雌激素是一类具有类雌激素效应的环境内分泌干扰物(EDCs).研究表明,EDCs尤其是甾醇类和酚类激素物质,会对野生动物和人类的生长发育,特别是内分泌、 生殖和免疫系统等造成不良影响^[1,2].甾醇类雌激素主要包括动物体内天然存在的雌酮(E1)、 雌二醇(E2)和雌三醇(E3),以及口服避孕药的主要成分的炔雌醇(EE2).酚类雌激素中的BPA是重要的有机化工原料,已被证实具有雌激素活性^[3,4],且在环境中被广泛检出,因此也备受关注^[5,6].

近年来,雌激素已在水体、 沉积物及污泥中广泛检出,但有关雌激素在水产品中的污染特征及健康风险评价的报道则较少^{[7, 8, 9].}

崇明岛是我国第三大岛,位于长江流域和东部沿海地区“T”字形格局的交汇点,是上海市最具潜在战略意义的发展空间之一,已被上海市政府列入“建设现代综合性生态岛”的规划^[10].崇明岛地理位置得天独厚,渔业资源丰富,但少有关于崇明岛水生生物中雌激素含量水平及雌激素健康风险的研究.

因此,本研究采集了崇明岛9种典型水生动物样品,采用本课题组前期建立的同时检测鱼肉中甾醇和酚类雌激素的方法^[11],检测生物样品中5种典型雌激素(E1、 E2、 E3、 EE2和BPA),分析其含量和分布特征,并对比不同生物种类对雌激素富集能力的差异,最后对该区域水生生物中雌激素含量进行初步健康风险评估.

1 材料与方法 1.1 标样和实验仪器

雌酮(Estrone,E1,纯度＞99%)、 雌二醇(17β-estradiol,E2,纯度＞96.8%)、 雌三醇(Estriol,E3,纯度＞99%)、 决雌醇(17α-ethynyl estradiol,EE2,纯度＞99%)、 双酚A(Bisphenol A,BPA,纯度＞99%)、 双酚A同位素标记物(Bisphenol A-d₁₆,BPA-d₁₆,纯度＞99%)和雌二醇同位素标记物(17β-estradiol-d₂,E2-d₂,纯度＞99%)均购于德国Dr.Ehrenstrofer GmbH公司.

萃取仪器为ASE350(购于美国Dionex公司)； 检测仪器为超高效液相色谱串联质谱系统(UHPLC-MS²)主要包括一个Waters Acquity^TM系统与Waters三重四极杆串联质谱(英国Waters公司生产)在线连接. 分析中所用的色谱柱规格为HSS T3(2.1×100 mm,1.7 μm颗粒大小).

表 1(Table 1)

表 1 崇明动物样品信息 Table 1 Information of animal samples on Chongming Island 生物种类 性别 体长/cm 数量/只 脂肪含量/% 鲈鱼(Micropterus salmoides) — 23.5 2 3.15 鲫鱼(Carassius cuvieri) — 13.5 2 4.73 无齿相手蟹(Sesarmadehaani) 雌 — 25 10.46 雄 — 25 9.65 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis Milne-Edwards) 雌 — 20 22.03 雄 — 20 38.92 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 雌 — 8 12.81 雄 — 9 12.16 中华虎头蟹(Orithyiasinica) — — 4 16.32 天津厚蟹(Helicetients inensis) — — 5 20.14 断脊口虾蛄(Oratosquillina interrupta) — — >25 8.44 脊尾白虾(Palaemoncarincauda holthuis) — — >25 7.85

表 1 崇明动物样品信息 Table 1 Information of animal samples on Chongming Island

鲈鱼:为常见的经济鱼类,常在中国沿海以及通海的淡水水体中养殖,尤以黄海、 渤海较多.主要以鱼、 虾类为食,属于肉食性鱼类.

鲫鱼:个体较小,为淡水经济型食用鱼类,广泛分布在全国各地.食性杂,以植物为主,兼食小虾、 蚯蚓、 昆虫和幼螺等动物性食料.

