生活垃圾成分很复杂，且含有多种易于腐烂的有机物，这些有机物在腐烂和稳定化过程中会产生大量的恶臭物质，对周边环境造成极大的危害，严重影响了周边居民的身体健康^[1]. 因此，垃圾堆放集中区除臭工作成为环境卫生工作中不可缺少的一个部分. 常见的恶臭源主要有垃圾中转站、 垃圾收集点、 垃圾填埋场和垃圾渗滤液收集池. 它们散发出的恶臭气体主要来源于垃圾腐败过程产生的气体和底部垃圾渗滤液中恶臭气体的挥发^[2]. 虽然不同地区产生的生活垃圾主要成分有所区别，但是所产生异味的气体主要为NH₃和H₂S.

目前除臭研究工作主要集中在化学除臭、 物理除臭和生物除臭三方面，生物除臭以除臭效率高、 无二次污染、 操作简单、 成本低廉，成为目前治理恶臭环境的一个重要研究方向^[3]. 近年来，研究工作主要集中在高效除臭优势菌株的选育，推广应用的研究多采用外国进口的微生物制剂，以日本的EM菌剂为主. 而国内自我选育和复配的微生物除臭剂研究情况还不多见^[4]. 本实验从垃圾渗滤液筛选出具有高效除臭功能微生物，并对其进行菌种鉴定，通过有机复配制备出具有除臭功能微生物除臭剂，以垃圾渗滤液中NH₃和H₂S的去除率为除臭标准，并探索微生物除臭剂最佳培养条件，以期为环境生物除臭治理提供技术和依据.

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 采样

2011年9月27日，从浙江省台州市椒江区垃圾填埋场的垃圾渗滤液收集池中采取垃圾渗滤液. 对采集的垃圾渗滤经过实验室测试，各项水质指标如表 1.

表 1(Table 1)

表 1 椒江垃圾渗滤液水质特征 Table 1 Quality characteristics of Jiaojiang leachate water 颜色 COD/mg ·L-1 BOD5/mg ·L-1 NH+4-N/mg ·L-1 SO2-4/mg ·L-1 嗅阈值 pH 黄灰色 32 212 10 325 1 125 2 417 2 312 6.2

表 1 椒江垃圾渗滤液水质特征 Table 1 Quality characteristics of Jiaojiang leachate water

改良高氏一号培养基^[5]: KNO₃ 1 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g，L-半胱氨酸100 mg，淀粉10 g，水1 000 mL，pH 7.0~7.2.

NH₃选择性培养基^[6]: 蔗糖50 g，氨水10 mL，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.1 g，1%ZnSO₄ 5 mL，NaCl 2 g，水1 000 mL，自然pH.

种子液和混合发酵培养基: 基础肉汤培养基.

将取新鲜垃圾渗滤液10 mL加入装有100 mL的基础肉汤培养基的250 mL的三角瓶中，32℃，120r ·min^-1，培养72 h后，取出10 mL转接到100 mL新的基础肉汤培养基中，同样条件培养72 h后，再转接一次. 吸取垃圾渗滤液富集液5 mL，用无菌术配制梯度为10^-5、 10^-6和10^-7的溶液，采用平板涂布法将上述培养基分别涂布于改良高氏一号培养基和NH₃选择性培养基，倒置于32℃的恒温培养箱中培养48 h，将获得的菌落进一步分离纯化，直至获得纯培养，分别接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养，保存备用.

(1)种子液的制备 将分离获得菌株分别接种于基础肉汤培养上，32℃，120r ·min^-1，培养24 h. (2) 除臭菌株的初筛 在装有灭菌好的100 mL的发酵培养基的三角瓶中，添加5 mL的垃圾渗滤液和接种5%的制备好的种子液，在无菌条件搅拌均匀后塞上胶塞，在培养3 d后，凭感官测定其各自菌株的嗅阈值. 初筛采用嗅阈值法测定各菌株除臭能力，即用无臭水稀释水样，直至闻出最低可辨别臭气的浓度(嗅阈浓度)，用其表示臭气的阈限，水样稀释到刚好闻出臭味的稀释倍数成为嗅阈值，以未接菌种的作为对照，嗅阈值越小除臭效果越好，反之越差^[7].

