多环芳烃(PAHs)化合物具有潜在的致癌作用^[1,2]. 土壤中的PAHs主要来源于污水灌溉、大气沉降和泄漏事故等^[3]，PAHs可在农作物中富集从而进入食物链威胁人类健康^[4]，亦可通过环境循环进入大气和水体中，造成二次污染. 利用微生物降解PAHs是一种安全和有效的处理方式^[5,6,7]. 萘是PAHs中结构最简单和分子量最小的物质，是研究PAHs降解的典型化合物之一. Evans等^[8]首先提出了萘降解过程的开环机制. 蔡宝立等^[9]从石油工业废水中分离出1株高效萘降解菌ND24，经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp. )，将该菌株添加到0.2 g ·dL^-1萘污染土壤中，经过14 d萘去除率为98.2%. Zhao等^[10]研究了斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri ZP2)，其能以萘、菲和吐温80为唯一碳源生长，对250 mg ·L^-1菲6 d降解率为96%，但是不能降解4环及4环以上的PAHs. 白智勇等^[11]研究了实验室保存的从石油污染的土壤中筛选出的两株萘降解菌——短芽孢杆菌(Bacillus brevis)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，发现酸性环境不利于短芽孢杆菌，而碱性环境不利于鞘氨醇单胞菌，两种菌混合后对彼此的生长及污染物的降解存在抑制作用. 郑蕾等^[12]研究了抑菌和未抑菌条件下菲、蒽、芘在土壤中的迁移过程，结果表明微生物通过阻滞作用和降解作用影响PAHs的迁移，菲、蒽和芘在土壤中都能被土著微生物降解. 李春霞^[13]从吉林省松原油田PAHs污染土壤中分离得到1株高效降解萘的菌株，利用该菌株对实际污染土壤样品中萘进行降解,测得其对实际样品中萘的降解率为60.4%. 刘芳等^[14]研究证实了通过外加营养物可以提高菌株对PAHs的降解能力，没有出现竞争作用而抑制微生物对PAHs的降解.

分子生物学技术的发展为构建和强化微生物降解土壤中有机污染物的过程提供了高效工具. 吴作军^[15]研究了微生物分子生态学技术在石油污染土壤修复中的应用，结果表明在接种微生物的同时添加麦秸所获得的真菌和细菌的数量最多，分别达到5.5×10³ g^-1和4.6×10⁷ g^-1；微生态分析结果还显示了不同的修复操作所获得的土壤微生态组成上的差异. Zou等^[16]将土壤微生态学方法和技术用于研究TNT污染土壤生物修复过程，功能基因及16S rRNA基因信息表明，降解菌Thu-Z能在土壤中长期存活，采用高通量测序和荧光定量PCR对特定种属基因及功能基因定量分析，结果表明修复过程均是通过提高了土著γ变形菌，β变形菌数量与代谢活性加速TNT降解. 吴彬彬等^[17]采用实时定量PCR技术对生物修复过程中土壤氮循环基因nifH、narG和amoA的拷贝数进行检测，结果表明污染土壤中这3种基因拷贝数明显低于正常土壤，修复后土壤与正常土壤接近，同时添加秸秆和菌剂的土壤经过40d处理后，其nifH、narG和amoA基因拷贝数分别恢复到2.68×10⁶、1.71×10⁶和8.54×10⁴g^-1. 上述研究成果表明：采用分子生物学方法来解析参与土壤生物修复过程的微生物群体，可揭开微生物修复污染土壤过程的黑箱，为过程强化提供了依据.

本研究从柴油污染土壤中筛选分离出1株降解萘的铜绿假单胞菌HD-5，目前铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物降解研究多限于菌株分离鉴定、降解条件和降解效率等方面^[18]，对于降解基因方面的研究报道较少^[19]，本研究对功能基因进行PCR扩增证实该菌株中含有萘双加氧酶基因nah，并运用定量PCR的方法监测自然衰减修复、生物刺激修复、生物强化修复以及生物刺激和生物强化相结合的联合修复萘污染土壤的过程中nah基因和16S rRNA基因的变化，同时测定了土壤的FDA水解酶活和脱氢酶活，对比了不同修复策略中萘降解效果与土壤微生态的变化，以期为土壤修复过程强化提供了依据. 1 材料与方法 1.1 菌种来源

铜绿假单胞菌HD-5从河北省邯郸市的柴油污染土壤中筛选得到. 1.2 土壤来源

供试土壤来自清华大学校内蔬菜种植区土壤，经2 mm筛处理后备用. 土壤样品经北京农林科学院植物营养与资源研究所检测，其理化性质见表 1. 萘用正己烷溶解后添加到土壤中配置成萘污染土壤(萘质量分数为0.5%)，待正己烷挥发完毕后使用.

