2014, Vol. 35
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
稻田生态系统在农业生产和全球氮循环过程中起着举足轻重的作用，由于水稻特殊的种植制度，稻田土壤长期处于淹水状态且干湿交替频繁发生，使得水稻土本身具有较强的氧化还原活性，反硝化作用活跃. 反硝化作用是微生物在嫌气条件下进行的硝酸盐还原过程，在多种微生物的参与下，在硝酸盐还原酶(Nar)、 亚硝酸盐还原酶(Nir)、 一氧化氮还原酶(Nor)以及一氧化二氮还原酶(Nos)的作用下，硝酸盐经四步还原反应，即NO-3 NO-2 NO N2 O N2，依次被还原，最终转化成氮气释放，并在中间过程释放强效应的温室气体N2 O，因此反硝化作用一直受到广泛的关注.
基于通量观测和反硝化活性测定，国内外学者对于影响反硝化作用的物理化学因素、 不同土壤系统中反硝化作用发生的强度及其对N2 O气体排放的贡献等已有大量研究[1, 2]. 众多研究表明，土壤的反硝化作用受到pH、 有机质含量、 CO2、 温度、 氮素、 水分含量和剖面深度等因素的影响. 由于反硝化相关的酶多是在低氧条件下才能被诱导合成并具有活性，因而水分和O2含量是影响反硝化作用的重要因素，二者通过影响土壤氧化还原电位间接对反硝化过程产生影响. 一般认为，土壤反硝化作用随着水分的增加而增加[3, 4]，但也有研究发现，在临界饱和水及干湿交替条件下土壤N2 O排放量最大[5, 6, 7]. 但由于反硝化过程复杂，参与反硝化作用的微生物种类非常多，已发现有80多个属的细菌和部分古菌、 真菌和放线菌都可能参与反硝化作用的全部或部分反应步骤[8]，且多种功能基因(如narG、 napA、 nirK、 nirS、 norB、 NosZ等)参与其中的反应过程，因此对反硝化微生物的研究相对困难[9, 10, 11, 12]. 且目前多数研究主要集中于各种理化因素对反硝化作用的影响和对N2 O释放的相对贡献，对于反硝化过程发生的微生物学机制的研究较少.
此外，反硝化作用通常伴随着硝化作用发生，硝化-反硝化耦合作用是土壤氮肥损失最主要的途径，可达投入氮肥量的40%[13, 14]. 许多研究发现，氮肥的施入对N2 O的释放和反硝化作用有明显的促进效应，尤其是当土壤水分含量很高时[7, 15, 16]. 但目前对反硝化作用的研究多只针对反硝化这一过程进行. 因此，本研究在室内微宇宙培养条件下，通过设置不同水分梯度条件来考察硝化和反硝化作用对水分梯度变化的响应，并结合运用定量PCR和限制性末端片段长度多态性(T-RFLP)技术等研究硝化-反硝化微生物的响应特征，揭示不同水分条件下稻田土壤硝化-反硝化作用特征以及二者的耦合作用及其微生物学机制，以期为认识稻田土壤氮循环过程和为稻田土壤水分和氮肥管理提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 土壤样品与实验处理供试水稻土采自湖南省桃源县一长期植稻农田(东经111°26′39″，北纬28°55′51″)，取样深度为0~30 cm. 该土壤为第四季红壤发育而形成的水稻土，土壤为弱酸性，pH=5.9，EC=0.07 dS ·m-1，热水可溶性有机碳(HWC)为415 mg ·kg-1,取样时土壤含水量约25%，田间持水量(WHC)为50.95%. 土壤运回实验室后，过2.0 mm筛存放于温室备用. 为方便土壤Eh测定，微宇宙培养实验采用250 mL玻璃广口瓶进行，实验设置4个水分梯度: 即田间持水量(WHC)的30%、 60%、 90%及淹水状态(waterlog)，分别在第7、 15、 30、 60 d进行破坏性取样，每个处理设置4个重复. 微宇宙培养实验过程如下: 分别向每个广口瓶装入50 g土壤，通过向土壤中均匀地添加不同量的无菌水，调节土壤含水率至田间持水量(WHC)的30%、 60%、 90%以及淹水约2 cm深，并在调节水分梯度的同时加入终含量为10 mg ·kg-1的NH+4-N(氯化铵). 此后将Eh计的Pt电极插入土壤，以铝箔纸盖住瓶口，置于28℃培养. 培养过程中通过每周补加水分保持恒重，培养开始后每隔7 d再次加入10 mg ·kg-1的NH+4-N(与调节含水量同时进行)，如遇当天或第2 d取样的处理则加等量无菌水替代氯化铵溶液，以保证每次取样均在加氯化铵后7 d进行. 每次于采样前一天把广口瓶用涂有真空硅脂的橡胶塞密封，继续培养24 h后用注射器抽取50 mL气体置于气袋中待测，然后把广口瓶中的土样混匀后分为两份，一份经冷冻干燥后保存于-80℃冰箱用于DNA的提取，其余保存在4℃冰箱用于基本理化性质的测定.
