~500 μmol ·(m² ·s)^-1开始，升高至500~1000 μmol ·(m² ·s)^-1之间[图 4(c)]，且与落叶浸出液浓度存在一定的负相关性，相关系数为-0.871. 以上结果表明，荔枝落叶浸出液能影响藻细胞光合活性，Ik值与rETRmax值的降低与荔枝落叶浸出液之间呈现显著负相关关系，而α值的降低与荔枝落叶浸出液之间呈现正相关关系.

图 4

Fig. 4

图 4 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻光合活性参数的影响 Fig. 4 Changes of the photosynthesis efficiency (α),maximal electron transport rates (rETRmax) and light saturation coefficient (Ik) of M. aeruginosa against in different extract treatments

表 1(Table 1)

表 1 铜绿微囊藻叶绿素荧光参数、 叶绿素a浓度与荔枝落叶浸出液浓度的相关系数 1) Table 1 Correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters,and chlorophyll-a content of M. aeruginosa with the L. chinensis defoliation extract 作用时间/d Fv/Fm Y Ⅱ α rETRmax Ik 叶绿素a浓度 1 -0.598 0.828* 0.781 -0.024 -0.348 -0.013 4 -0.618 -0.663 0.393 0.013 0.027 -0.761 7 0.000 -0.900* 0.207 -0.850* -0.853* -0.874* 10 0.085 -0.284 0.319 -0.850** -0.964** -0.859* 15 0.799 0.655 0.843* -0.866* -0.871* -0.939** 1)**表示极显著相关，*表示显著相关

表 1 铜绿微囊藻叶绿素荧光参数、 叶绿素a浓度与荔枝落叶浸出液浓度的相关系数 1) Table 1 Correlation coefficients of chlorophyll fluorescence parameters,and chlorophyll-a content of M. aeruginosa with the L. chinensis defoliation extract

5项荧光参数和叶绿素a浓度与荔枝落叶浸出液浓度相关性分析如表 1所示，从中可知，铜绿微囊藻的叶绿素a浓度与浸出液浓度由负相关转为极显著负相关，rETRmax和Ik与浸出液浓度基本由负相关转为显著负相关，可能原因是浸出液中化感物质释放或作用滞后等原因引起的； F_v/F_m和Y Ⅱ与浸出液浓度基本由负相关转为正相关关系，可能在胁迫早期，微囊藻的F_v/F_m和Y Ⅱ受到抑制，浸出液抑制了光合作用的原初反应，阻碍光合电子的传递，后期藻适应了这种胁迫^{[24, 25]}，从浸出液对光合作用效率的影响(见图 3)也可以看出； 相反，光能利用效率α与浸出液浓度一直保持正相关或显著正相关关系，可能在浸出液胁迫环境下，藻类可通过提高自身的光能利用率度过胁迫环境，这在UV-C辐照胁迫环境下，α值与 UV-C 辐照剂量之间呈现显著正相关关系结果类似^[23]. 然而，桉树叶水浸出液对海洋微藻的光合作用影响结果表明，荧光参数F_v/F_m、 Y Ⅱ和ETR均由正相关变成负相关的变化趋势^[26]，可能原因是实验中所用的藻株、 浸出液的种类和浓度等不同有关. 2.6 荔枝落叶浸出液对铜绿微囊藻三维荧光的影响

三维荧光光谱能够在不破坏样品结构的前提下，直观地反映荧光物质的种类和相对含量信息^{[27, 28, 29]}. 本研究采用三维荧光光谱，研究细胞水平上荔枝落叶浸出液对于藻细胞光谱的影响. 如图 5所示，对照组谱图中主要包括1个荧光峰，主要为溶解性微生物代谢物被释放至水体中，位于激发/发射波长275/340 nm附近，可能为色氨酸及酪氨酸的荧光峰^[30]，第15 d的荧光强度约为第1 d的2倍. 荔枝落叶浸出液的添加，谱图中除出现色氨酸及酪氨酸的荧光峰外，另一处腐殖酸对应的荧光峰(位于320/430 nm附近)，与预氯化会导致荧光峰强度和位置的变化^[31]相同，荔枝落叶浸出液同样会引起荧光峰强度和位置发生变化，当投量从1.2 g ·L^-1升高至2.0 g ·L^-1时，色氨酸及酪氨酸的荧光峰相对强度有所上升，且位置发生偏移，在投量增加的情况下，腐殖酸的对应荧光峰强度增加，第15 d时，在投量为2.0 g ·L^-1时，色氨酸及酪氨酸荧光峰强度约为1.2 g ·L^-1投量情况下的1/3，同时腐殖酸的荧光峰强度随着时间的推移逐渐减弱，可能该类物质为易降解的缘故，而且结果与落叶投量对藻细胞叶绿素a浓度的影响趋势是一致的.

