活性污泥法是低成本、 稳定处理工业废水的有效途径^[1,2]，但伴随的问题是产生大量的剩余污泥^[3]. 城市污水厂的剩余污泥危害尚小，而处理工业废水的剩余污泥多被列于危险废弃物^[4]，其处理、 处置的安全标准更为严格. 氯酚类化合物(chlorophenols,CPs)作为生物杀虫剂、 木材防腐剂、 染料、 除锈剂等产品的主要成分，在工业应用中可对环境造成严重污染^[5]. 已有研究表明，活性污泥经驯化可有效处理此类废水^[6,7]，但处理过程所产生的剩余污泥毒性显著. 工程中，对污泥浓缩、 脱水环节所产生的提取液或上清液的处理模式是回流到原污水处理系统，进行再处理. 由于处理此类废水的污泥毒性较高，故其浓缩上清液或脱水提取液也含有显著毒性，势必对原有的污水处理过程造成影响.

小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是地球上最早的生命之一. 因其光合速率高^[8]，繁殖速度快，分布范围广^[9]，抗污能力强^[10]，是对有机物耐受性最强的8种藻之一^[11]，在污水处理中有着广泛的应用^[12]. 而且，由于小球藻在生长过程中可以在细胞内积累油脂^[13]，在可持续能源领域也有着广阔的前景^[14].

本研究利用活性污泥法处理含4-CP模拟废水的剩余污泥提取液和上清液分别与小球藻BG-11培养基联合用于培养普通小球藻(Chlorella vulgaris)，考察藻细胞数目、 叶绿素a、 藻细胞酶活性、 油脂、 液相TN、 TP、 TOC、 毒性等指标. 通过资源化利用的方式来处理工业废水污泥浓缩池的上清液和脱水提取液，以期为小球藻低成本培养提供技术支持.

1 材料与方法 1.1 试验设计

试验用培养基的制备过程见图 1.

图 1

Fig. 1

图 1 试验用培养基的制备流程 Fig. 1 Process of preparation for the culture medium

剩余污泥： 投加50 mg ·L^-1 4-CP模拟废水至序批式活性污泥法(SBR)反应系统，水力停留时间8 h，泥龄20 d.

污泥上清液： 即为剩余污泥的孔隙水，取剩余污泥离心(5000 r ·min^-1，5 min)，得污泥固体和污泥上清液.

污泥提取液： 即为剩余污泥的胞内物质，用超纯水离心清洗污泥固体3次，以去除剩余污泥孔隙水的影响，然后添加超纯水至原泥水混合液相同的体积. 超声破胞^[15](300W超声仪运行1 s，停止1 s破胞10 min)，离心(12000 r ·min^-1，10 min)后得污泥提取液.

混合： 将污泥提取液和上清液分别与不同比例BG-11混合后121℃灭菌30 min备用. 培养基配比及各组分含量见表 1. 污泥提取液(TN： 49.65 mg ·L^-1、 TP： 11.17 mg ·L^-1、 TOC： 196.66 mg ·L^-1)相对于BG-11培养基(TN： 170.21 mg ·L^-1、 TP： 5.05 mg ·L^-1、 TOC： 21.84 mg ·L^-1)，氮少磷多有机碳多，而上清液氮磷碳含量均较低(TN： 26.80 mg ·L^-1、 TP： 1.96 mg ·L^-1、 TOC： 25.60 mg ·L^-1)； 污泥提取液因包含大量微生物细胞破胞产物而TOC含量丰富(接近200 mg ·L^-1)，相对而言，上清液中TOC含量很少(约为20 mg ·L^-1).

