2014, Vol. 35
2. 浙江工商大学环境科学与工程学院, 杭州 310012
2. School of Environmental Science & Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China
近年来随着我国污水处理率的提高，剩余污泥量也在急剧增加，据估计，未来5年内，我国城市污泥排放量将提高到3 560万t ·a-1左右．如何合理地处理处置污泥成为环境治理的新课题和新挑战．而从源头上实行污泥减量是最佳方法[1]．环节动物门寡毛纲颤蚓科分节蠕虫(俗称水蚯蚓)，能大量摄食污泥，通过摄食活性污泥中的细菌和有机污泥，在体内将其矿化从而减少系统中的剩余污泥产量．Rensink等[2]向填充了塑料载体的活性污泥系统中投入颤蚓(tubificidae)，发现单位质量COD的剩余污泥产量从0.40 g ·g-1降至0.15 g ·g-1，Wei等[3]开发了一套集成式蠕虫反应器用来处理排放的剩余污泥和回流污泥，减量率可达48%左右．Elissen等[4]将夹杂带丝蚓(Lumbriculus variegates)接种于填料上，单位质量蠕虫的污泥减量速率约为0.045 mg ·(mg ·d)-1，每天矿化的污泥质量约占蠕虫自身湿重的4.5%．水蚯蚓污泥减量技术因其具有能耗低、 不产生二次污染等特点，近年来备受青睐[5]．
目前，水蚯蚓污泥减量工艺已成功应用于城镇生活污水处理厂[6]，该技术成功应用的先决条件首先是水蚯蚓在系统中稳定生长并代谢繁殖[7,8]，其次是环境因素(温度、 pH、 溶解氧DO、 氨氮浓度、 光照、 盐度等)和剩余污泥中重金属污染物的影响[9]．尤其是重金属污染物，势必会对水蚯蚓的生理造成影响进而影响水蚯蚓污泥减量能力．铬及其化合物由于具有高毒性，被列为中国水环境优先污染物黑名单[10]，在制革、 电镀和染料的制造等过程中均会排放含铬废水．Cr在自然界中主要以Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)两种形态存在，Cr(Ⅲ)不容易迁移且毒性很低，而Cr(Ⅵ)在环境中易溶于水、 迁移能力强且毒性在Cr(Ⅲ)的100倍以上．目前，含铬废水的处理方法主要有还原法、 离子交换法和生物吸附法等．当将水蚯蚓应用于含铬的废水处理系统中时，水蚯蚓会受到铬的毒性作用，反映其生物体的生命体征及代谢活动的主要指标——呼吸速率会受到影响，因此，本文选取重金属Cr(Ⅵ)作为研究污染物，以呼吸速率和LC50为指标，对重金属Cr及环境因子对水蚯蚓呼吸速率的协同作用展开分析，以利于在实际应用时调整运行条件，为将水蚯蚓应用于含重金属污染的处理系统中提供理论基础．
1 材料与方法 1.1 水蚯蚓本试验所用水蚯蚓购自上海岚灵花鸟市场，经鉴定为正颤蚓(Tubifex tubifex)和霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)的混合种颤蚓科蠕虫，比例约为2 ∶3．它们受到刺激后会蜷缩身体、 打结．活性较强的水蚯蚓表现为身体颜色鲜红，对刺激敏感； 活性较弱的水蚯蚓表现为身体颜色淡红，尾部发白并有断节的现象，对刺激较为不敏感； 已死亡的水蚯蚓表现为身体泛白，失去伸缩能力，对刺激无反应．水蚯蚓先在实验室室温培养一段时间后再用于试验．试验时，先将水蚯蚓体表的污泥冲洗干净，挑选体长均一(约6~7 cm)、 鲜红色、 对于刺激反应敏捷的水蚯蚓作为试验对象．为了排除干扰，试验中不对水蚯蚓进行喂食．
1.2 试剂重铬酸钾、氢氧化钾: 分析纯，成都市科龙化工试剂厂．
1.3 试验仪器测定水蚯蚓呼吸速率的试验设备为BI-2000电解呼吸仪[11]．称取0.25 g新鲜水蚯蚓(以湿重计)水蚯蚓放入滤布囊，悬挂于呼吸仪的反应器内，待反应器内的温度和呼吸仪水浴锅温度平衡后进行试验．本研究呼吸速率以单位体积内单位质量(干重)的水蚯蚓单位时间的耗氧量表示，即mg ·(g ·h ·L)-1．
pH采用FE20K精密pH计测定； 水蚯蚓湿重和干重采用EL104电子天平称量； DO采用Tengine-EDO溶解氧仪测定，水温用WNG-01温度计测量．
1.4 试验方法 1.4.1 水蚯蚓干湿比的测定为了更准确地进行定量及比较，试验结果以干重表达，因此需测定水蚯蚓的干湿比．水蚯蚓的干重 (dry weight，dw)和湿重(wet weight，ww)均用电子天平称量．挑取适量颜色鲜红、 活性强的水蚯蚓，用清水反复冲去表面污泥后，放于带有小孔的铝箔纸上，铝箔纸下面放置吸水纸巾吸去水蚯蚓表面的水分，吸干后称量，计为湿重．然后，将水蚯蚓于烘箱内103~105℃条件下烘至衡重，称量，计为干重．作干重-湿重关系图，并对数据进行线性拟合，其拟合方程的斜率即为干湿重比．
