环境科学  2015, Vol. 36 Issue (1): 280-285   PDF    
引用本文
徐冬梅, 王彦华, 王楠, 饶桂维. 铜、毒死蜱单一与复合暴露对蚯蚓的毒性作用[J]. 环境科学, 2015, 36(1): 280-285.
XU Dong-mei, WANG Yan-hua, WANG Nan, RAO Gui-wei. Effects of Single and Co-Exposure of Cu and Chlorpyrifos on the Toxicity of Earthworm[J]. Environmental Science, 2015, 36(1): 280-285.
铜、毒死蜱单一与复合暴露对蚯蚓的毒性作用
徐冬梅1, 王彦华2, 王楠1, 饶桂维1    
1. 浙江树人大学生物与环境工程学院, 杭州 310015;
2. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021
收稿日期: 2014-04-09; 修订日期: 2014-08-11.
基金项目： 浙江省自然科学基金项目(LY13B070010,LY13C030006)
作者简介：徐冬梅(1974~),女,博士,教授,主要研究方向为生态毒理学,E-mail:dm25xu@163.com
摘要：土壤环境中重金属-农药复合污染已经对土壤生态和人类生存环境构成严重威胁. 其中重金属铜和有机磷农药毒死蜱作为土壤环境中两类常见的污染物,其复合污染的环境效应值得关注. 本文采用OECD标准滤纸接触法、人工土壤法研究了铜-毒死蜱单一及复合暴露对蚯蚓急性致死作用及回避行为的影响. 结果表明,滤纸法和人工土壤法Cu对蚯蚓急性毒性的48 h-LC50和14 d-LC50分别为2.23 μg·cm-2和496.05 mg·kg-1; 而毒死蜱对蚯蚓急性毒性的48 h-LC50和14 d-LC50分别为5.94 μg·cm-2 和186.07 mg·kg-1. 滤纸法和人工土壤法铜、毒死蜱浓度单位配比1:1时,铜、毒死蜱对蚯蚓急性毒性联合作用类型均近似表现为相加作用, 而毒性单位配比1:1的滤纸法和人工土壤法试验结果分别为协同作用和拮抗作用. 回避行为试验结果表明, 铜、毒死蜱对蚯蚓回避行为的联合作用类型为拮抗作用.
关键词： 铜     毒死蜱     复合暴露     蚯蚓     毒性    
Effects of Single and Co-Exposure of Cu and Chlorpyrifos on the Toxicity of Earthworm
XU Dong-mei1, WANG Yan-hua2, WANG Nan1, RAO Gui-wei1    
1. College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China;
2. Institute of Quality Standards for Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Abstract: Combined pollution of heavy metal and pesticide had posed a serious threat to soil ecology and human living environment. As two common types of pollutants in soil environment, the environmental effects of combined pollution of Cu and chlorpyrifos are worth for attention. The acute lethal effects and avoiding behavior of single and co-exposure of Cu and chlorpyrifos on earthworms were analyzed by using the methods of standard OECD filter paper test and artificial soil test. Results showed that the LC50,48 h and LC50,14 dof the acute toxicity of Cu on earthworm in filter paper test and in artificial soil test were 2.23 μg·cm-2 and 496.05mg·kg-1, respectively. The LC50,48 h and LC50,14 dof the acute toxicity of chlorpyrifos on earthworm in filter paper test and in artificial soil test were 5.94 μg·cm-2 and 186.07mg·kg-1, respectively. In filter paper test and artificial soil test, the joint acute toxicity of Cu and chlorpyrifos showed an additive effect while the concentration was 1:1. The type of combined effects of co-exposure of Cu and chlorpyrifos was synergistic effect and antagonistic effect in filter paper test and artificial soil test, respectively, while the toxicity was 1:1.The results of avoidance behavior test showed that the joint effect of Cu and chlorpyrifos on the avoidance behavior of earthworms was antagonistic.
Key words: Cu     chlorpyrifos     co-exposure     earthworm     toxicity    