表 1(Table 1)

表 1 培养基配比及各组分含量 Table 1 Initial sludge extract and BG-11 components and contents 序号 BG-11/% 污泥提取液/% 污泥上清液/% 初始TN/mg·L-1 初始TP/mg·L-1 初始TOC/mg·L-1 0 100 0 0 170.21±4.09 5.05±0.15 21.84±0.92 1 50 50 0 110.63±3.15 7.26±0.21 106.27±4.14 2 0 100 0 49.65±1.91 11.17±0.89 196.66±1.69 3 50 0 50 98.67±2.35 2.87±0.30 20.74±1.08 4 0 0 100 26.80±0.66 1.96±0.20 25.60±0.59

表 1 培养基配比及各组分含量 Table 1 Initial sludge extract and BG-11 components and contents

试验中各指标的主要分析测定方法见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 试验过程中分析测定方法 Table 2 Analytical methods in the experiment 项目 测定指标 测定方法 主要仪器 细胞密度 血球计数 光学显微镜 叶绿素a 分光光度法[16,17] 分光光度计 生长指标 CAT 试剂盒 分光光度计 SOD 试剂盒 分光光度计 油脂 尼罗红染色法[18,19] 荧光分光光度计 TN 碱性过硫酸钾消解法紫外分光光度法 紫外分光光度计 水相指标 TP 钼酸盐分光光度法 分光光度计 TOC 非色散红外线吸收法 TOC测定仪 毒性 T3明亮发光杆菌法[20] 生物毒性测试仪

表 2 试验过程中分析测定方法 Table 2 Analytical methods in the experiment

普通小球藻(Chlorella vulgaris,FACHB-31)，购自中国科学院武汉水生生物研究所； T3明亮发光杆菌购自中科院南京土壤研究所，CAT、 SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所(南京建成生物有限公司)； 尼罗红购自阿拉丁试剂有限公司，其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司.

斯必克公司博迅光照培养箱SPX-250B-G，麦克迪奥(厦门)公司MOTIC光学显微镜BA200，天美(中国)科学仪器有限公司Techcomp分光光度计UV1102，中科院南京土壤研究所DXY-2型生物毒性测试仪，德国SRK公司TOC测定仪GO-TOC 1000，美国VARIAN公司Cary Eclipse型荧光分光光度计，上海颖和超声设备有限公司NA1860超声清洗机控制器. 1.4 试验方法

试验设置5组，每组3个平行样. 将普通小球藻接种到表 1所示培养基中(取培养5 d时处于对数生长期的藻液接种，初始接种浓度为培养基总体积的10%，细胞密度约1.5×10⁶个 ·mL^-1). 光照培养箱温度25℃，光暗比14 ∶10，光照度2000 lx，培养10 d. 第0、 2、 5、 8、 10 d各取样一次，测定藻细胞数目、 叶绿素a，细胞酶活性，中性油脂、 液相TN、 TP、 TOC、 毒性的变化趋势.

由公式(1)计算TN，TP，TOC的去除率

由公式(2)计算液相毒性相对抑制率

2 结果与讨论 2.1 液相营养物质及毒性的去除

根据相关试验数据，作出TN、 TP、 TOC含量随时间的变化趋势图，如图 2所示. 用T3明亮发光杆菌测试各组离心后液相的毒性，以其亮度表征其毒性情况，再以BG-11组作为参比，用试验组的毒性相对抑制率/BG-11空白组的毒性相对抑制率来表征毒性，反映试验各组液相的毒性变化情况，结果如图 3所示.

图 2

Fig. 2

图 2 培养基中TP、 TN、 TOC变化趋势 Fig. 2 Variation trend of the TP,TN and TOC

图 3

Fig. 3

图 3 试验组相对空白组的毒性变化 Fig. 3 Variation of toxicity of experimental groups compared with the blank group