(3)除臭菌株的复筛 经过初筛具有除臭能力较强优势菌株制备种子液，制备方法同上(1). 一组取10 mL待测种子液和2 mL垃圾渗滤液加入已灭菌的含有100 mL发酵培养基中，混匀，装入1 000 mL的大烧杯中，再放入装有20 mL 1%硼酸的250 mL小烧杯，大烧杯上用3层保鲜膜覆盖，并且周围用宽胶带密封; 另一组取10 mL待测种子液和2 mL垃圾渗滤液加入已灭菌的含有100 mL发酵培养基中，混匀，装入1 000 mL的大烧杯中，再放入装有20 mL 0.2%碱性锌氨络盐 Zn(NH₃)₄ ·(OH)₂的250 mL小烧杯，大烧杯上用3层保鲜膜覆盖，并且周围用宽胶带密封. 每组以等量无菌水作为空白对照，每个处理重复3次，置于30℃的培养箱中培养，培养72 h后，采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法和亚甲基蓝分光光度法分别检测NH₃和H₂S的释放量，通过释放量的检测评价除臭菌株对NH₃和H₂S去除率^[8].

将获得的各菌株接种于复筛培养基，30℃培养24 h后，观察并记录菌落生长状况和菌落形态. 挑取少量菌体进行染色，显微镜下观察并记录菌体形态，并对各菌株进行生理生化测试^[9].

将菌种接种在LB液体培养基中，30℃、 180r ·min^-1摇床培养24 h，12 000r ·min^-1离心收集菌体，用德国QIAGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA. 然后用以下引物对菌株DNA进行PCR扩增实验: 正向引物: 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，反向引物: 5′-ACGGCTACCT TGT TACGA CTTCACCCC-3′. PCR扩增的反应体系为50 μL，其中10×buffer 5 μL; dNTP 4 μL; Mg²⁺3 μL; 引物各1 μL; Taq酶0.4 μL; 模板2 μL; 之后用双蒸水补足至50 μL. PCR扩增的反应条件为95℃预变性5 min，94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，进行35个循环，最后72℃保温10 min. 将扩增得到的16S rDNA产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生工生物有限公司进行测序. 将测得的16S rDNA序列在NCBI中进行BIAST比对分析，寻找最相似的已知序列^[10].

(1)拮抗实验 拮抗实验采用划线交叉法，将复筛获得菌株在牛肉膏平板培养基上两两之间进行交叉划线，观察交叉点是否有菌株生长情况，两者能生长为不拮抗，一株或两株都不能生长为拮抗.

(2)除臭菌株的组合实验 将不拮抗4个菌株进行两两组合，三三组合，全部组合，共组建了11个处理组，然后按照1 ∶1的比例将种子液混合接种到含有2 mL垃圾渗滤液的100 mL混合培养基，培养温度30℃，120r ·min^-1培养72 h，每个组合3次重复，测定NH₃和H₂S的释放量^[11].

(3)优势菌株接种比例复配实验 最佳除臭组合由3个菌株组成，按照3%的使用量，按照以下比例将3株菌的种子液进行复配: 1 ∶1 ∶1，0.5 ∶1.5 ∶1，0.5 ∶1 ∶1.5，1.5 ∶0.5 ∶1，1 ∶0.5 ∶1.5，1.5 ∶1 ∶0.5，1 ∶1.5 ∶0.5，0.5 ∶0.5 ∶2，0.5 ∶2 ∶0.5，2 ∶0.5 ∶0.5，复配组合为10个，加入到含有2 mL垃圾渗滤液的100 mL混合培养基，培养温度30℃，100r ·min^-1培养72 h，每个组合3次重复，测定NH₃和H₂S释放量，确定最佳组合比例^[12].

将菌株CC7、 CC13、 CC16的种子液按照1 ∶1.5 ∶0.5的比例在无菌条件下混合，制备成复合除臭剂，选用含有2 mL垃圾渗滤液的100 mL混合发酵培养基作为研究培养基，以变换不同除臭条件(反应时间、 除臭温度、 除臭剂使用量和pH值)确定复合制剂对NH₃和H₂S的最佳去除率，每个实验安排3个重复(表 2).