1.2 土壤 Eh、 NH+4-N、 NO-3-N的测定土壤Eh值测定采用PRN-41便携式土壤Eh计(DKK，TOA，Tokyo，Japan)进行，该Eh计由测定电极和参比电极组成，培养过程中Pt电极一直插于土壤中，测量时将参比电极尽量靠近Pt电极插入土壤深度约为2 cm，待数值稳定1 min不动时进行读数，每次测定时通过在不同方位移动参比电极读取3～4个读数取其平均值作为Eh读数.
土壤NH+4-N、 NO-3-N含量的测定以1 mol ·L-1 KCl溶液(土水比1 ∶5)在200 r ·min-1下振荡浸提1 h，离心，过滤，用连续流动分析仪(SAN+ +，Skalar，Holland)测定.
1.3 N2 O和CO2的测定N2 O和CO2测定分别以带有ECD电子捕获检测器和FID氢火焰检测器的气相色谱仪(Agilent GC 7890A)进行.
1.4 土壤 DNA提取土壤总DNA提取采用PowerSoilTM Total DNA Isolation试剂盒进行(MO BIO laboratories，CA，USA)，称取0.25 g经过冷冻干燥后的土样，按试剂盒提供的操作步骤进行，以FastPrep细胞破碎仪(Qbiogene Inc.，USA)进行细胞破碎处理，速度5.0 m ·s-1，时间45 s. 提取的DNA在1%的琼脂糖胶中进行电泳检测.
1.5 定量 PCR分析功能基因的定量分析采用SYBR GREEN法，亚硝酸盐还原酶基因nirK、 nirS、 氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的amoA基因的定量分析引物分别为F1aCu/R3Cu、 cd3aF/R3cd[17]、 amoA1F/amoA2R[3]、 CrenamoA23f/CrenamoA616r[18]. 25 μL定量PCR反应体系中包括2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)12.5 μL，引物(浓度为10 μmol ·L-1)各0.5 μL以及10倍稀释的模板DNA 2 μL. Real-time PCR反应在Bio-rad iQ5机器上运行. 其中nirK、 nirS基因均采用touchdown程序，nirK的扩增程序为: 95℃ 2 min； 95℃ 30 s，63℃ 30 s(-1℃ /cycle)，72℃ 30 s(5个循环)； 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s (30个循环). nirS的扩增程序为: 95℃ 2 min； 94℃ 30 s，58℃ 60 s(-1℃/cycle)，72℃ 30 s(5个循环)； 94℃ 30 s，53℃ 60 s，72℃ 30 s(30个循环). AOB和AOA amoA的退火温度均为55℃，扩增分别采用35和40个循环. 以上 4个基因均在 83℃ 收集反应荧光信号，数据分析采用iCycler软件.
