堆肥是畜禽粪便常用的一种处理方式，在堆肥过程中，一部分有机物在微生物作用下降解成二氧化碳、 水及氨等物质，导致堆体减容减重； 另一部分有机物在微生物的作用下转化为富里酸、 胡敏酸及胡敏素类等腐殖质物质，增强了堆肥的稳定度^{[1, 2, 3]}. 堆肥过程中，大部分有机物只有在溶于水后才能被微生物利用，因此，水溶性有机物(DOM)是研究堆肥物质转化的重要介质，它比固相有机质更能灵敏反映堆肥过程物质演化特征^{[4, 5, 6]}. 此外，堆肥DOM中含有的有机酸和腐殖酸类物质，能够吸附和络合重金属，引起后者存在形态和生物有效性的改变^[7]. 因此，近年来，相关学者采用各种技术如荧光光谱、 红外光谱及离子色谱等^{[7, 8, 9]}，对堆肥DOM组成和结构进行分析，探究堆肥物质演化规律及其环境效应.

畜禽粪便中含有一定量的重金属，堆肥过程有机物降解造成的“浓缩效应”进一步提高了其含量，使重金属成为堆肥农用的一个重要限制因子^[5]. 按照Tissier 的五步提取法，堆肥重金属可分为可交换态、 碳酸盐结合态、 铁锰氧化物结合态、 有机结合态和残渣态，在这5种形态的重金属中，可交换态中水溶态重金属的活性最高，对植物的生物有效性最大，其他各种形态的重金属，包括与有机物结合的部分，通常情况下不参与对植物的供给，生物有效性较低^[10]. 因此，研究畜禽粪便堆肥过程水溶态重金属的含量及其变化特征，对于堆肥产品农用风险评价具有重要意义，而这一方面目前国内外鲜有报道.

基于此，采集不同堆肥阶段的鸡粪样品，利用离子色谱、 三维荧光光谱、 紫外-可见吸收光谱和质谱，分别对这些样品浸提液中的小分子有机酸、 腐殖质和重金属的含量和变化进行分析，研究堆肥有机物演化对重金属生物有效性的影响特征及其机制，以期为堆肥产品农用风险评价提供科学依据.

于养殖场采集鸡粪，剔除其中的羽毛、 石块和塑料等杂物后，往里面添加剁至3~5 cm的杂草和树叶，调堆体混合物C/N=26.5，含水率56%后，在一个自制的静态堆肥反应器中强制通风进行堆肥，堆肥过程温度上升迅速，第5 d温度超过60℃，随后一直维持在60℃以上，第10 d进行翻堆，随后温度开始缓慢下降，第32 d降至室温. 加水翻堆进行二次发酵，第42 d二次发酵结束，于堆肥的0、 5、 10、 32及42 d采集堆肥样品，放置冰箱冷藏备用.

以堆肥干重固液比1(g) ∶10(mL)将鸡粪样品与双蒸水混合，浸提振荡12 h后，4℃下高速离心15 min，上清液过0.45μm滤膜，收集滤液，滤液中DOM含量(以溶解性有机碳DOC计)采用德国耶拿公司生产的multi N/C 2100型TOC仪测定.

采用美国戴安公司生产的ICS-2000离子色谱仪、 ED40电化学检测器和Chromeleon 6.5色谱工作站测定堆肥DOM中的小分子有机酸(乙酸、 琥珀酸、 苹果酸、 草酸、 酒石酸)，离子色谱其他测试条件以及样品中腐殖质的去除参考文献^[11]进行. 测定完后将所有有机酸加和，得到总酸含量.

将所有滤液稀释50倍后，采用日本日立公司生产的F-7000荧光分光光度计，测定激发波长(E_x )200~400 nm，发射波长(Em)280~500 nm范围内的三维荧光光谱图，并以双蒸水的三维荧光图为空白进行扣除，随后数据导出，参考He等的报道^[4]，在Matlab 7.0b上，计算三维荧光光谱中区域 200~250 nm/280~330 nm、 200~250 nm/330~380 nm、 200~250 nm/380~500 nm、 >250 nm/280~380 nm、 >250 nm/380~500 nm范围内的体积积分，其值分别标记为v₁、 v₂、 v₃、 v₄及v₅.