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤主要理化性质 Table 1 Main physical and chemical properties of the tested soil 理化指标 全氮 /g·kg-1 有机质 /g·kg-1 碱解氮 /mg·kg-1 有效铵态氮 /mg·kg-1 有效硝态氮 /mg·kg-1 有效磷 /mg·kg-1 速效钾 /mg·kg-1 全盐 /mg·kg-1 电导率 /mS·m-1 pH 数值 0.816 16.9 81.6 10.9 17.0 4.5 134 0.81 20.1 8.51

表 1 供试土壤主要理化性质 Table 1 Main physical and chemical properties of the tested soil

萘(纯度99%，Sigma-Aldrich)；丙酮、正己烷(分析纯，北京化工厂).

LB 培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌15 min，保存备用.

无机盐培养基(MSM)：KH₂PO₄ 1.0 g，K₂HPO₄ 1.0 g，NH₄NO₃ 1.0 g，MgSO₄ 0.5 g，CaCl₂ 0.01 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌15 min，保存备用.

萘选择性培养基：用正己烷配置1 g ·L^-1的萘溶液，过滤除菌后取一定量添加到MSM培养基中，待正己烷挥发完毕后备用.

在上述培养基中加入2%琼脂即可得相应的固体培养基. 1.4 降解菌的筛选^[20]与鉴定

取河北邯郸柴油污染土壤样品10 g加入到100 mL MSM培养基中，30℃和170 r ·min^-1条件下培养4 h. 将含有土壤的MSM悬浊液在3 000 r ·min^-1下离心5 min，将10 mL上清液加入到100 mL萘选择性液体培养基中经4代培养后(萘浓度从50mg ·L^-1提高至200mg ·L^-1)，取适量培养液稀释涂布在萘选择性固体平板上，待有明显菌落出现时从中选取大小、形态各异的菌落在LB固体培养基上进行进一步划线纯化分离. 将各纯化后的菌株接种在萘选择性液体培养基中观察其生长情况，将生长情况良好的菌株制备成菌悬液接种到含萘0.5%的200 g自配污染土壤中，将土壤样品置于25℃人工气候培养箱中，每天翻动土壤并加入去离子水使土壤含水量为(20±2)%，10 d后测定土壤中萘含量，选取降解率最高的菌作为高效萘降解菌.

菌株的鉴定工作委托中美泰和生物技术(北京)有限公司完成，测定细菌的16S rDNA序列并在数据库中比对，获得与其同源性最高的已知序列，由此确定其分类. 菌株的生理生化特性的测定方法见文献^[21]. 1.5 菌株生长曲线与萘含量的测定

将各纯化后的菌株接种在萘选择性液体培养基中，于30℃和170 r ·min^-1条件下培养，间隔一定时间取4 mL培养液，采用紫外分光光度计(惠普6010)测定其在600 nm处的吸光度值，由此来表征培养液中菌体浓度.

土壤中的萘用丙酮和正己烷混合溶剂(1 ∶1)作为萃取剂，采用微波萃取仪(MARSX，CEM) 进行萃取. 萃取后溶液用GC-2010气相色谱仪(Shimadzu Inc.，日本)测定其峰面积，对照萘标准曲线求样品中萘含量. 气相色谱条件：进样口温度300℃，检测器温度330℃，毛细管柱(50 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温130℃保持3 min，梯度升温15℃ ·min^-1至280℃，进样量为1 μL. 1.6 土壤样品设置

设计了5种萘污染土壤的生物修复方式，在每份600 g土壤中加入萘(溶于正己烷)，使萘含量为0.5%(灭菌空白对照组先灭菌，后加萘). ①灭菌空白对照组(C)：将土壤装于锥形瓶中于121℃下灭菌15 min，共2次；②自然衰减对照组(N)：不做任何处理；③生物强化组(B)：取HD-5菌悬液离心，用生理盐水重悬后调节至D600值为1.0，取30 mL添加到土壤中；④生物刺激组(S)：按照C ∶N ∶P为100 ∶1.25 ∶1向土壤中添加含KH₂PO₄、NH₄NO₃营养液30 mL；⑤生物刺激+生物强化组(BS)：向土壤中同时添加重悬菌液30 mL及营养液30 mL.