1.6 T-RFLP方法反硝化微生物的群落结构组成以T-RFLP方法进行，nirS基因的PCR扩增引物与定量PCR所用引物(cd3aF/R3cd)相同，前引物5′ 端以荧光染料6-carboxyfluorescein(6-FAM) 标记. 50 μL的反应体系中包括2×Premix Ex TaqTM (TaKaRa，Japan)25 μL，引物(浓度为10 μmol ·L-1)各1 μL以及10倍稀释的模板DNA 4 μL. 扩增采用touchdown程序，反应条件为: 95℃ 5 min； 95℃ 45 s，63℃ 30 s(-1℃/cycle)，72℃ 30 s(5个循环)； 95℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s(30个循环)； 72℃ 6 min. 被标记的PCR产物使用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，USA)试剂盒进行纯化，具体步骤按照说明书进行. 纯化的PCR产物以限制性内切酶Msp Ⅰ(Takara，Japan)进行酶切. 20 μL的酶切反应体系包括纯化后的PCR产物6 μL，限制性内切酶(Msp Ⅰ)1 μL，10×T Buffer 和0.1% BSA各2 μL，其余以无菌水补足. 在37℃条件下反应3 h，然后把以上酶切产物送至测序公司进行纯化、 电泳和测序. T-RFLP图谱分析使用GeneMapper(Applied Biosystems)软件进行分析，根据标准样品ROX-500的检测范围，选取长度小于500 bp的片段进行分析. 把片段长度之差小于1 bp的片段进行合并，计算出每个检测峰的峰高占所有检测峰中最大峰高的百分比，其中百分比小于0.5%的检测峰作为噪声值被剔除.
1.7 数据处理实验中的数据作图分析在Origin8中完成，统计分析在SPSS 16.0软件中进行，其中，差异显著性检测采用单因素方差分析(S-N-K检验，P＜0.05)，相关性用直线相关分析(Bivariate过程)，采用Spearman相关系数计算，双尾显著性检验. 对T-RFLP的结果采用典型对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)来研究样品间群落组成的差异及其与环境变量的关系，在CANOCO 4.5软件中完成.
2 结果与分析 2.1 不同水分梯度下土壤Eh的变化淹水处理后，土壤Eh迅速降低，整个培养过程中淹水处理土壤Eh在107～245 mV之间，显著低于非淹水处理(444～640 mV). 各处理中，除30%WHC处理土壤Eh(521～560 mV)随培养时间延长无显著变化外，其余处理土壤Eh在培养后期显著增加(表 1). 60% WHC处理土壤Eh除在60 d时 (约621 mV)显著高于30%WHC(约555 mV)处理外，其余时间点土壤Eh与30%WHC无明显区别. 90% WHC处理土壤Eh在培养前期(7 d时)较低(444 mV)，之后逐渐增加至约640 mV. 淹水处理土壤Eh在培养前30 d无明显变化(107~131 mV)，培养至60 d时增加至245 mV. 总体来说，Eh与土壤含水量呈显著负相关关系(r=-0.506，P＜0.05，表 2).
 | 表 1 培养过程中土壤Eh的变化1)/mVTable 1 Dynamics of soil Eh during microcosm incubation/mV |
供试水稻土的NH+4-N和NO-3-N本底值分别为56.96 mg ·kg-1和1.76 mg ·kg-1. 培养过程中每7 d向土壤中加入10 mg ·kg-1 NH+4-N，培养过程中NH+4-N和NO-3-N的含量变化如图 1、 2所示. 除 90%WHC处理土壤外，其余各处理土壤中NH+4-N均 呈现出不同程度的累积现象. 其中，30%WHC处理土壤铵态氮明显累积，培养7~60 d时NH+4-N从51.07 mg ·kg-1明显增加至149.3 mg ·kg-1，而NO-3-N没有明显累积，在0～45.87 mg ·kg-1之间波动. 60%WHC处理土壤NH+4-N在7～60 d的培养过程中从61.26 mg ·kg-1明显增加至121.7 mg ·kg-1，但土壤NO-3-N含量在培养前30 d(67.52～70.57 mg ·kg-1)显著高于其它所有处理(除了30 d时与90%WHC处理无显著差异外)，且在30 d后增至92.72 mg ·kg-1. 90% WHC处理土壤NH+4-N浓度在第7 d和第15 d时较高，分别为52.85 mg ·kg-1和49.22 mg ·kg-1，但在培养至30 d后显著降低至13.13 mg ·kg-1以下； NO-3-N浓度则相反，在培养初期较低(3.89～19.16 mg ·kg-1)，但在培养30 d后，显著增高至133.4 mg ·kg-1. 这些结果表明60% WHC和90% WHC处理土壤在培养过程中，发生了明显的硝化作用. 淹水处理(waterlog)土壤随培养时间延长，NH+4-N浓度一直增加，而NO-3-N浓度在整个培养过程中均低于3 mg ·kg-1. 总体来说，土壤NO-3-N含量与土壤Eh呈极显著正相关关系(r=0.829，P＜0.05)，而与土壤含水率的相关关系不显著.