蟹:通常为杂食性,有些为食肉性,少数则刮食或滤食藻类及有机碎屑.

断脊口虾蛄:喜栖于浅水泥沙或礁石裂缝内,多捕食小型无脊椎动物.

脊尾白虾:生活于浅海或河口附近泥沙底,食性杂而广,动植物及有机碎屑均能摄取.脊尾白虾长到5 cm以上一般只需2~3个月,生产周期短. 1.3 样品前处理

所有样品取食用部分(鱼类取鱼腹部肌肉,蟹取蟹黄和蟹肉,虾取虾仁)绞碎后置于-24℃冰箱冷冻48 h,然后冷冻干燥72 h.干样品研磨成粉末后用铝箔包裹放入自封袋中,置于干燥皿中避光、 密封保存.样品杜绝与塑料用品接触.

称取1.5 g样品,设置3个平行样,加入适量的石英砂混合分散后装入ASE萃取池(不锈钢,33 mL).ASE萃取池由下至上依次填充:玻璃纤维滤膜、 石英砂、 氧化铝、 玻璃纤维滤膜、 样品和石英砂.ASE萃取采用甲醇-乙腈混合溶液(1 ∶1,体积比),在60℃下静态萃取5 min,循环3次,默认压强为1500 psi,加热5 min,氮气吹扫120 s.萃取液(大约40 mL)经40℃旋转蒸发浓缩至5 mL后,放入-24℃冰箱冷冻24 h进行过滤去脂.在过滤后的萃取液中再加入10 mL正己烷,剧烈振荡混合1 min.静置分层,

弃去上层正己烷,再加入10 mL正己烷,重复一次正己烷去脂,将净化后的萃取液转移至5 mL带刻度的玻璃试管中,在40℃下氮吹至近干. 干残留用1 mL乙腈-水(1 ∶1,体积比)溶解,经0.22 μm聚醚砜滤膜过滤,上仪器UHPLC-MS²检测^[11].

样品中脂肪含量的测定参照文献^[12],称取约2 g干生物样品,用ASE 350提取脂肪,温度125℃,加热5 min,静态萃取6 min,萃取循环3次.萃取液在恒重的梨形瓶(重m₁)中旋转蒸发至干,放烘箱(103±2)℃ 干燥1 h,放干燥器冷却至室温称重(m₂).脂肪含量=(m₂-m₁)/2 g×100.

超高效液相色谱串联质谱系统(UHPLC-MS²)主要包括Waters Acquity^TM系统与三重四极杆串联

质谱(英国Waters 公司生产)在线连接.分析中所用的色谱柱规格为HSS T3(2.1×100 mm,1.7 μm).流动相A为乙腈-甲醇(1 ∶2,体积比),流动相B则为超纯水,进样体积为4 μL.梯度洗脱程序如表 2所示,每个样品总的分析时间为10 min,其中包括2min的柱子冲洗和恢复至初始流动相条件的平衡时间.分析过程中设置柱温40℃,流速0.4 mL ·min^-1.样品随流动相经色谱系统中流出组分经Z喷雾-电子喷雾离子化,然后在多反应监测(MRM)模式下进行分析.本研究中所有目标化合物的分析均采用负离子模式[M—H]^－.去溶剂气(N₂)的流速是800 L ·h^-1,温度是500℃.撞击气体(Ar)的流速是0.17 mL ·min^-1,毛细管电压是2.8 V.

表 2(Table 2)

表 2 超高效液相色谱的梯度洗脱程序 Table 2 UHPLC gradient elution program 项目 0 min 7.6 min 8 min 9 min 10 min 流动相A/% 45 50 100 45 45 流动相B/% 55 50 0 55 55

表 2 超高效液相色谱的梯度洗脱程序 Table 2 UHPLC gradient elution program

本方法保证目标污染物在5、 50和100 ng ·g^-1加标水平的平均回收率在71.2%~108%的范围内,且平行样的相对标准偏差小于16%.方法检测限(以dw计)为0.04~0.08 ng ·g^-1,方法定量限 0.07~0.27 ng ·g^-1,且目标污染物在空白样品中均未检出.