将上述5种不同处理后的土壤体系置于25℃人工气候培养箱中，过夜后作为实验起始点，每天翻动土壤并加入去离子水使土壤含水量为(20±2)%. 1.7 土壤FDA水解酶活及脱氢酶活的测定 1.7.1 FDA水解酶活

以20 min内每g土产生的荧光素含量来表征土壤中FDA水解酶活性. 具体操作如下^[22]：将2 g土壤置于含有15 mL磷酸钾缓冲液(60 mmol ·L^-1，pH 7.6)的50 mL离心管中，加入200 μL浓度为1 mg ·mL^-1的荧光素二乙酯丙酮溶液，密封后振荡5 s；将离心管置于30℃，175 r ·min^-1摇床中振荡反应，20 min后加入15 mL氯仿/甲醇(2 ∶1)终止反应；8 000 r ·min^-1下离心，取上清液并测定490 nm下的吸光度值. 1.7.2 脱氢酶活

通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性以确定微生物对有机污染物的氧化分解能力，具体方法为^[23]：取1 g土壤于离心管中，加入0.1 mol ·L^-1葡萄糖溶液和0.5% TTC(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride)各2 mL，充分振荡后，在37℃下145 r ·min^-1摇床中培养12 h后加入5 mL丙酮，充分振荡，将有机相过滤后测量其在486 nm处的吸光度值，以每g土12 h内生成的红色TPF的含量来表征土壤中细菌脱氢酶活性. 1.8 土壤中16S rRNA与nah基因拷贝数的监测

采用Baldwin等^[24]2003年报道的萘双加氧酶基因nah的简并引物nahf/nahr对其进行PCR，用细菌DNA提取试剂盒(Tiangen)对菌株DNA进行提取. nahf和nahr的特异性引物分别为 CAAAARCACCTGATTYATGG和 AYRCGRGSGACTT CTTTCAA. 总PCR反应体积为20 μL，体系组成为：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol ·L^-1 的前后端引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 6 μL. PCR扩增条件为：95℃ 10 min，1个循环；95℃ 1 min，49℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环.

采用ABI 7300(Applied Biosystems)荧光定量PCR仪对土壤中的细菌16S rRNA、萘双加氧酶基因(nah)拷贝数进行实时定量测量. 反应体系总体积20 μL，体系组成为：2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，10 μmol ·L^-1 的前后端引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 6.4 μL. 引物序列及扩增程序见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 分类基因序列及荧光定量PCR扩增程序 Table 2 Sequences of genes and programs of real-time PCR 引物名称 序列 扩增条件 16S rRNA[25] 926F 1062R AAACTCAAAKGAATTGACGG CTCACRRCACGAGCTGCTGAC 95℃ 1 min,1cycle，95℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，40 cycle，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s,1cycle nah[7] nahf nahr CAAAARCACCTGATTYATGG AYRCGRGSGACTTCTTTCAA 95℃ 10 min,1 cycle，95℃ 1 min，49℃ 1 min，72℃ 2 min，40 cycle，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s,1cycle

表 2 分类基因序列及荧光定量PCR扩增程序 Table 2 Sequences of genes and programs of real-time PCR

经过富集培养在萘选择性平板上得到6株能以萘为唯一碳源生长的菌株，分别命名为HD-1-HD-6，将其菌悬液分别接种(接种量为10%)至萘含量为50mg ·L^-1的100 mL MSM液体培养基中，其生长曲线如图 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 筛选菌株的生长曲线 Fig. 1 Growth curves of the bacterial strains isolated

图 1结果表明，菌株HD-5生长情况最好而菌株HD-4几乎没有生长. 将这5株菌的菌悬液分别加到萘含量为0.5%的200 g的污染土壤中，10 d后测定土壤中萘去除率. 由图 2可知：空白对照组萘去除率为49.35%，这是由于萘的强挥发性所致；加入菌株HD-1和HD-5的萘去除率分别为64.57%和66.28%，说明这两株菌能够降解土壤中的萘. 结合图 1和2的结果，后续工作选择HD-5作为萘降解菌株深入研究.