| 表 2 土壤理化指标及基因丰度等的相关分析1)Table 2 Correlations among soil physiochemical properties and gene abundances |
 | 图 1 土壤NH+4-N浓度Fig. 1 Concentration of soil NH+4-N |
 | 图 2 土壤NO-3N浓度Fig. 2 Concentration of soil NO-3-N |
在每次取样前24 h，培养瓶以密闭胶塞密闭后继续培养24 h，收集气体分析N2 O和CO2产生速率，结果表明，在不同取样时间下，30%和60%WHC处理土壤均检测不到N2 O的产生，而90%和淹水处理土壤中能检测到明显的N2 O的释放，且N2 O的产生速率(以干土计，下同)在30 d时N2 O最高(图 3)，分别为5.49 mg ·(kg ·h)-1和1.15 mg ·(kg ·h)-1，表明90%WHC和淹水处理土壤中有反硝化作用发生. CO2分析结果显示其变化范围(以干土计，下同)为229～756 mg ·(kg ·h)-1，所有处理中，60%WHC和90%WHC处理培养7 d时CO2的产生速率最高，分别为756 mg ·(kg ·h)-1和754 mg ·(kg ·h)-1，且显著高于30%WHC[385 mg ·(kg ·h)-1]和淹水处理[480 mg ·(kg ·h)-1](图 4). 7 d后，除淹水处理土壤的CO2产生速率在培养过程中一直下降外，其他3个非淹水处理均表现出先降低后小幅增加的趋势(图 4).结合该水稻土热水可溶性有机碳HWC含量较高，达415 mg ·kg-1，表明在培养前期发生了强烈的有机碳矿化作用，尤其是在60%和90%WHC处理的土壤中，适宜的水分含量显著促进了微生物的呼吸和有机碳的矿化作用，对NO-3-N的积累产生一定贡献.
 | 图 4 土壤CO2释放量Fig. 4 Flux of soil CO2 emission |
 | 图 3 土壤N2 O释放量Fig. 3 Flux of soil N2 O emission |
各处理土壤中反硝化微生物相关的nirS和nirK，以及氨氧化细菌和古菌amoA基因的定量分析结果如图 5所示. 所有处理中，nirS基因的丰度(以干土计，下同，8.19E+06～5.30E+08 copies ·g-1)均显著高于nirK基因(2.99E+05～7.28E+07 copies ·g-1)，见图 5(a)和图 5(b). nirS基因在淹水处理7 d时丰度最低(8.19E+06 copies ·g-1)，在90%WHC处理15 d和30 d时较高(5.30E+08 copies ·g-1和4.65E+08 copies ·g-1). 而在其它取样时间下，不同处理间nirS基因的丰度无显著差异. 同样，nirK基因的最低丰度(2.99E+05 copies ·g-1)也出现在淹水处理的第7 d，在90%WHC处理30 d时最高(7.28E+07 copies ·g-1). 60%WHC、 90%WHC和淹水处理中nirK基因丰度均明显高于30%WHC处理. 总体来说，nirK基因丰度呈现随水分梯度和培养时间先增加后降低的趋势，即90%WHC处理高于其它处理，除30%WHC中nirK基因丰度随培养时间延长无显著变化外，其余处理在培养中期(15 d或30 d)最高. 由此可见，土壤中nirK基因的丰度对水分变化的响应比nirS基因灵敏.