当前，土壤重金属-农药复合污染已经对生态环境和人类生存构成严重威胁. 重金属铜是植物生长和人体生命活动必需的微量元素，然而铜在环境中的过量累积不仅会导致暴露生物的毒性效应[1]，还会对人体健康造成不良影响[2]. 近年来由于含铜矿物的开采、 冶炼厂三废排放、 含铜杀菌剂(波尔多液等)的长期大量使用和城市污泥堆肥利用等原因，使土壤含铜量达到原始土壤的几倍甚至几十倍，远远超出了土壤的环境承载力[3, 4]. 不仅如此，土壤环境中的重金属还往往与农药等污染物同时共存，形成复合污染. 有机磷杀虫剂毒死蜱作为甲胺磷、 对硫磷等高毒有机磷农药的主要替代品，在我国的应用日益广泛. 尽管毒死蜱比已禁止使用的有机磷农药对人畜的毒性要低，但对于多数水生生物而言，毒死蜱仍属于高毒性物质并且可以通过生物积累和生物放大作用对水体食物链产生影响[5, 6, 7]. 2000年6月，美国环境保护署宣布禁止在美国家庭和庭院内使用毒死蜱杀虫剂，并减少毒死蜱在其他方面的使用. 因此，对于毒死蜱的残留危害，尤其是毒死蜱与重金属等污染物复合暴露的毒性评价，成为该领域的热点问题.

蚯蚓作为土壤中生物量最大的动物类群，其自身生理特性、 数量和种群的变化与土壤中污染物的污染程度存在一定的相关性[8, 9]. 同时由于蚯蚓生态毒理试验具有操作简单、 成本低廉、 易于观察、 反应灵敏度高、 测试终点具有生态毒理相关性等优点，其在污染土壤生态风险评价中日益受到关注[10]. 目前国内外关于重金属、 农药单一暴露对蚯蚓的生态毒理效应研究已有许多报道，而对土壤中农药和重金属复合污染的研究还不够深入，许多方面仍有待于完善和发展[11]. 本研究以蚯蚓生态毒理试验中广泛采用的赤子爱胜蚓为模式生物，考察铜-毒死蜱单一及复合暴露对蚯蚓急性致死及回避行为的影响，以期为揭示毒死蜱-铜对土壤生态系统的影响、 全面评估复合污染的生态风险提供必要的基础数据，为土壤有机-无机复合污染的监测预警及修复治理提供科学依据和实践指导.

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验选用由浙江某蚯蚓养殖场提供的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)，挑选2月龄以上，体重为0.3g左右，环带明显的健康成蚓，试验前放于人工气候箱中驯服7 d; 毒死蜱原药由南京红太阳集团有限公司提供(纯度>95%)，其结构式见图 1. 试验所用硫酸铜等试剂均为分析纯; 供试人工土壤根据OECD Guideline No. 207标准方法配制.

图 1 毒死蜱结构式 Fig. 1 Molecular structure of chlorpyrifos
1.2 试验方法 1.2.1 铜、 毒死蜱单一暴露对蚯蚓急性毒性及回避行为试验

铜-毒死蜱复合暴露对蚯蚓急性毒性和回避行为影响的试验方法参照文献[12]的方法. 根据预试验结果确定滤纸法[Cu2+]分别为0、 1、 2、 4、 6、 8 μg ·cm-2; 农药毒死蜱浓度为0、 1、 2、 4、 8、 16、 32 μg ·cm-2. 人工土壤法重金属铜浓度范围设置0、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000 mg ·kg-1 共7个梯度; 毒死蜱浓度为0、 80、 120、 160、 200、 240、 280 mg ·kg-1，同时设不含铜、 毒死蜱的蒸馏水对照组. 回避行为试验重金属铜、 农药毒死蜱浓度分别设置为25、 50、 100、 200 mg ·kg-1和6、 12、 24、 48 mg ·kg-1 这4个浓度梯度. 滤纸法急性毒性试验每一浓度设10个重复; 人工土壤法急性毒性及回避行为试验每一浓度均设置3个重复.

1.2.2 铜、 毒死蜱复合暴露对蚯蚓急性毒性及回避行为试验

参照修瑞琴等[13]的水生毒理联合效应相加指数法，分别以单一化合物滤纸法48 h-LC50和人工土壤法14 d-LC50值为一个毒性单位，按照毒性1 ∶1 和浓度1 ∶1 的混合比例以等对数间距(参照毒性较大的物质设计)设置4个不同的试验浓度，试验方法及其LC50 值计算方法同单一急性毒性试验. 铜-毒死蜱复合暴露的蚯蚓回避行为试验设计见表 4，试验方法和条件控制同单一暴露回避行为试验. 滤纸法急性毒性复合试验每一浓度组合设10个重复; 人工土壤法急性毒性及回避行为试验每一浓度组合设置3个重复.