表 2(Table 2)

表 2 除臭条件优化实验设计1)Table 2 Experiment design of optimal deodorizing conditions 测试项目 实验组别 除臭时间/h 12 24 36 48 60 72 84 除臭温度/℃ 10 20 25 30 35 40 — 制剂使用量/% 1 2 5 10 20 — — 除臭pH值 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 1)“—”表示文章中没有相关实验设计

表 2 除臭条件优化实验设计1)Table 2 Experiment design of optimal deodorizing conditions

从台州市椒江区垃圾填埋场采集的垃圾渗滤液，对其富集3次培养，经多次分离纯化获得20株优势菌株，并对其进行编号. 采用嗅阈值法测定各菌株对垃圾渗滤液除臭效果，结果如图 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 初筛菌株的除臭效果 Fig. 1 Deodorization effects of first screened microorganisms

由图 1可以看出，菌株CC3、 CC7、 CC10、 CC13和CC16具有较强除臭的功能，其中菌株CC13的除臭能力最强，嗅阈值为75，无异味，除臭效果最佳. 而陈晓英等^[13]从油脂废水中筛选出除臭菌株制备成除臭菌剂，该菌剂对油脂废水除臭嗅阈值达到50. 其除臭嗅阈值与本研究结果比较接近，但是嗅阈值法只能测定菌株对臭味去除的总体能力，无法探明各菌株的除臭机制和在除臭过程对某些异味气体特殊去除能力，研究表明^{[14, 15, 16]}，垃圾渗滤液散发恶臭气体主要是NH₃和H₂S，因此本实验将以两者作为菌株除臭能力的筛选标准.

将初筛获得的除臭效果较好的菌株CC3、 CC7、 CC10、 CC13和CC16对NH₃和H₂S降解实验，测定在实验室培养条件下对NH₃和H₂S的去除率，实验结果如表 3所示.

表 3(Table 3)

表 3 比较复筛菌株对NH3和H2S去除率 Table 3 Comparison of screened strains on removal rate of NH3and H2S 菌株 NH3释放量/mg ·m-3 NH3去除率/% H2S释放量/mg ·m-3 H2S去除率/% CC3 9.76 62.25 3.82 50.23 CC7 12.47 51.78 3.93 48.75 CC10 13.28 48.65 4.42 42.35 CC13 8.36 67.68 3.00 60.95 CC16 11.32 56.25 3.67 52.23 CK 25.86 0.00 7.67 0.00

表 3 比较复筛菌株对NH3和H2S去除率 Table 3 Comparison of screened strains on removal rate of NH3and H2S

由表 3可以看出，菌株CC13对NH₃和H₂S的去除率分别为67.68%和60.95%，表现了最佳的除臭性能，菌株CC3、 CC7和CC16对于NH₃和H₂S的去除效果表现较好，去除率分别为62.25%、 51.78%、 56.25%和50.23%、 48.75%、 52.23%，菌株CC10对NH₃和H₂S去除率表现一般. 本研究结果与赵晓锋等^[17]从鸡粪中筛选除臭菌株对NH₃的去除率很接近. 因此，选择菌株CC3、 CC7、 CC13和CC16作为复合生物除臭菌的功能菌种.

获得的4株除臭菌株的生理生化实验结果如表 4所示，菌株CC3，菌落表面光滑湿润，边缘整齐，灰白色半透明，菌体呈球状，双联或四联，结合生理生化实验初步鉴定为片球菌属(Pediococcus)，菌株CC7，菌落灰白色，圆形，表面干燥，不透明，扁平状，菌体单个，呈长杆状，有芽孢，结合生理生化实验初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，菌株CC13在MRS培养基上经37℃厌氧培养24 h后可见微小，圆形，乳白色，稍隆起，易挑取，透明菌落，菌体短杆状，无芽孢，两端圆形，呈链状排列或单一排列，结合生理生化实验初步鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)，菌株CC16，表面较湿，小而突起，乳白色，边缘整齐，菌体短小近球状，不产芽孢，有鞭毛，结合生理生化实验初步鉴定为产碱杆菌属(Alcaligenes).

表 4(Table 4)

表 4 4株菌株生理生化特征1)Table 4 Physiological and biochemical properties of four strains 项目 CC3 CC7 CC13 CC16 细菌形态 球状 长杆状 短杆 短杆 革兰氏 + + + - 需氧型 兼性厌氧 好氧 兼性厌氧 好氧 运动性 - - - + 接触酶 - + - + 氧化酶 - + - + 明胶液化 - + - - 吲哚实验 - - - - VP实验 - + - + 淀粉水解 - + + + 硝酸盐 - - - + 葡萄糖发酵 产酸不产气 产酸不产气 产酸不产气 产酸不产气 1)“+”为阳性，“-”为阴性

表 4 4株菌株生理生化特征 1)Table 4 Physiological and biochemical properties of four strains