由图 2(a)可以看出，污泥提取液和上清液中的TN含量少于BG-11空白组. 各组TN在前4 d内去除率较大，第5 d后小球藻对TN的吸收速率下降，TN水平趋于稳定； 此阶段，各组TN去除率分别达到59.28%、 48.27%、 56.50%、 42.47%、 100%，均达到了40%以上，说明小球藻对污泥提取液和上清液中的TN均有一定的去除能力. 该结果与吕福荣等^[21]研究提出的“ 随着时间的延长，小球藻对氮的吸收逐渐稳定”相一致，但本研究中小球藻对TN的吸收在4~5 d后才趋于稳定，与文献^[21]所述“ 小球藻对氮的吸收2 d内可以达到较大值”有显著差异. 这主要是因为在吕福荣的试验中初始接种量为20%，并且氮源的形态比较单一(氨氮)； 而本试验中的接种量为10%，氮的形式因BG-11中主要为硝酸盐氮，污泥提取液与上清液中氮的形态多样^[22](以有机氮为主，其次是氨氮，微量无机氮)，邢丽贞^[23]的研究中也提出小球藻对不同氮源吸收能力不同，其吸收的顺序为： 氨氮>简单有机氮>硝态氮和亚硝态氮，综上分析认为是接种量与氮的形态不同导致了这样的差异.

由图 2(b)可以看出，污泥提取液中的TP含量高，而上清液中的TP含量较低. 与图 2(a)所不同的是，小球藻对TP的吸收是持续进行的，并未在某个时间点后趋于稳定. 培养后试验各组TP减少的绝对量分别为4.64、 6.89、 11.16、 2.33和1.77 mg ·L^-1，小球藻对于TP的吸收并无“饱和”值，并且初始磷含量越多，小球藻对其去除的绝对量越大. 经过10 d培养，各试验组的TP含量均低于0.5 mg ·L^-1，可达到国家城镇污水厂一级A类排放标准(GB 18918-2002).

小球藻既能进行光合自养生长又可利用有机碳进行异养生长^[24]. 由图 2(c)可以看出，在试验1、 2组中，小球藻在2 d内迅速利用了培养基中的有机质，随着时间的推移对TOC的降解速率开始下降. 培养结束后，试验1、 2组的TOC去除率分别为72.14%和61.75%，去除效果较好. 空白组和提取液组的TOC没有明显的变化并且有时出现反复，张国治等^[25]的研究中也有类似结论，TOC含量越高，其去除率越高，TOC较低时，去除效果不明显.

结合图 3可看出，在未接种藻液前，各组的毒性均大于BG-11空白组，接种藻液后的第2 d，各组的毒性都有了明显的下降，第5 d时，各组毒性则明显小于BG-11空白组，说明藻细胞对培养基中的毒性物质有显著的去除效能，Lin等^[26]研究亦证明垃圾渗滤液对植物的毒性随藻类的生长而降低. 第8 d和第10 d的液相毒性有所增高，可能是因为随着培养时间的延长，液相积累了小球藻的胞外分泌物，对发光杆菌具有一定的抑制.

综合来看，小球藻对污泥提取液和上清液中的TN、 TP的去除率分别达到了40%和90%以上. 对于含污泥提取液的试验组，小球藻也可以异养生长有效去除TOC，这说明利用小球藻去除污泥中的营养物质是可行的； 另外小球藻可有效消除污泥提取液和上清液的毒性，为有毒剩余污泥上清液或提取液的合理处理和资源化利用提供了新的思路. 2.2 小球藻的生长特性

以藻细胞密度和单位藻细胞内的叶绿素a含量表征小球藻的生长情况，做出试验各组小球藻生长特性随时间的变化，如图 4所示.

图 4

Fig. 4

图 4 藻细胞密度与单位藻细胞内叶绿素a的变化 Fig. 4 Variation of the density of Chlorella vulgaris and the content of Chlorophyll per cell

由图 4(a)可以看出，添加50%污泥提取液的试验组中小球藻长势最好，藻细胞密度始终高于BG-11组，最终达到(35.29±3.74)×10⁶个 ·mL^-1； 其次是纯污泥提取液的试验组，但从第5 d起，该组小球藻增长速率开始下降，分析认为是提取液组缺少了BG-11所提供的某些微藻生长所需微量物质，导致对微藻生长产生抑制. 添加50%上清液组的小球藻增长趋势与BG-11组基本一致； 纯上清液组小球藻的长势始终较BG-11组差.