1.3 数据分析及联合毒性评价方法

试验数据用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，回避行为数据结果采用means±SD的形式表示. 回避率计算如下: 

NR=[(C-T)/N]×100%

式中，NR为净回避率，C为洁净土壤中蚯蚓的数目，T为污染土壤中蚯蚓数目，N为加入土壤中的蚯蚓总数).

铜、 毒死蜱对蚯蚓联合毒性采用Marking水生毒理联合效应相加指数法进行评价. 用式S=Am/A1+Bm/B1求得生物毒性相加作用之和S. 式中，A1、 B1 分别为A、 B毒物的毒性(LC50); Am、 Bm 分别为混合物毒性中各毒物的毒性(LC50)，然后用以下公式将S 转换成相加指数(AI). 当S≤1 时: AI=(1/S)-1.0; 当S＞1 时: AI=S(-1)+1.0，最后用相加指数AI 评价毒物的联合效应. AI＞0 时为协同作用; AI＜0 则为拮抗作用; AI=0 为相加作用.

2 结果与讨论 2.1 铜、 毒死蜱单一暴露对蚯蚓的急性毒性

土壤重金属污染因其隐蔽性、 潜伏性、 污染长期性和不可逆性等特点，被环境学界喻为“化学定时炸弹”[14, 15]. 重金属单一及复合污染对蚯蚓健康状况的影响是评价重金属土壤生态危害的重要手段. 由本研究铜对蚯蚓急性毒性的影响(图 2)可见，滤纸法染毒24 h后，1 μg ·cm-2和2 μg ·cm-2处理组蚯蚓全部存活，铜浓度增至4、 6和8 μg ·cm-2时，蚯蚓死亡率分别达到30%、 70%和100%; 而随着染毒时间的延长，48 h后相同浓度Cu暴露组蚯蚓死亡率较24 h显著升高. 人工土壤法试验结果(图 3)表明，在重金属铜的整个试验浓度范围内，暴露7 d的蚯蚓死亡率较低，其中600、 800和1 000 mg ·kg-1 Cu暴露组的蚯蚓死亡率分别为6.7%、 13.3%和23.3%; 相同浓度的14 d暴露组蚯蚓死亡率均有增加，其中1 000 mg ·kg-1最大暴露组蚯蚓死亡率达到100%.

图 2 Cu对蚯蚓的急性致死作用(滤纸法)Fig. 2 Lethal toxicity of Cu on earthworm(filter paper method test)

图 3 Cu对蚯蚓的急性致死作用(人工土壤法)Fig. 3 Lethal toxicity of Cu on earthworm(artifical soil test)

图 4滤纸法获得的毒死蜱对蚯蚓急性致死作用同样有随毒死蜱浓度增大和暴露时间延长而增大的趋势，其中最大浓度毒死蜱暴露组24 h和48 h死亡率分别为40%和100%. 由图 5毒死蜱对蚯蚓急性毒性的人工土壤试验结果可见，在农药毒死蜱的整个试验浓度范围内，暴露7 d的蚯蚓死亡率均较低(其中最大暴露浓度240 mg ·kg-1和280 mg ·kg-1组蚯蚓死亡率仅3.3%)，但至暴露时间终点14 d时，蚯蚓死亡率急剧增加. 这可能是随着暴露时间的延长，毒死蜱和其主要降解产物3，5，6 -三氯-2-吡啶酚(3,5,6-TCP)共同作用于蚯蚓的结果. 已有研究表明，3,5,6-TCP 对土壤中微生物的毒性远高于母体农药毒死蜱[16].