采用试剂盒提取各菌株的DNA，使用细菌通用引物8F-1392r进行PCR扩增，得到1.5kb左右的偏度，并测序，将其16S rDNA序列在GenBank数据库中对比获得，菌株CC3与Genome DataBase中的Pediococcus acidilactici相似性水平达99.0%，鉴定菌株CC3为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici ); 菌株CC7与Genome DataBase中的Bacillus megaterium相似性水平达99.9%，鉴定菌株CC7为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium); 菌株CC13与Genome DataBase中的Lactobacillus acidophilus相似性水平达99.5%，鉴定菌株CC13为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus); 菌株CC16与Genome DataBase中的Alcaligenes faecalis subsp.相似性水平达98.9%，鉴定菌株CC16为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis). 根据以往报道，芽孢杆菌(Bacillus)、 乳酸杆菌(Pasteurella)、 产碱杆菌(Alcaligenes)、 红螺菌(Rhodospirillum)及醋酸杆菌(Acetobacter)等在微生物除臭方面具有较好的效果^{[18, 19, 20, 21, 22]}.

在平板上将菌株交叉十字划线，两两菌株交叉点生长良好，复筛获得4株菌株彼此之间都没有拮抗作用，可以进一步进行最佳除臭组合的筛选.

将4种菌株进行组合，对于NH₃和H₂S的去除率都有所提高，以空白实验NH₃和H₂S的释放量为参照，计算NH₃和H₂S的去除率，采用DPS软件对11种的不同组合的NH₃和H₂S去除率进行单因素随机区组方差分析，结果如表 5所示，不同组合的NH₃和H₂S去除率存在一定差异性. 其中组合CC7+CC13+ CC16与组合CC3+ CC7+CC13对NH₃去除率无显著差异，但是与其他组合都存在显著差异，NH₃的去除率为78.56%; 组合CC7+CC13+ CC16在H₂S的去除率与其他组合都存在显著差异，对H₂S的去除率为62.67%. 组合中CC3+CC7+CC13+CC16含有4种优势去除除臭菌株，但是在组合中对NH₃和H₂S的去除率表现一般，可能原因有4种菌的组合并不能促进细胞对NH₃和H₂S的代谢. 根据对NH₃和H₂S去除率显著差异分析，最佳处理组合为CC7+CC13+CC16.

表 5(Table 5)

表 5 比较菌株组合对NH3和H2S去除率 1)Table 5 Comparison of combinations on removal rate of NH3and H2S 处理 氨气去除率(平均值)/% 硫化氢去除率(平均值)/% CC3+CC7 59.40±0.64d 45.27±2.96f CC3+CC13 60.45±1.00cd 56.83±1.37b CC3+CC16 46.88±4.3f 47.66±1.75fg CC7+CC13 68.00±1.36b 51.83±1.55cde CC7+CC16 51.36±0.67e 48.84±0.17efg CC13+CC16 62.76±0.49c 51.36±1.05def CC3+CC7+CC13 75.77±2.63a 53.78±3.08bcd CC3+CC7+CC16 60.81±0.59cd 52.74±4.80cde CC3+CC13+CC16 61.71±2.22cd 55.54±1.86bc CC7+CC13+CC16 78.56±0.36a 62.67±0.89a CC3+CC7+CC13+CC16 61.85±1.26cd 49.89±1.35def 1)不同组合对NH3和H2S去除率进行单因素完全随机方差分析，当P<0.05，用字母表示差异显著性(LSD法)

表 5 比较菌株组合对NH3和H2S去除率1) Table 5 Comparison of combinations on removal rate of NH3and H2S

微生物菌株复配比例是提高除臭剂效果的关键所在，只有调整到最佳配置比例，才能获得复合微生物除臭剂各菌株的最佳除臭性能，形成稳定的具有协同效应的微生态菌群，以菌群整体优势对恶臭气体的去除.

由图 2可以看出，不同比例复配的微生物除臭剂对氨气硫化氢去除效果有一定差异，其中菌种CC7，CC13，CC16比例为1 ∶1.5 ∶0.5时，氨气、 硫化氢的去除效果较好，去除率分别为80.24%和65.45%. 其他比例复配的微生物除臭剂对NH₃和H₂S的去除率效果不明显，甚至有的比例除臭效果降低，主要原因是复合微生物除臭剂某一菌种占据绝对的优势，对营养物质快速消耗，影响其他菌株生长与繁殖^[23].