图 4(b)反映了单位藻细胞的叶绿素a含量变化. 从图 4(b)可知，单位藻细胞的叶绿素a含量基本呈先降后升的趋势. 接种藻细胞之时，每组单位藻细胞的叶绿素a含量基本一致，第2 d则普遍下降，而此时藻密度仍在增加，这说明小球藻内叶绿素a含量的增长速率滞后于藻细胞数目的增长速率. 由图 4(b)可以看出，从第5 d开始，纯污泥提取液与上清液组的单位藻细胞的叶绿素a含量均明显小于BG-11空白组； 50%污泥提取液组的单位藻细胞的叶绿素a含量高于其对应的纯污泥提取液组； 而50%污泥上清液组的单位藻细胞的叶绿素a含量不仅高于其所对应的纯污泥上清液组，而且与BG-11空白组的值比较接近. 这表明，添加一定比例的BG-11培养基分别与污泥提取液和上清液混合作为培养基有利于藻细胞内叶绿素a的积累. 分析认为，污泥提取液和上清液中的氮源不利于叶绿素a的生成； BG-11中添加的氮源为硝态氮，而硝态氮是除尿素外最利于小球藻内叶绿素a积累的氮源^[27].

取离心后的小球藻研磨，用缓冲溶液稀释，用SOD试剂盒测试，做出各组SOD酶随时间的变化趋势，以观察小球藻胞内物质对外界环境的响应情况. 取离心后的小球藻加入尼罗红染色，测定其相对荧光强度，以观察小球藻内油脂的积累情况.

如图 5所示，接种小球藻的第0 d，各试验组单位细胞内的SOD值均较高，这说明小球藻接种到一个新环境，新环境的物质对小球藻造成了抑制-响应； 相对于BG-11空白组[(5.68±0.29) U ·mL^-1]来说，纯污泥提取液组[(6.35±0.10)U ·mL^-1]和纯污泥上清液组[(5.88±0.14)U ·mL^-1]的单位藻细胞内SOD值较高，说明污泥提取液和上清液中所含的毒性物质对藻细胞抑制较强，藻细胞通过分泌更多的应激酶以自我调节. 接种第2 d，各试验组的单位藻细胞内SOD值均出现明显下降，之后均保持在较低水平. 这说明，小球藻已经适应了污泥提取液和上清液中的毒性物质，即小球藻可以通过胞内物质的作用有效地降低水相毒性.

图 5

Fig. 5

图 5 试验各组单位藻细胞内的SOD随时间的变化 Fig. 5 Variation of the SOD in per cell of each group

如图 6所示，各试验组的油脂积累都经历了先降后升再降的过程，均在第5 d达到了最大油脂积累量，其中添加50%上清液组的油脂积累量与BG-11空白组持平(相对荧光强度分别为364.64±14.73和361.04±17.31)，纯上清液试验组的油脂积累量略低(相对荧光强度为337.64±10.07)，纯污泥提取液组的油脂积累量最低(相对荧光强度为297.67±17.31). 这说明，污泥上清液养藻对其油脂积累影响较小，而以污泥提取液养藻时，油脂积累效果略差. 但结合经济指标分析，上清液和提取液养藻皆具有一定的可行性. 以污泥上清液养藻时，以油脂积累衡量最优的培养时间是5~8 d； 而以污泥提取液作为培养基养藻时，油脂积累最优的培养时间为5 d.

图 6

Fig. 6

图 6 试验各组油脂相对荧光强度随时间的变化 Fig. 6 Variation of neutral oil of each group

(1)小球藻可有效地去除污泥提取液和上清液中的氮、 磷、 有机碳等物质，也可有效消减液相毒性，有望解决工业废水生物处理后剩余污泥提取液和上清液的安全处理问题.

(2)小球藻利用剩余污泥中的营养物质完成了自身的增殖，并积累了油脂，可提供低成本养藻途径，可解决目前自来水养藻成本高，投入高的问题，也为小球藻与剩余污泥提取液和上清液的共资源化处理与利用提供了新方法.

(3)综合来看，利用剩余污泥培养小球藻的过程中，第5 d不仅可以达到对剩余污泥中营养物质和毒性的有效去除，而且可获得油脂的最大积累，是二者共资源化利用的最佳时段.