将所有滤液以双蒸水稀释50倍后，采用日本岛津公司生产的UV1700紫外-可见分光光度计，测定190~670 nm范围内的紫外吸收值. 参考前人报道^[12]，计算260~280、 460~480及600~670 nm波长范围内的积分面积A1、 A2及A3.

采用美国热电公司生产的ICP-OES重金属测定仪，测定堆肥滤液中Al、 As、 Cr、 Cu、 Fe、 Mn和Pb的浓度. 并在SPSS 16.0上，对重金属和堆肥有机物进行相关性分析和主成分分析^[5]，研究堆肥过程水溶性有机物演化对重金属分布的影响.

根据前人的报道可知^[13,14]，堆肥过程有机质的演化可分为降解、 腐殖化及进一步聚合和压缩这3个过程. 降解的中间产物为小分子有机酸，腐殖化的产物为腐殖酸，而高度聚合化的结果是堆肥有机物分子聚合度的提高. 因此，本研究从堆肥过程小分子有机酸、 腐殖酸和高聚合度有机物的组成和变化来分析堆肥过程DOM的演化特征及其机制.

表 1为不同堆肥阶段DOM中小分子有机酸的含量，该表显示，乙酸在整个堆肥过程中均能检测到，为堆肥中最常见的小分子有机酸，但是堆肥DOM中乙酸浓度较低，在堆肥过程中其分布在2.24~13.04 mg ·L^-1之间； 琥珀酸在堆肥初期和高温期均未检测到，直到堆肥结束时才检测到，其浓度(66.1 mg ·L^-1)较高； 苹果酸为堆肥DOM中浓度最高的小分子有机酸，其在堆肥初期和高温期的浓度超过2 000 mg ·L^-1，但是，该酸在一次发酵结束和二次发酵过程均未检测到，暗示苹果酸主要为有机物降解中间产物； 堆肥DOM中草酸的浓度分布在1.68~2.39 mg ·L^-1，但是该酸堆肥初始和一次发酵结束均未检测到； 酒石酸在一次发酵过程中的浓度分布在39.24~51.58 mg ·L^-1之间，二次发酵产物中未检测到.

表 1(Table 1)

表 1 鸡粪堆肥过程小分子有机酸含量变化1)/mg ·L-1 Table 1 Changes in the content of organic acids during chicken manure composting/mg ·L-1 时间/d 乙酸 琥珀酸 苹果酸 草酸 酒石酸 总酸 0 12.90 nd 2097.55 nd 39.24 2149.69 5 12.52 nd 2155.61 2.36 43.09 2213.58 10 12.79 nd 2136.94 1.68 51.58 2202.99 32 2.24 nd nd nd 46.70 48.94 42 13.04 66.10 nd 2.39 nd 81.53 1)nd 表示未检测到

表 1 鸡粪堆肥过程小分子有机酸含量变化 1)/mg ·L-1 Table 1 Changes in the content of organic acids during chicken manure composting/mg ·L-1

总体看来，各种有机酸主要出现在一次发酵过程中，尤其是一次发酵的高温期，其浓度含量最高(>2 200 mg ·L^-1)，而在二次发酵过程中，有机酸的含量较低(<100 mg ·L^-1)，许多小分子有机酸未检测到，李英军等对鸡粪堆肥样品浸提液中小分子有机酸含量的分析也得到了类似的结果^[11]. 由于小分子有机酸来自堆肥有机物的降解，其含量可以直接反映堆肥过程有机物的降解剧烈程度，故上述结果表明，鸡粪堆肥过程有机物的降解主要发生在堆肥初期和高温期，而在堆肥后期和二次发酵过程中，有机物降解较少.

堆肥腐殖化的产物是腐殖酸类物质，腐殖酸中由于含有大量的苯环结构，在吸收一定的光能后能够产生荧光，所产生的荧光光谱特征与腐殖酸分子结构直接有关，因此，本研究采用三维荧光光谱研究堆肥过程有机物的腐殖化过程^[12].