各处理中AOB amoA基因的丰度在培养7 d时无差异，7后AOB amoA基因的丰度也呈随水分梯度增加先增加后下降的趋势，在90%WHC和淹水处理中显著高于30%和60%WHC处理土壤[图 5(c)]. 各处理间AOA amoA的丰度在各取样时间点均无明显差异，只是15 d时的丰度显著低于其他培养时间[图 5(d)].
 | 图 5 反硝化/氨氧化微生物功能基因丰度Fig. 5 Abundance of functional genes of denitrifiers and ammonia-oxidizing microbes |
2.4 不同水分梯度下土壤反硝化微生物群落结构的变化
由于部分样品nirK基因丰度较低，不能得到足够的PCR产物用于T-RFLP分析，因此仅对nirS基因的群落结构组成进行了分析. T-RFLP分析结果显示，限制性内切酶Msp Ⅰ共获得11个nirS基因末端片段，分别为70 bp、 108 bp、 112 bp、 115 bp、 175 bp、 203 bp、 219 bp、 223 bp、 258 bp、 261 bp、 271 bp T-RFs(图 6).
 | 图 6 不同水分梯度处理下反硝化微生物(nirS基因)群落组成的变化Fig. 6 Change of denitrifiers (nirS gene) community composition under different moisture gradients |
培养前期(7 d时)，nirS基因代表的反硝化微生物群落组成在各处理间无明显差异，219 bp和112 bp T-RFs为优势片段，分别占43%～56%和20%～44%. 7 d后，219 bp和112 bp T-RFs的相对丰度降低，而223 bp T-RF的比例显著增加，其相对丰度从7 d时的0.4%～4%增加至60 d时的4%～50%，但淹水处理中的该片段在各取样时间下均最低. 219 bp和70 bp T-RFs的相对丰度总体随着水分梯度增加而降低，并且在淹水处理中检测不到70 bp T-RF； 而203 bp和112 bp T-RFs总体随水分梯度增加而增加，在培养30 d和60 d时最高，203 bp T-RF在90%WHC和淹水处理中所占比例达17%～28%(30 d)和16%～21%(60 d)，均明显高于其他取样时间和其他水分处理. 这些结果表明nirS型反硝化微生物组成对土壤水分含量变化响应灵敏，水分含量的增加一方面抑制了70 bp T-RF等类群的生长，同时刺激了203 bp和112 bp T-RFs等反硝化微生物的生长(图 6).
对nirS基因所代表的反硝化微生物群落结构组成与环境变量进行的典型对应分析(CCA)结果(图 7)表明，淹水与非淹水处理沿X轴被明显分离开，90%WHC和30%WHC处理沿Y轴分离，X轴和Y轴分别解释了56%和30.5%的变异. 在所考察的4个环境变量Eh、 含水率Cw、 NO-3-N 和NH+4-N中，Eh和含水率Cw对nirS基因的多样性组成具有显著影响，表明水分含量对该土壤nirS反硝化微生物的群落结构产生明显影响.
 | 图 7 nirS基因T-RFLP和环境变量的CCA分析Fig. 7 Canonical correspondence analysis (CCA) of nirS gene T-RFLP relative abundance and environment parameters |
硝化作用是微生物的好氧氧化过程，多数研究显示，在田间持水量的50%～60%时，土壤硝化作用最为活跃，这个水分范围既满足了微生物代谢活动的最佳水分条件，也满足了氧气扩散的条件[19,20]. 反硝化作用是微生物在嫌气条件下进行的硝酸盐还原过程，受土壤水分和通气状况的影响，主要发生于水分含量较高的还原条件下. 本研究对不同水分梯度培养下土壤NH+4-N、 NO-3-N和N2 O的监测结果显示，30%WHC处理土壤在整个培养过程中无明显NH+4-N消耗和NO-3-N累积，也无N2 O释放，表明无明显的硝化和反硝化作用发生； 60%WHC处理土壤在培养7 d取样时，NO-3-N浓度明显高于其他处理和背景值，CO2产生速率此时最高，之后明显下降，而在培养后期NO-3-N明显累积，表明培养初期NO-3-N主要来自于矿化作用，后期则主要来自于硝化作用； N2 O释放仅在90%WHC和淹水处理中检测到，表明反硝化作用只在这两个水分含量较高的处理中发生. 这些结果与之前对硝化和反硝化作用的认识一致. 但较为意外的是，90%WHC处理虽然在培养初期土壤NO-3-N含量低于60%WHC处理，但在培养后期显著高于60%WHC处理土壤，而且整个培养过程中NH+4-N显著下降，表明90%WHC处理土壤硝化作用较60%WHC处理更强烈. 同时，90%WHC处理还发生了强烈的反硝化作用.