2 结果与讨论 2.1 雌激素的总量分布特征

样品中雌激素含量如图 1所示,在所采集的崇明岛生物样品中,雌激素总量(以dw计)在1.10~7.38 ng ·g^-1范围内,平均值为4.25 ng ·g^-1.鱼类雌激素平均含量为3.05 ng ·g^-1,蟹类为4.91 ng ·g^-1,虾类为2.79 ng ·g^-1.含量大小依次为,蟹类＞鱼类＞虾类.

图 1

Fig. 1

图 1 样品中雌激素含量 Fig. 1 Concentrations of target estrogens in samples

由于本研究中所采集样品的生物种类不同,生长阶段也不尽相同,而Geyer等^[13]认为脂肪含量可综合反映生物的种类、 体重、 体长、 年龄、 遗传背景等生物因素.故利用脂肪所占质量分数将雌激素干重含量换算为雌激素脂肪量标准化含量(雌激素脂肪量标准化含量=雌激素干重含量/脂肪所占质量分数)，如图 2所示.样品中雌激素脂肪量标准化含量在5.01~83.41 ng ·g^-1范围内,平均值为40.75 ng ·g^-1.其中,鱼类雌激素脂肪量标准化含量平均为78.51 ng ·g^-1，蟹类为32.95 ng ·g^-1，虾类为34.18 ng ·g^-1. 对鱼和蟹类样品中的雌激素脂肪量标准化含量进行t检验,发现鱼类和蟹类样品之间雌激素脂肪量标准化含量存在显著差异性(P＜0.01,n=10),同样,对鱼类和虾类样品中的雌激素脂肪量标准化含量进行t检验,发现鱼类和虾类样品之间雌激素脂肪量标准化含量也存在显著差异性(P＜0.05,n=4).这可能是因为不同的生物种类由于其生活习性不同导致其对污染物的富集能力也有所不同.Liu等^[14]也认为生物体内雌激素含量可能与其生活习惯和食性等有关.对蟹类和虾类样品中的雌激素脂肪量标准化含量进行t检验,未发现蟹类和虾类中雌激素脂肪量标准化含量间的显著差异性.这可能与蟹类和虾类都属于底栖生物,生活习性相近有关.

图 2

Fig. 2

图 1 样品中雌激素含量 Fig. 1 Concentrations of target estrogens in samples

比较3种水生生物体内雌激素脂肪量标准化含量发现鱼类样品中雌激素脂肪量标准化含量水平明显高于蟹类和虾类样品中雌激素脂肪量标准化含量水平.这可能与鱼类(鲈鱼和鲫鱼)处于较高的营养级有关,通过食物链在生物体内富集是污染物进入生物体的一个重要途径,鱼类(鲈鱼和鲫鱼)处于食物链的较高等级,污染物易在其体内富集.本研究的鱼类样品中,鲈鱼中雌激素脂肪量标准化含量(83.41 ng ·g^-1)高于鲫鱼中雌激素脂肪量标准化含量(73.61 ng ·g^-1),这与鱼类的食性有很大关系,鲈鱼为肉食性鱼类,鲫鱼为杂事性鱼类,肉食性鱼类的饵料中的小鱼体内的污染物含量可能相当高^[15,16],这可能是导致鲈鱼体内雌激素脂肪量标准化含量高于鲫鱼体内雌激素脂肪量标准化含量的原因.

雌激素为脂溶性化合物,进入水生生物体内容易在脂肪中囤积,对本研究中脂肪含量与雌激素干重含量进行Pearson相关分析,发现雌激素干重含量和脂肪含量之间相关关系并不明显(P＞0.05).由于本研究中采集的样品生物种类不同,生长阶段也不尽相同,个体差异较大,这可能是导致雌激素干重含量与脂肪含量间相关关系不明显的原因.