不同堆肥阶段DOM的三维荧光光谱如图 1所示，该图显示，鸡粪DOM的三维荧光光谱图主要有4个荧光峰，其峰位值分别位于270 nm/350 nm、 245 nm/375 nm、 225 nm/365 nm及325 nm/420 nm附近，根据前人的报道可知，前3个荧光峰为类蛋白荧光峰，而第4个荧光峰为类腐殖质荧光峰^[15,16]. 在这4个荧光峰中，前3个类蛋白荧光峰强度较高，而第4个类腐殖质荧光峰强度较弱，并且文献^{[15, 16, 17]}所报道的类腐殖质峰中的另外一个峰——类富里酸峰，在本研究中未观察到，可能被附近的类蛋白峰掩盖了. He 等^[4]对生活垃圾堆肥过程DOM三维荧光光谱的研究也显示，堆肥DOM组成复杂，不同荧光基团产生的荧光峰可能相互重叠.

为研究堆肥过程类蛋白和类腐殖质物质含量变化，本研究将堆肥DOM的三维荧光光谱根据文献报道分为5个区域^[4]，其中区域Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅳ为类蛋白物质，而区域Ⅲ和Ⅴ为类腐殖质物质^[17]. 图 2为5个区域对应的体积在堆肥过程中的变化图，其中显示，堆肥过程区域Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅳ在初期(0~5 d)呈上升趋势，随后其浓度下降，总体呈下降趋势，显示堆肥过程类蛋白物质在发酵初期不断增多，随后不断降低. 初期的增多可能与微生物活动旺盛、 大量不可溶的蛋白类物质被溶出和释放有关，而后期的降低与这一时期类蛋白物质大部分被降解有关. 与类蛋白物质不同，类腐殖质荧光区Ⅲ和Ⅴ在堆肥初期呈下降趋势，而在后期和二次发酵过程该值明显上升，显示堆肥初期简单的类腐殖质物质也不断被降解和转化，在堆肥后期腐殖质不断被合成，含量增加，即堆肥过程腐殖化作用主要发生在堆肥后期和二次发酵过程中.

前人研究显示，在有机物的紫外-可见吸收光谱中，波长260~280 nm、 460~480 nm和600~700 nm范围内的吸收值A₁、 A₂和A3依次与苯环化合物含量、 开始腐殖化有机物的含量及高度聚合有机物的含量有关^[18]. 图 3(a)显示，堆肥初期(0~5d)A1的积分面积呈下降趋势，而在随后的5~32 d又呈上升趋势，尤其是在堆肥的5~10 d上升最为剧烈，显示在堆肥升温期苯环化合物不断减少，在堆肥的高温期和降温期苯环化合物不断增多，表明堆肥升温期是有机物的降解期，而高温期和降温期由于苯环化合物在合成腐殖质物质，其浓度不断升高，二次发酵过程中A1的下降可能与这一时期主要出于厌氧过程，苯环化合物被降解有关. 堆肥过程A2和A3的变化与A1类似，其上升最为剧烈的为堆肥5~10 d，显示这一时期是有机物腐殖化和缩合化最为剧烈的时期.

图 1

Fig. 1

图 1 鸡粪堆肥过程水溶性有机物三维荧光光谱图变化 Fig. 1 Changes in the three dimensional fluorescence spectra of dissolved organic matter during chicken manure composting

图 2

Fig. 2

图 2 鸡粪堆肥过程不同荧光组分的变化特征 Fig. 2 Change characteristics of different florescence fractions during chicken manure composting

根据前人的报道^[12,18],腐殖化指数被定义为面积A₂与A₁的比值(A₂/A₁)、 A₃与A₁的比值(A₃/A₁)以及A₃、 A₂之和与A₁的比值(A₃₊₂/A₁). A₂/A₁反映了木质素在开始转化时的比例，A₃/A₁表示了腐殖化物质和非腐殖化物质的比例，而A₃₊₂/A1可表征腐殖化与非腐殖化物质的相关性，该值增加速率越快，腐殖化水平越大. 图 3(b)显示，A₂/A₁、 A₃/A₁及A₃₊₂/A1在堆肥的0~10 d呈不断上升趋势，这依次说明堆肥中木质素在开始转化时的含量越来越高、 腐殖化物质与非腐殖化物质的比率越来越高、 以及腐殖化增大水平越来越大(即有机物缩合度不断提高). 在随后的降温期，A₂/A₁和A₃/A1呈下降趋势，显示可转化的木质素的含量和腐殖质物质的相对含量不断减少，即部分缩合度不高的芳构化物质被降解了，但是，在二次发酵过程中，A₂/A₁、 A₃/A₁及A₃₊₂/A1值又开始上升，显示二次发酵提高了堆肥的腐殖化率和有机物分子的聚合度. 综合以上结果可以知道，堆肥过程有机物的腐殖化和高度聚合化主要发生在高温期和二次发酵过程.