图 2

Fig. 2

图 2 加菌10 d后土壤中萘去除率 Fig. 2 Removal rate of naphthalene in soil with bacteria after 10 d

图 3给出了以16S rDNA序列为基础的系统发育树. 结果表明，菌株HD-5的16S rDNA与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的相似度达到99%，故鉴定其为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa). 对该菌株进行细菌总DNA的提取，接着进行萘双加氧酶基因(nah)的PCR扩增验证，实验结果如图 4所示. 结果表明，在筛选得到的萘降解菌HD-5中成功扩增出碱基对数为377的萘双加氧酶基因(nah). 对该菌进行简单生理生化实验，结果表明该菌为革兰阴性菌，菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖和木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖. 液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性.

图 3

Fig. 3

图 3 HD-5 16S rDNA基因系统发育树 Fig. 3 16S rDNA gene phylogenetic tree of HD-5

图 4

Fig. 4

M：Marker；NC：Blank；HD-5：P. aeruginosa图 4 降解菌中萘双加氧酶基因(nah)扩增电泳图 Fig. 4 Amplification electrophoresis figure of nah gene in naphthalene-degrading bacteria

采用自然衰减(N)、生物刺激(S)、生物强化(B)以及生物刺激与生物强化联合修复(BS)等对于萘含量为0.5%的土壤样品进行修复处理，修复操作时间为31 d，土壤中萘去除率随修复时间变化如图 5所示.

图 5

Fig. 5

图 5 不同修复措施下土壤样品中萘去除率随修复时间的变化 Fig. 5 Variation of removal rate of naphthalene with time in soil under different treatments

由图 5可知，灭菌对照组(C)中萘去除率为50.03%，这说明土壤中部分萘可以通过自然挥发而降低. N组中最终萘去除率为54.64%(4.61%刨除自然挥发)，这表明除了萘的自然挥发，土壤中土著微生物能够起的部分降解作用，但是降解能力不足. 通过向土壤中添加营养物质，S组中萘的去除率为62.22%(12.19%刨除自然挥发)，表明通过生物刺激可以有效地提高土壤土著菌群中具有潜在降解萘菌株的降解能力. 而在加入HD-5降解菌株之后，经过31 d处理，B组中萘去除率为71.94%(21.91%刨除自然挥发)，显著高于S组和N组，表明HD-5很好地发挥了降解土壤体系中萘的作用. BS组中最终萘去除率为83.14%(33.11%刨除自然挥发)，是降解效果最佳的一组. 从降解过程来看，前期与B组趋势相近，15 d之后去除率明显高于B组，表明营养物质的添加刺激了降解菌株以及土著微生物的生长，由此使萘的降解进一步提高. 2.3 不同土壤样品中酶活变化

图 6给出了不同处理修复方式中土壤FDA酶活和脱氢酶活的变化. 需要说明的是，由于在C组中对土壤采取了高温连续灭菌处理，并在整个实验中通过叠氮钠维持抑菌状态，无法检测其酶活和相关基因，因此后续研究中对比了其余4种修复方式的酶活与基因变化.

图 6

Fig. 6

图 6 不同生物修复方式下土壤中FDA和脱氢酶活变化 Fig. 6 Changes of FDA and dehydrogenase activities in soil under different bioremediation treatment

图 6(a)显示了土壤FDA酶活的变化. 结果表明，所有处理方式中，前8 d的FDA水解酶活均较低，这说明污染物萘对微生物活性有较大的影响. N组的FDA酶活一直维持在较低水平，这说明萘持续抑制污染土壤中微生物活性. B组中，FDA酶活前期较低，随着生物强化修复进行，FDA水解酶活逐渐增加. S组中，前8 d的FDA酶活与B组相同，随着生物刺激修复进行，FDA水解酶活性显著增加，这主要源于营养物质的添加刺激了土著微生物的增殖. 在BS组中，降解前期土壤中FDA水解酶活性就开始增加，这表明添加的外源菌很好地定植于污染土壤，在降解后期由于营养物质刺激了土著微生物，FDA水解酶活性显著增加. FDA水解酶活从侧面揭示了生物刺激修复措施能够较好地促进土壤微生物活性恢复. 水解酶活的变化规律也与萘降解过程呈正相关性，说明了微生物在降解过程中起到主要作用.