Masscheleyn等[21]研究发现，当土壤Eh小于200 mV时，反硝化作用显著，而当土壤Eh大于400 mV时，土壤中硝化作用占优势，反硝化作用相对较弱. 本研究对Eh监测的结果显示淹水处理显著降低土壤Eh，整个培养过程中淹水处理土壤Eh在107～245 mV之间，而60%WHC和90%WHC处理土壤Eh 在444～640 mV之间，保证了硝化作用发生所需的氧化条件，同时，90%WHC处理中，硝化作用可能通过为反硝化作用提供底物而促进了反硝化作用发生. 倪吾钟等[22]通过15N标记实验也发现稻田土壤在氧化(Eh，290～330 mV)和还原(Eh，-114～42 mV)条件下均能进行硝态氮的反硝化作用. Zhou等[23]的研究也发现，当土壤中起始NO-3-N很低时，加入NH+4-N后会发生硝化-反硝化耦合作用，最终促进反硝化作用的发生. 但从本研究结果来看，这种硝化和反硝化之间耦合作用仅发生在特定的水分(90%WHC)和Eh条件下，随含水量进一步增加，即淹水处理土壤硝化作用减弱，反硝化作用也减弱. 而且笔者也发现土壤中硝态氮含量与Eh呈极显著正相关，与含水量的相关性不显著，而N2 O释放量则与土壤含水量呈显著正相关而与Eh的相关性不显著. Khalil等[24]运用15N同位素进行的研究也表明在75%土壤孔隙水(water filled pore space，WFPS)时土壤N2 O排放最大，且主要来自反硝化作用，表明反硝化作用不一定只发生在还原状态，氧化状态下硝化-反硝化作用耦合也可产生N2 O. 这些结果与有关干湿交替、 好氧厌氧条件经常变化的环境能提供最优的反硝化条件[25]等的研究结论一致.
然而，值得注意的是，近来越来越多的证据表明硝化作用过程也是N2 O释放的一个主要源头[26, 27]. 硝化作用产生N2 O有两种可能的途径，一是氨氧化微生物氧化NH3为NH2OH的过程中，N2 O作为副产物释放； 另一个途径是在低氧条件下，氨氧化微生物参与了NO-2还原为N2 O的过程，即发生了硝化微生物的反硝化作用(nitrifier denitrification). 因此不能排除本研究中硝化作用过程对90%WHC处理中检测到的N2 O释放是否有贡献. 下一步研究需要借助15N和18O同位素双标记技术进行研究以阐明此水分条件下N2 O产生的微观机制.
除90%WHC处理外，淹水处理在整个培养过程中也检测到N2 O的释放，但其总量明显小于90%WHC处理. Cai等[7] 对水稻田进行的长期监测结果也表明，水稻田在淹水期间释放的N2 O非常少，而在落干季节的排放量最大. 在过度还原的条件下可促进完全反硝化过程的发生，即反硝化作用终产物以N2为主，而不是N2 O[28, 29]. 对于淹水条件下N2 O的释放量减少是由于反硝化作用发生完全释放N2还是由于硝化-反硝化耦合作用受阻导致反硝化作用减弱所致还需进一步研究.