在堆肥中的各形态的重金属中，水溶态重金属的活性最高，其最容易被植物利用，毒性最强. 因此，本研究分析了堆肥过程水溶态重金属的含量及其变化，结果如表 2所示. 在所分析的7种重金属中，Fe的浓度最高，其在堆肥过程中的浓度分布在1.069~7.106 mg ·L^-1之间； Al、 As、 Cr、 Cu和Mn的浓度分布在0.1~1.008 mg ·L^-1之间，显著低于Fe的含量； 堆肥浸提液中浓度最低的重金属为Pb，其值在0.003~0.02 mg ·L^-1范围内，不足其他重金属的十分之一.

Al在堆肥过程中的变化波动较大，经堆肥后其浓度由0.027 mg ·L^-1上升至0.744 mg ·L^-1，显示堆肥处理增加了鸡粪中水溶态Al的含量； Cr、 Cu、 Mn及Pb的浓度，随着堆肥的进行持续降低，表明堆肥处理可以有效降低Cr、 Cu、 Mn及Pb的溶出，进而降低了其生物可利用性； As和Fe的浓度尽管在堆肥过程中出现了波动，但是经堆肥处理后其浓度也明显下降，尤其是Fe，由未堆肥的5.958 mg ·L^-1降至堆肥结束的1.069 mg ·L^-1，显示堆肥处理也降低了As和Fe的生物有效性.

图 3

Fig. 3

图 3 鸡粪堆肥过程特征紫外吸收参数变化 Fig. 3 Changes in the UV-visible parameter during chicken manure composting

表 2(Table 2)

表 2 鸡粪堆肥过程水溶性重金属和有机物含量变化 /mg ·L-1 Table 2 Changes of dissolved heavy metals and organic matter during chicken manure composting/mg ·L-1 时间/d Al As Cr Cu Fe Mn Pb DOC 0 0.027 0.441 0.212 1.008 5.958 0.298 0.018 2492 5 0.148 0.383 0.194 0.772 5.628 0.292 0.02 2798 10 0.036 0.351 0.182 0.618 7.106 0.203 0.019 2335 32 0.744 0.28 0.173 0.394 4.943 0.188 0.013 1615 42 0.437 0.359 0.121 0.375 1.069 0.095 0.003 2292

表 2 鸡粪堆肥过程水溶性重金属和有机物含量变化 /mg ·L-1 Table 2 Changes of dissolved heavy metals and organic matter during chicken manure composting/mg ·L-1

除了Cr可以阴离子形式存在而不与有机物结合外，包括Al在内的其他金属均能与有机物结合^{[19, 20, 21]}. 表 2显示，堆肥浸提液中DOM浓度较高(>1 615 mg ·L^-1)，其上的官能团可能对重金属的分布和生物有效性产生重要影响^[7]. 为阐明这种影响，本研究采用相关性分析和主成分分析，研究了堆肥DOM组成对重金属分布的影响.