进一步考察了不同处理修复方式中土壤脱氢酶活的变化，结果如图 6(b)所示. 结果表明，在所有的处理过程中前4 d的时间内脱氢酶活均维持在较低水平. 之后N组中脱氢酶活没有明显变化，S组中脱氢酶活后期略有上升，而B组和BS组中脱氢酶活均显著升高，且BS组脱氢酶活高于B组. 这说明前期土壤中污染物的代谢主要由加入的降解菌来完成，后期由于生物刺激的作用使得土壤微生态得以恢复，土著降解菌群参与到污染物降解过程. 脱氢酶活的升高表示微生物降解污染物的能力加强，与降解率呈正相关性.

图 7

Fig. 7

图 7 土壤中总细菌数变化 Fig. 7 Dynamic changes of total bacteria count in soil with different treatments

土壤中细菌总数是评价土壤微生态的一个重要指标，通过定量PCR技术对16S rRNA基因拷贝数定量分析，可以较为准确地测定土壤中细菌的数量. 正常土壤中的细菌总数在10¹⁰-10¹¹数量级^[26]. 图 7给出了在不同生物修复方式下细菌总量随时间的变化.

从中可以看出，在N组中土壤细菌总量一直保持在较低水平，这是由于污染物萘的存在对土壤理化性质带来改变且带有毒性，导致微生物生长环境变差，不利于微生物代谢. 在B组中土壤细菌总量迅速增加，这表明降解菌可以在土壤中稳定存活. S组通过添加营养源使土壤中细菌总数快速增加，在第20 d达到10¹⁰ g^-1后基本维持不变. BS组中土壤细菌总数生长最快且达到最高水平，在第15 d达到10¹⁰ g^-1后继续上升至2.67×10¹¹ g^-1. 细菌数量的增大表明微生物间互相促进彼此生长，有利于对污染物的降解，与降解率呈正相关性.

对于萘等PAHs的降解途径经研究表明，降解过程需要分子氧的参与. 在反应的第一步，芳环的双加氧酶进行催化氧化，实现对芳环的开环作用. nah基因编码的萘双加氧酶是降解的关键酶. 图 8显示了不同生物修复过程中nah基因的变化情况.

图 8

Fig. 8

图 8 修复过程中土壤nah基因变化 Fig. 8 Dynamic changes of nah gene count in soil with different treatments

由图 8可以看出，在N组在前10 d略有提升，之后基本维持不变. B组及BS组在前期nah基因迅速增加，这是由于加入的降解菌中含有nah基因，这也验证了菌株HD-5在土壤中的存活情况. 其中BS组中nah基因增加最快且数量最多，B组紧随其后且变化趋势相近. 值得关注的是，S组的nah基因增加速度虽然低于B组，但是经过10 d生物刺激之后，土壤中的nah基因含量显著高于N组，这表明土著微生物中含有可以降解萘的不可培养微生物，通过生物刺激的方式可以显著增强其活性，从而达到降解污染物萘的目的. 因此通过分子生态学技术检测修复过程中降解基因的变化可以有效地指导修复策略的设计和降解微生物的筛选. 3 结论

从柴油污染土壤中分离出1株高效降解萘的菌株HD-5，经过16S rDNA序列分析将其鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，对其DNA进行PCR扩增验证，确定该菌株中含有萘双加氧酶基因nah. 在采用生物刺激与生物强化联合修复策略，即萘污染土壤中添加菌株HD-5和营养物质，经过31 d修复，在萘含量为0.5%的污染土壤中萘去除率达到83.14%,土壤FDA水解酶活和脱氢酶活有明显提高，通过实时定量PCR分析土壤中总细菌基因拷贝数和nah基因拷贝数，分别增长了约2.67×10¹¹ g^-1和8.67×10⁸ g^-1.