图 2

Fig. 2

图 2 比较3种除臭菌株的配制比例对NH3和H2S去除率Fig. 2 Comparison of various proportions of three strains on removal rate of NH3 and H2S

由图 3可见，温度对微生物除臭剂对氨气硫化氢的去除率表现出一致性，在培养时间为12~48 h，对NH₃和H₂S的去除率速度提高得很快，主要由于各个菌系处于对数生长期，消耗大量恶臭物质，同时代谢大量的酶，加速了硫化氢的去除率，直到60 h时复配菌剂的去除率增长趋势达到最大值对NH₃和H₂S的去除率为80.05%和65.03%. 在60 h后其去除率的增长趋势较弱，去除率有较小的增加，但是不明显，这个时期复合微生物菌种应该处于稳定期内，有益微生物代谢活动减弱，对氨气和硫化氢的降解能力减弱. 目前筛选除臭菌株一般都是在48 h之后才能获得最佳除臭效果，唐微微等^[24]筛选的酵母菌对猪粪除臭在72 h后达到最大值，而后除臭效果下降. 本研究结果微生物除臭剂在60 h后趋于稳定，72 h后对NH₃和H₂S去除率变化不大，因此选择培养60 h为最佳培养时间.

图 3

Fig. 3

图 3 除臭时间对微生物除臭剂去除NH3和H2S的影响Fig. 3 Effects of deodorization time on NH3 and H2S removal of microbial deodorize

如图 4所示，当微生除臭剂使用量较低时(1%~5%)，随着接种量增加，NH₃和H₂S去除率也随着升高，在5%时为最大值，氨气的去除率可达82.46%，硫化氢的去除率可达68.59%. 而当使用量>5%时，NH₃和H₂S的去除率反而下降，其主要原因可能是接种量过大，快速导致营养物质匮乏而缺乏竞争，降低了生物活性和关键生物酶的代谢^[25].

图 4

Fig. 4

图 4 使用量对微生物除臭剂去除NH3和H2S的影响Fig. 4 Effects of sausage on NH3and H2S removal of microbial deodorize

如图 5所示，温度是影响菌体代谢酶降解NH₃和H₂S的一个重要因素，温度过高或过低均会影响菌体酶的代谢过程.

图 5

Fig. 5

图 5 温度对微生物除臭剂去除NH3和H2S的影响Fig. 5 Effects of temperature on NH3and H2S removal of microbial deodorize

培养温度对复合微生态除臭剂除臭效果影响较大，在不同温度下除臭效果有着明显差异，在25℃以下和40℃以上，温度很大程度上影响微生物繁殖数量和降解酶代谢速度，也就对NH₃和H₂S的去除率降低. 通常，在15~30℃之间，随着温度的升高，菌株中酶的活性增强，生化反应速度会加快，菌株的最佳生长及降解速率提高，若温度继续升高，菌株中的一些敏感物质会受到不可逆的破坏，其生物活性会受到影响^[26]. 因此，选择30℃作为微生物除臭菌对NH₃和H₂S最佳的降解温度.

环境中pH的变化能够引起微生物细胞膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收，此外，pH还影响微生物除臭菌株代谢酶的活性，pH过高或过低均会导致酶的活力降低甚至失活. 图 6为不同pH条件下，微生物除臭剂对NH₃和H₂S去除情况，从中可以看出，在初始pH值为6.5~7.0时，微生物菌群生长比较旺盛，对NH₃和H₂S去除率比较高，pH值为6.5时，NH₃和H₂S的去除率最大值分别为83.56%和70.25%. 从NH₃和H₂S的去除率的变化趋势看，初始培养基pH值偏酸性易于复合微生物除臭剂培养，碱性对除臭效果的影响较大^[27].

图 6

Fig. 6

图 6 初始pH对微生物除臭剂去除NH3和H2S的影响Fig. 6 Effects of initial pH on NH3and H2S removal of microbial deodorize

(1)从台州市椒江区垃圾填埋场的垃圾渗滤液分离获得4株能够高效降解NH₃和H₂S的优势菌株，对其进行生理生化和分子鉴定，菌株CC3为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )、 菌株CC7为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、 菌株CC13为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和菌株CC17为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis).

(2)4株菌株相互之间没有拮抗，菌株CC7+CC13+CC16的组合对NH₃和H₂S的去除率效果显著，三者配制比例为1 ∶1.5 ∶0.5，对NH₃和H₂S的去除率为最大值，可到达83.56%和70.25%.

(3)对微生物除臭剂除臭效果条件研究表明，微生物除臭剂降解NH₃和H₂S的最佳环境条件: 除臭时间为60 h，除臭温度为30℃，初始pH值为6.5，菌剂使用量为5%.