图 4 毒死蜱对蚯蚓的急性致死作用(滤纸法)Fig. 4 Lethal toxicity of chlorpyrifos on earthworm(filter paper method test)

图 5 毒死蜱对蚯蚓的急性致死作用(人工土壤法)Fig. 5 Lethal toxicity of chlorpyrifos on earthworm(artifical soil test)

蚯蚓形态学变化显示，滤纸暴露法观察到的蚯蚓中毒症状较人工土壤法更为明显. 在本研究的暴露浓度下，蚯蚓对重金属铜的毒性反应更快，但毒死蜱暴露蚯蚓的中毒症状更为明显. 表现为高浓度8 μg ·cm-2铜与蚯蚓接触几分钟后即有弹跳、 扭动反应等中毒症状，伴有脓包和体液渗出; 而毒死蜱在暴露前期对蚯蚓的毒性反应并不明显，至暴露终点48 h，高浓度毒死蜱处理组蚯蚓表现出环带肿大、 环带糜烂出血等症状. 应用SPSS软件中的Probit模块求得铜、 毒死蜱对蚯蚓急性毒性LC50值及置信区间(表 1). 铜对蚯蚓急性毒性滤纸法48 h-LC50和人工土壤法14 d-LC50分别为2.23 μg ·cm-2和496.05 mg ·kg-1; 毒死蜱对蚯蚓急性毒性滤纸法48 h-LC50和人工土壤法14 d-LC50分别为5.94 μg ·cm-2和186.07mg ·kg-1，与刘伟等[17]应用滤纸法和自然土壤法获得的毒死蜱对赤子爱胜蚓LC50相近. 根据文献[18]，可以判断毒死蜱对蚯蚓的毒性为低毒级[17].

表 1 铜、 毒死蜱对蚯蚓急性毒性统计分析结果1) Table 1 Statistical analysis of Cu and chlorpyrifos acute toxicity on earthworm
2.2 铜-毒死蜱复合暴露对蚯蚓的急性毒性作用

在单一暴露试验结果基础上进行铜-毒死蜱对蚯蚓的滤纸法和人工土壤法复合毒性试验结果分别见表 2、 表 3. 采用“水生毒理联合效应相加指数法”对铜-毒死蜱联合毒性试验结果评价表明，当采用浓度1 ∶1 进行试验时，滤纸法和人工土壤法铜、 毒死蜱对蚯蚓的联合毒性近似于相加作用; 而当采用毒死蜱和铜单一毒性LC50值为一个毒性单位，进行毒性1 ∶1 的联合毒性试验时，滤纸法和人工土壤法铜-毒死蜱对蚯蚓的联合作用类型则分别表现为协同和拮抗作用，这可能是由于铜与毒死蜱浓度比例差异引起的. 参考已有的毒死蜱与重金属复合暴露的水生和土壤生态毒性的研究结果，证明了有机磷农药毒死蜱与重金属联合作用机制的复杂性. Tilton等[19]通过系统考察毒死蜱、 铜复合暴露对斑马鱼嗅觉功能的影响，发现重金属、 农药相互作用产生的独特转录信号通过抑制鱼类嗅觉调解行为从而影响了斑马鱼的嗅觉功能，二者的联合作用类型为协同作用; 而在毒死蜱、 镍共存的土壤中，二者对土壤跳虫(Folsomia candida)的联合作用类型则为拮抗作用，作用机制表现为毒死蜱通过竞争重金属Ni与氨基酸的结合点位从而降低Ni的结合位点，降低Ni对土壤跳虫的毒性作用[20]; Steevens等[21,22]证明甲基汞与毒死蜱形成的复合物对低等片脚类水生生物(hyalella azteca)的毒性大于单个污染物，并且这种毒性不能用单个污染物的毒理学效应来解释，而是一种叠加/复合毒性. 相对而言，目前重金属、 农药复合暴露对蚯蚓联合毒性作用机制的研究涉及不多. 周垂帆等研究证明，在草甘膦和重金属铜共存的污染土壤中，草甘膦能够控制铜的生物有效性和毒性[23]; 而重金属汞和农药溴苯腈复合暴露条件下，溴苯腈是复合毒性效应的主要贡献因子，并且其浓度显著影响汞对白线蚓的急性毒性作用[24].