此外，培养过程中各个水分处理土壤Eh均有随时间延长而增高的趋势(30%WHC除外)，尤其是90%WHC和淹水处理，土壤Eh值随培养时间显著增加，可能由于培养瓶在长时间静置后，导致空气中的氧气进一步溶解扩散，以及还原性物质被氧化所致. 另外，整个过程中Eh的测定也可能存在一定的误差，水分含量较高的处理土壤在培养过程中，土壤聚集成团，使得氧气随空隙扩散，进而导致Eh测量值比理论值偏高. 但这些实验及测量误差并不影响硝化和反硝化作用对不同水分梯度响应的总体趋势.
3.2 土壤水分对反硝化微生物群落的影响参与反硝化作用过程的功能基因有多个，由于亚硝酸盐转化为一氧化氮的过程是反硝化作用有别于其他硝酸盐代谢的标志性反应，是反硝化过程中的重要限速步骤，其相应的亚硝酸盐还原酶基因(nir基因)包括nirK(Cu-nitrite reductase gene)和nirS(cd1-nitrite reductase gene)常被作为反硝化微生物的代表性分子标记用于其群落结构研究. 有研究表明nirK基因对外界环境因子的响应更灵敏[30]，在土壤反硝化中可能起着比nirS更为重要的作用[31]，因此反硝化细菌nirK基因丰度常被用来表征和预测N2 O的释放[30, 32]. 本研究结果显示，受土壤水分条件的影响，反硝化微生物数量和群落结构发生明显变化. 在所有处理中，nirS基因丰度显著地高于nirK，培养过程中nirK和nirS基因丰度整体随着水分的增加而增加，这一现象在Szukics等的研究中也有体现[3]，尤其nirK基因反应更为灵敏.
此外，AOB amoA的丰度与nirS和nirK基因表现出相似的趋势，三者之间呈极显著的正相关. 而AOA amoA的基因丰度除了在15 d时显著低于其他培养时间外，在其他取样时间和水分梯度处理间无明显变化. 表明该土壤中氨氧化细菌对水分条件变化的响应比氨氧化古菌灵敏，且在高水分处理土壤的氨氧化过程中起了重要作用. 除7 d取样外，其余各个取样时间点AOB amoA、 nirS和nirK基因的丰度均在90%WHC处理土壤中最高，而在淹水处理土壤中又有所下降，表明90%WHC条件最适宜土壤氨氧化细菌和反硝化细菌的生长，有利于硝化及反硝化作用共同发生. 随水分含量的进一步增加，硝化及反硝化微生物的丰度均下降，硝化、 反硝化作用的强度也减弱. 这可能是由于淹水导致的过度还原条件抑制了硝化微生物的活性，进而限制了反硝化作用底物的浓度，最终抑制了反硝化微生物的活性.
此外，对nirS基因的T-RFLP分析结果表明，水分增加抑制了219 bp和70 bp T-RFs等反硝化微生物类群的生长，但同时刺激了203 bp和112 bp T-RFs等类群的生长. 可见，203 bp和112 bp T-RFs对应的反硝化微生物类群可能在高水分处理土壤的反硝化作用中起了重要作用. CCA分析结果进一步揭示了在本研究所模拟的底物为非限制性因子的条件下，含水率Cw和氧化还原电位Eh是影响土壤反硝化微生物群落结构的两个重要因素.
4 结论(1)硝化作用主要发生于60%WHC和90%WHC处理土壤中，且90%WHC处理最强，并检测到明显的N2 O释放，表明该水分条件可能发生了硝化-反硝化耦合作用； 淹水处理土壤Eh显著低于非淹水处理土壤，无明显的硝化作用发生，但能检测到少量N2 O的释放.
(2)定量PCR分析结果表明，nirS、 nirK及AOB amoA的丰度均随着水分增加而增加，且在90%WHC处理中最高，与该处理中硝化和反硝化活性最高一致，表明这些基因在土壤硝化和反硝化过程中起了重要作用.
(3)nirS基因为代表的反硝化微生物群落组成随土壤水分条件变化发生明显变化，含水率Cw和氧化还原电位Eh是影响其群落结构组成重要因素，一些类群仅在高水分处理土壤中出现，可能在这些处理土壤的反硝化作用中起了重要作用.
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