对蟹类中雌性和雄性蟹中的雌激素干重含量进行t检验,发现雌雄个体之间雌激素含量显著性差异不明显(P＞0.05),其中天然雌激素(E1、 E2和E3)的总量出现雌性显著低于雄性的情况(见图 1),这可能是因为采样期正好是所采集生物的繁殖期或临近繁殖期,雌性体内雌激素大量消耗,导致雌性体内天然雌激素含量低于雄性体内天然雌激素含量,雌性和雄性蟹中的雌激素干重含量没有显著性差异的原因.

从检出率和检出含量看,甾醇类雌激素(E1、 E2、 E3和EE2)的残留明显低于酚类雌激素(BPA). E1、 E2、 E3和EE2的检出率在66.67%以内,检出平均含量(以dw计)在0.17~0.69 ng ·g^-1范围内.而BPA的检出率高达100%,检出平均含量为2.60 ng ·g^-1. Liu等^[14]在云南滇池野生鱼类体内也发现甾醇类雌激素(E1、 E2、 E3和EE2)含量远小于酚类雌激素(BPA等).

甾醇类雌激素中E1、 E2、 E3和EE2的检出率分别为50%、 58.33%、 66.67%和33.33%,检出的含量范围(以dw计)分别为ND~0.63 ng ·g^-1、 ND~1.91 ng ·g^-1、 ND~0.2.51 ng ·g^-1和ND~1.48 ng ·g^-1.其中,EE2的检出率最低为33.33%,且平均值为0.36 ng ·g^-1小于E3(0.69 ng ·g^-1)和E2(0.42 ng ·g^-1).而Liu等^[14]及Lai等^[17]在滇池样品中发现的鱼类对EE2的富集能力高于其他甾醇类雌激素,本研究则发现EE2的含量处于较低水平,这可能与崇明地区EE2较少的输入有关.

对于天然雌激素而言,本研究的生物体样品中E1、 E2和E3含量(以dw计)的中值分别为: 0.05、 0.29和0.38 ng ·g^-1,平均值分别为:0.17、 0.42和0.69 ng ·g^-1,均小于1 ng ·g^-1,这很可能是鱼体内天然的血源性雌激素的正常水平.同时Liu等^[18]也发现云南水产研究所饲养的高背鲫鱼幼苗的鱼肉中雌激素E1和E3未检出,E2含量(以dw计)为1.02 ng ·g^-1,并认为是天然存在于鱼体内的甾醇类雌激素.

同时,在天然甾醇类雌激素中,对E2和E3含量进行Pearson相关分析发现,研究区水生生物体中E2和E3含量显著相关(P＜0.01).这是由于生物体对E2的代谢可产生E3,因此表现出E2与E3含量的相关关系,进一步证明了其血源性的来源.

BPA在所有样品中均有检出,含量范围(以dw计)为0.57~4.96 ng ·g^-1,平均值为2.60 ng ·g^-1,中值为2.36 ng ·g^-1.徐英江等^[19]在烟台市场的80个水产品中发现BPA最高可达20.3 ng ·g^-1,但Zou等^[20]在青岛市场的鱼和虾中未检测出BPA. Basheer等^[21]针对新加坡一超市里的海产品(包括对虾、 蟹和海鱼)进行雌激素含量检测,发现蟹中的BPA含量较高为213 ng ·g^-1. Pojana等^[22]的研究发现地中海贝类中只含有E2和NP两种污染物.本研究中崇明地区生物体内BPA含量小于烟台市场水产品和新加坡超市海产品中的含量,大于青岛市场的鱼和虾以及地中海的海贝类中的含量,处于中等水平.

3 健康风险评价

本研究采用雌激素每日允许摄入量ADI[acceptable daily intake,以体重计，ng ·(kg ·d)^-1]或参考剂量RfD[reference dose,以体重计，ng ·(kg ·d)^-1] 作为健康风险评估基准(如表 3),将其与居民实际每日通过食用水产品摄入的雌激素EDI[estimated daily intake,以体重计，ng ·(kg ·d)^-1,公式(1)]对比来衡量食用水产品摄入的雌激素的健康风险HR[health risk,公式(2)]^[23].