表 2 铜-毒死蜱复合暴露对蚯蚓急性毒性试验设计及结果(滤纸法) Table 2 Experimental design and results of combined pollution of Cu and chlorpyrifoson(filter paper method test)

表 3 铜-毒死蜱复合暴露对蚯蚓急性毒性试验设计及结果(人工土壤法)Table 3 Experimental design and results of combined pollution of Cu and chlorpyrifoson(artificial soil test)
2.3 铜-毒死蜱单一和复合暴露对蚯蚓回避行为的影响 蚯蚓回避试验以蚯蚓行为为检测终点，用以评价土壤生态功能和污染物对蚯蚓的行为效应. 自2005年国际标准化组织ISO制定了化合物对蚯蚓行为效应的测试方法草案后[25]，蚯蚓对污染土壤的回避反应及其在土壤生态功能诊断上的意义已得到广泛应用[26]. 由表 4回避行为试验结果可见，单一暴露下重金属铜、 农药毒死蜱分别在浓度为100 mg ·kg-1和48 mg ·kg-1时表现出回避反应，即回避率大于80%; 蚯蚓对铜、 毒死蜱表现出回避反应的浓度分别相当于人工土壤法急性毒性试验14 d半数致死浓度LC50的1/5和1/4. 通过比较铜、 毒死蜱单一及复合暴露对蚯蚓回避行为的影响，发现25 mg ·kg-1 铜分别与6、 12、 24、 48 mg ·kg-1 毒死蜱复合暴露的回避行为试验结果与相应浓度毒死蜱单一暴露的结果近乎相同; 而50 mg ·kg-1 铜与上述浓度毒死蜱复合暴露的蚯蚓回避率较毒死蜱单独作用结果稍有增大，据此可初步判断铜、 毒死蜱对蚯蚓回避行为的联合作用类型为拮抗作用. 这一结果与人工土壤法铜、 毒死蜱毒性单位配比1 ∶1的急性毒性联合作用类型相同.

表 4 铜-毒死蜱单一及复合暴露对蚯蚓回避行为的影响 Table 4 Avoidance behavior of combined pollution of Cu and chlorpyrifos on earthworm
3 结论

(1)Cu、 毒死蜱单一因素暴露对蚯蚓急性毒性作用结果表明: 滤纸法和人工土壤法Cu对蚯蚓急性毒性的48 h-LC50和14 d-LC50分别为2.23 μg ·cm-2和496.05 mg ·kg-1; 而毒死蜱对蚯蚓急性毒性的48 h-LC50和14 d-LC50值分别为5.94 μg ·cm-2和186.07 mg ·kg-1.

(2)铜-毒死蜱复合暴露的试验结果表明: 滤纸法和人工土壤法铜、 毒死蜱浓度单位配比1 ∶1时，铜、 毒死蜱对蚯蚓急性毒性联合作用类型均近似表现为相加作用; 而毒性单位配比1 ∶1的滤纸法和人工土壤法试验结果分别为协同作用和拮抗作用.

(3)铜、 毒死蜱对蚯蚓回避行为的联合作用类型为拮抗作用.