表 3显示，除了Al外，堆肥浸提液中的DOM的浓度(DOC)随重金属含量增加呈增加态势，但是堆肥DOC与重金属浓度未呈现显著相关性，这一结果表明，堆肥浸提液中并不是所有的有机物都能影响重金属的分布； 相关分析也表明，堆肥DOM中的小分子有机酸含量与重金属未呈现出显著相关(数据未列出)，因此可以知道这一部分有机物在堆肥过程对重金属分布影响不大； 除了小分子有机酸外，腐殖质和蛋白类物质也是堆肥DOM的重要组成组分，因此，本研究对堆肥浸提液中的重金属与腐殖质及蛋白类物质进行了相关性分析，结果显示，堆肥浸提液中As和Cu的含量与区域体积v₅(类腐殖质物质)显著相关(P＜0.05)，而与区域体积v₁、 v₂、 v₄(类蛋白物质)及区域体积v₅(类富里酸物质)均未达到显著相关，显示堆肥浸提液中As和Cu主要结合在类腐殖质物质上. 一般而言，类腐殖质物质结构复杂、 分子量大，生物可利用性低^{[22, 23]}，浸提液中As和Cu与类腐殖质物质结合在一起，其生物可利用性低. 剩余的水溶态重金属中，Pb和Mn的含量尽管未与类腐殖质物质荧光区区域体积达到显著相关，但是其相关性指数高于类蛋白和类富里酸物质，显示浸提液中大部分Pb和Mn也与类腐殖质物质结合在一起，生物有效性也低. Cr和Fe含量与类腐殖质在堆肥过程呈现相同的变化趋势，但是二者相关性较差，这可能分别来自于下列原因: Cr可以阴离子的形式存在，导致其与重金属结合很难； 而Fe在堆肥过程中，可以通过还原作用由溶解度较低的三价铁转化为溶解度较高的二价铁^[24]. Al与区域体积v5(腐殖质物质)呈现负相关，而与区域v1和v2(类蛋白物质)正相关，显示浸提液中Al主要结合在易微生物利用的类蛋白物质上，生物可利用性高.

表 3(Table 3)

表 3 堆肥样品中水溶性重金属与有机物含量相关性分析 1) Table 3 Correlation analysis between dissolved heavy metals and organic matter in the compost sample DOC v1 v2 v3 v4 v5 Al -0.824 0.691 0.715 -0.123 -0.033 -0.925* 0.087 0.196 0.174 0.844 0.958 0.024 As 0.805 -0.940* -0.795 0.623 -0.329 0.943* 0.1 0.017 0.108 0.262 0.589 0.016 Cr 0.312 -0.462 -0.647 -0.271 -0.107 0.558 0.61 0.433 0.238 0.659 0.864 0.328 Cu 0.662 -0.828 -0.843 0.223 -0.258 0.884* 0.224 0.083 0.073 0.718 0.675 0.046 Fe 0.16 -0.151 -0.464 -0.651 0.134 0.357 0.797 0.808 0.431 0.234 0.83 0.555 Mn 0.503 -0.499 -0.577 -0.104 0.003 0.676 0.388 0.392 0.309 0.867 0.996 0.211 Pb 0.384 -0.229 -0.449 -0.507 0.239 0.527 0.524 0.711 0.449 0.383 0.699 0.361 1)*表示显著相关

表 3 堆肥样品中水溶性重金属与有机物含量相关性分析 1) Table 3 Correlation analysis between dissolved heavy metals and organic matter in the compost sample

参考前人报道进行的主成分分析结果也显示^[25]，堆肥DOM中类蛋白物质荧光区v1、 v2和v4及Al分布在第二主成分的正方向，而类腐殖质物质与其他重金属分布在第二主成分的负方向上(图 4)，进一步证实堆肥浸提液中Al主要与类蛋白物质结合在一起，而其他重金属主要结合在腐殖质上. 即堆肥处理降低了除Al外其他6种重金属的生物有效性.

图 4

Fig. 4

图 4 堆肥样品中水溶性重金属和有机物的主成分分析 Fig. 4 Principal factor analysis among dissolved heavy metals and organic matter in the compost sample

目前对于重金属生物有效性研究最新的技术为薄膜扩散梯度技术(diffusive gradients in thin-films technique，DGT)^[26]，它是目前为止模拟生物吸收较好的一种新型原位采集并测量重金属生物有效性的技术^[27]. DGT技术所测量的重金属有效态是由结合相的结合能力决定的. 对于稳定结合的无机、 有机配合物，DGT技术中的结合相不能对其采集^[28]，因此，对于堆肥浸提液中重金属的生物有效性，DGT技术测定还存在一定缺陷.

(1)堆肥过程有机酸主要产生于升温期，降温过程和二次发酵时期有机酸产生量很少，在各种有机酸中，苹果酸的含量最高.

(2)堆肥过程有机物的演化可分为降解、 腐殖化和高度聚合化这3个过程，降解主要发生在堆肥升温期和高温期，而腐殖化和聚合化主要发生降温期和二次发酵过程.

(3)堆肥过程通过降低了水溶态重金属的含量和提高了腐殖质类物质的稳定性，从而降低堆肥样品中Al、 As、 Cr、 Cu、 Fe、 Mn及Pb的生物有效性.