表 3(Table 3)

表 3 雌激素的风险评估基准 Table 3 Benchmark of risk assessment for estrogens 化合物 (雌二醇当量)ADI/RfD(以体重计)/ng·(kg·d)-1 文献 E1 2.075E+03 [24] E2 5.000E+01 [25] E3 8.460E+03 [24] EE2 4.000E+01 [24] BPA 5.000E+04 [26] 1)取范围中的最高值

表 3 雌激素的风险评估基准 Table 3 Benchmark of risk assessment for estrogens

2009年上海市居民淡水鱼消费量(以湿重计，下同)为21.78 g ·d^-1,甲壳类消费量为28.43 g ·d^{-1 [27],本研究中鲈鱼和鲫鱼属于淡水鱼类,蟹和虾属于甲壳类.将雌激素干重含量换算为湿重含量,按照居民体重60 kg[23,28],根据公式(1)计算居民每天通过食用水产品摄入的雌激素的量EDI.按公式(3)计算通过食用水产品摄入的雌激素存在的健康风险HR[23].计算结果如表 4所示.}

表 4(Table 4)

表 4 每日摄入的雌激素量EDI和健康风险HR Table 4 Estimated daily intake and health risk of estrogens via consumption of aquatic product 项目 水产品类别 E1 E2 E3 EE2 BPA EDI 淡水鱼 0.03 0.03 — — 0.21 甲壳类 0.02 0.07 0.13 0.07 0.40 HR 淡水鱼 1.40E-04 5.80E-04 — — 4.22E-06 甲壳类 1.05E-04 1.34E-03 1.48E-05 1.67E-03 7.98E-06 1)EDI单位：以体重计，ng ·(kg ·d)-1

表 4 每日摄入的雌激素量EDI和健康风险HR Table 4 Estimated daily intake and health risk of estrogens via consumption of aquatic product

由表 4可知,崇明岛淡水鱼类和甲壳类水产品中各雌激素(E1、 E2、 E3、 EE2和BPA)对居民的健康风险HR的值都远小于1,摄入量EDI与ADI相差均在3个数量级以上,可见通过食入崇明岛的淡水鱼类和甲壳类水产品摄入的雌激素量不足以对人体产生健康风险影响.

但本研究中没有分年龄段考虑健康风险,不同年龄段的人群对水产品消费量不同^[27],且水产品中还会含有PCBs、 DDT、 HCH、 PBDEs以及HBCDD等其他污染物^[29,30,31],人体也会通过其他途径暴露于雌激素污染物,会增加水产品食用的健康风险.此外，雌激素的协同作用,雌激素与其它物质的累加效应以及雌激素的中介效用等也是不容忽视的^{[32,33,34,35]}.

4 结论

(1) 使用同时检测生物体中甾醇类和酚类雌激素的方法，检测崇明岛生物样品雌激素总含量(以dw计)在1.10~7.37 ng ·g^-1范围内,平均值为4.21 ng ·g^-1.雌激素脂肪量标准化含量在5.01~83.41 ng ·g^-1之间,平均值为40.75 ng ·g^-1,其中鱼类平均雌激素脂肪量标准化含量最大,其次为虾类，最小为蟹类.

(2) 甾醇类雌激素(E1、 E2、 E3和EE2)的残留量明显低于酚类雌激素(BPA)的残留量.甾醇类雌激素中E1、 E2和E3干重含量较低,平均值均小于1 ng ·g^-1,可认为是生物体内血源性雌激素.人工合成的EE2的干重含量和检出率低于天然雌激素(E2和E3).而酚类雌激素BPA的干重含量(0.57~4.96 ng ·g^-1)与已有研究相比,处于中等水平.

(3) 对崇明水生生物中雌激素进行健康风险评估,发现崇明岛生物样品中雌激素含量水平低,不足以形成健康风险.但雌激素的协同作用、 雌激素与其它物质的累加效应以及雌激素的中介效用等,势必会增加食用水产品中雌激素的健康风险.