参考文献
[1] Klok C, Goedhart P W, Vandecasteele B. Field effects of pollutants in dynamic environments. A case study on earthworm populations in river floodplains contaminated with heavy metals[J]. Environmental Pollution, 2007, 147 (1): 26-31.
[2] Chen J X, Myerburg M M, Passero C J, et al. External Cu2+ inhibits human epithelial Na+ channels by binding at a subunit interface of extracellular domains[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286 (31): 27436-27446.
[3] Besnard E, Chenu C, Robert M. Influence of organic amendments on copper distribution among particle-size and density fractions in Champagne vineyard soils[J]. Environmental Pollution, 2001, 112 (3): 329-337.
[4] Schramel O, Michalke B, Kettrup A. Study of the copper distribution in contaminated soils of hop fields by single and sequential extraction procedures[J]. Science of the Total Environment, 2000, 263 (1-3): 11-22.
[5] Varó I, Serrano R, Pitarch E, et al. Bioaccumulation of chlorpyrifos through an experimental food chain: study of protein HSP70 as biomarker of sublethal stress in fish[J]. Environmental Contamination and Toxicology, 2002, 42 (2): 229-235.
[6] Daam M A, Van Den Brink P J, Nogueira A J A. Impact of single and repeated applications of the insecticide chlorpyrifos on tropical freshwater plankton communities[J]. Ecotoxicology, 2008, 17 (8): 756-771.
[7] Levin E D, Swain H A, Donerly S, et al. Developmental chlorpyrifos effects on hatchling zebrafish swimming behavior[J]. Neurotoxicology and Teratology, 2004, 26 (6): 719-723.
[8] Garcia M, Scheffczyk A, Garcia T, et al. The effects of the insecticide lambda-cyhalothrin on the earthworm Eisenia fetida under experimental conditions of tropical and temperate regions[J]. Environmental Pollution, 2011, 159 (2): 398-400.
[9] Li M, Liu Z T, Xu Y, et al. Comparative effects of Cd and Pb on biochemical response and DNA damage in the earthworm Eisenia fetida(Annelida, Oligochaeta)[J]. Chemosphere, 2009, 74 (5): 621-625.
[10] Wang DS, Xu Z Z, Zhao Y M, et al. Change of genotoxicity for raw and finished water: Role of purification processes[J]. Chemosphere, 2011, 83 (1): 14-20.
[11] Lemarchand C, Rosoux R, Berny P. Organochlorine pesticides, PCBs, heavy metals and anticoagulant rodenticides in tissues of Eurasian otters(Lutralutra) from upper Loire River catchment(France)[J]. Chemosphere, 2010, 80 (10): 1120-1124.
[12] 徐冬梅, 文岳中, 李立, 等. PFOS对蚯蚓急性毒性和回避行为的影响[J]. 应用生态学报, 2011, 22 (1): 215-220.
[13] 修瑞琴, 傅迎春, 许永香. 硒与氟离子对美丽猛水蚤的联合毒性[J]. 环境科学, 1995, 16 (1): 26-28.
[14] Rahman M A, Molla A H, Saha N, et al. Study on heavy metals levels and its risk assessment in some edible fishes from Bangshi River, Savar, Dhaka, Bangladesh[J]. Food Chemistry, 2012, 134 (4): 1847-1854.
[15] Flyhammar P, Hakansson K. The release of heavy metals in stabilised MSW by oxidation[J]. Science of the Total Environment, 1999, 243-244: 291-303.
[16] Sardar D, Kole R K. Metabolism of chlorpyrifos in relation to its effect on the availability of some plant nutrients in soil[J]. Chemosphere, 2005, 61 (9): 1273-1280.
[17] 刘伟, 朱鲁生, 王军, 等. 毒死蜱、马拉硫磷和氰戊菊酯对赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)的急性毒性[J]. 生态毒理学报, 2009, 4 (4): 597-601.
[18] 中国国家农业部农药检定所. 化学农药环境安全评价试验准则(草稿)[S]. 北京: 中国国家农业部农药检定所, 2005. 31-33.
[19] Tilton F A, Tilton S C, Bammlera T K, et al. Transcriptional impact of organophosphate and metal mixtures on olfaction: Copper dominates the chlorpyrifos-induced response in adult zebrafish[J]. Aquatic Toxicology, 2011, 102 (3-4): 205-215.
[20] Broerse M, van Gestel C A M. Mixture effects of nickel and chlorpyrifos on Folsomia candida(Collembola) explained from development of toxicity in time[J]. Chemosphere, 2010, 79 (9): 953-957.
[21] Steevens J A, Benson W H. Toxicological interactions of chlorpyrifos and methyl mercury in the amphipod Hyalella azteca[J]. Toxicological Sciences, 1999, 52 (2): 168-177.
[22] Steevens J A, Benson W H. Interactions of chlorpyrifos and methyl mercury: a mechanistic approach to assess chemical mixtures[J]. Marine Environmental Research, 2000, 50 (1-5): 113-117.
[23] 周垂帆, 王玉军, 俞元春, 等. 铜和草甘膦对蚯蚓的毒性效应研究[J]. 中国生态农业学报, 2012, 20 (8): 1077-1082.
[24] Yang D L, Zhu J, Fu R B, et al. Enchytraeidae Fridericia bulbosa as a new test species for soil ecotoxicity assessment[J]. Chemosphere, 2012, 88 (4): 501-506.
[25] ISO. Soil Quality-Avoidance test for testing the quality of soils and effects of chemicals on behaviour. Part 1: Test with earthworms(Eisenia fetida and Eisenia andrei)[Z]. ISO/DIS 17512-1. Geneva: International Organization for Standardization, 2008.
[26] Antunes S C, Castro B B, Pereira R, et al. Contribution for tier 1 of the ecological risk assessment of Cunha Baixa uranium mine(Central Portugal): Ⅱ. Soil ecotoxicological screening[J]. Science of the Total Environment, 2008, 390 (2-3): 387-395.