图 5

Fig. 5

图 5 荔枝落叶浸出液在第1、 7和15 d铜绿微囊藻的三维荧光图谱 Fig. 5 EEM spectra of M. aeruginosa after 1,7 and 15 d exposure to the L. chinensis defoliation extract

EC₅₀称作半最大效应浓度，指能引起50%最大效应的浓度. 表 2为铜绿微囊藻的EC₅₀值在荔枝落叶浸出液胁迫下的情况，从中可知，在不同的时间，藻的EC₅₀值有区别，其中在第1 d时，EC₅₀最大，表明浸出液对藻的毒性最小，可能是浸出液的毒性还没有表现，或还没有影响到藻的生物量的原因，在第4 d时EC₅₀最小，代表此时毒性最大，表明为对藻生长的抑制能力最强，随着时间的延长，EC₅₀逐渐增大，浸出液的毒性减弱，有可能是浸出液中含有的化感物质逐渐分解，或者微藻对浸出液的适应性增强的原因，这与桉树叶水浸出液对海洋微藻的EC₅₀影响的研究结果比较一致^[26]. 已有研究指出，农作物秸秆-稻杆只需进行5 d 降解，即可产生与大麦秸杆3个月降解相似程度的抑藻效果^[32]，本研究结果表明，荔枝落叶也仅需5 d降解，而且第15 d的EC₅₀值约为稻杆或大麦秸杆1/4~1/5，因此，只需投入更少量的荔枝落叶而能达到较好的控藻效果，减少水体营养盐的增加.

表 2(Table 2)

表 2 铜绿微囊藻细胞生长在1、 4、 7、 10、 15 d的EC50值 Table 2 EC50 of cell growth of M. aeruginosa after 1,4,7,10 and 15 d exposure to the L. chinensis defoliation extract 检测项目 EC50/g ·L-1 1 d 4 d 7 d 10 d 15 d 叶绿素a浓度 2.78 0.14 0.42 0.43 1.26

表 2 铜绿微囊藻细胞生长在1、 4、 7、 10、 15 d的EC50值 Table 2 EC50 of cell growth of M. aeruginosa after 1,4,7,10 and 15 d exposure to the L. chinensis defoliation extract

(1) 不同浓度荔枝落叶浸出液处理铜绿微囊藻时，随着暴露时间的延长抑制效果呈先增强后下滑的趋势，当浸出液在较高浓度时，第15 d抑制率高达80%以上，然而，叶绿素a实际浓度依然较高，仍可能发生水华，建议野外控藻应用时，应考虑持续或反复添加浸出液.

(2) 荧光参数与荔枝落叶浸出液浓度相关性分析表明，F_v/F_m和Y Ⅱ与浸出液浓度由负相关转为正相关关系，浸出液可能早期对藻光合作用发生胁迫，后期藻适应了这种胁迫的缘故； α与浸出液浓度保持正相关关系，藻可能通过提高光能利用效率来度过胁迫环境； rETRmax、 Ik和叶绿素a浓度与浸出液浓度基本由负相关转为显著负相关或极显著负相关关系，表明浸出液中化感物质可能释放或作用滞后等原因引起的.

(3) 三维荧光图谱分析表明，荔枝落叶浸出液的投加会引起色氨酸及酪氨酸的荧光峰相对强度有所上升，且位置发生偏移，较高投量的情况下，能有效抑制与铜绿微囊藻生长密切相关的色氨酸及酪氨酸荧光峰强度，同时腐殖酸的荧光峰强度随着时间的推移逐渐减弱，可能该类物质为易降解物质并逐渐降解的缘故.

(4) 研究藻细胞生长的半抑制浓度值发现，第4 d的EC₅₀最小，代表此时毒性最大，与传统的农作物秸秆控藻比较，其EC₅₀值较低，可能荔枝落叶化感作用控藻效果较强，只需较低的浸出液浓度就能达到较好的控藻效果.