1.4.2 六价铬对水蚯蚓的急性毒性研究用重铬酸钾配制铬液．根据预试验，正式试验的铬浓度范围设定在0.00~20.00 mg ·L-1区间，根据浓度对数设置11个浓度梯度(表 1)．试验时选用表 1中试验浓度来进行正式试验．试验中，每组水蚯蚓20条，放入直径为12 cm盛装了50 mL对应浓度铬溶液的培养皿中，每个浓度设置3个平行和一组空白对照组．试验条件: 温度为(22±1)℃．pH为7.0±0.1，DO为4.0 mg ·L-1．试验开始的前6 h内，连续记录和观察试验现象．当水蚯蚓表现为身体泛白，无伸缩能力，对于触碰无反应时可判定为死亡．已死亡的水蚯蚓及一些絮状排泄物应及时从培养皿中清除，以免对试验造成影响．根据死亡数计算出12 、 24 、 36 、 48 、 60 、 72 、 84 、 96 h的死亡率，并根据死亡率-概率单位图求得对应概率单位，以浓度对数为x，概率单位为y轴，作概率单位-浓度对数图，并求其线性回归方程(y=kx+b)，从而得到各个时间 点对应的半致死浓度[12]，即24 h LC50、 48 h LC50、72 h LC50、 96 h LC50．通过以下公式计算Cr(Ⅵ)对水蚯蚓的安全浓度(SC):
 | 表 1 Cr(Ⅵ)对水蚯蚓的急性毒性浓度梯度 Table 1 Concentrations of Cr(Ⅵ) for acute toxicity test |
本试验选取温度、 pH值、 DO浓度为环境因子，利用正交试验直观分析法，探究它们与六价铬对水蚯蚓呼吸速率的协同影响．
依据急性毒性试验结果，Cr浓度设置为: 24 h LC50、 48 h LC50、 72 h LC50、 96 h LC50及安全浓度(SC)取整，从小到大分别为0.10、 0.50、 1.00、 2.50、 8.00 mg ·L-1； 根据本课题组前期的研究结果[6, 11, 13],本试验采用四因素五水平正交试验，四因素的各水平见表 2，正交试验设计表如表 3所示.
| 表 2 正交试验因素水平 Table 2 Levels and factors in orthogonal experiment |
| 表 3 正交试验设计表L25(54) Table 3 Orthogonal array L25(54) |
所有试验均设3个平行，并计算其平均值和标准差进行统计分析．利用Origin 8.5软件进行 ANOVA分析，将试验组与对照组进行显著性t检验，以 P＜0.05作为显著性依据．
2 结果与分析 2.1 水蚯蚓干湿比本试验测得的干湿比约为15.6%(如图 1)，曾有报道称颤蚓的干湿比为16.1%±1.5%[14]，与本试验所测值相近．Elissen[15]提到，对于不同种类水蚯蚓干湿比不同，颤蚓和夹杂带丝蚓的干湿比分别为17.0%和13.0%，和本试验略有不同，原因可能是所选试验对象在体长，直径和生物体积上存在差异[15,16]．
 | 图 1 水蚯蚓干湿比 Fig. 1 Dry weight vs. wet weight of worms |
经过Grubbs检验法检测数据的可靠性后，分别作出24、 48、 72和96 h的浓度对数-概率单位图，同时求出相应的LC50和置信区间，试验结果见表 4．
| 表 4 六价铬对水蚯蚓的急性毒性试验结果 Table 4 Acute toxicity of Cr(Ⅳ) to worms |
安全浓度为:
六价铬对水蚯蚓的安全浓度、 96 h LC50、 72 h LC50、 48 h LC50、 24 h LC50分别为0.09、 0.49、 0.81、 2.67、 7.94 mg ·L-1，从结果看，24 h LC50较高，但随着时间的增加，水蚯蚓对铬的耐受性快速下降，96 h LC50为0.49 mg ·L-1，仅为24 h LC50的6.2%左右，这表明水蚯蚓对铬的短时间耐受性较强，但是时间超过24 h后，耐性急剧降低．
2.3 铬胁迫下环境因子对水蚯蚓呼吸速率的影响铬与环境因子协同作用下水蚯蚓的呼吸速率见图 2，从中可知，在不同试验条件下，水蚯蚓呼吸速率均不同．其中1、 5、 9、 14、 15试验组与空白对照组无显著差异(P＞0.05)，7、 8、 11、 17试验组有显著差异，其余各组与空白对照组均有非常显著差异．从试验结果看，大多数试验组呼吸速率均低于空白对照组，只有1号[Cr(Ⅵ)浓度0.10 mg ·L-1、 14℃、 pH 5.0、 DO 2.0 mg ·L-1]、 5号[Cr(Ⅵ)浓度0.10 mg ·L-1、 30℃，pH 9.0、 DO 6.0 mg ·L-1]和19号[Cr(Ⅵ)浓度2.50 mg ·L-1、 26℃，pH 6.0，DO 6.0 mg ·L-1]试验组的呼吸速率高于空白对照组．这3组试验组中，其中1号和5号试验组与空白对照组无显著差异(P＞0.05)，说明该呼吸速率与空白对照组的差异可能是由取样误差所致，只有19号试验组与空白对照组有非常显著差异(P≤0.01)，可见，该试验条件下水蚯蚓呼吸速率的提高是受到了某些因素的刺激． 本实验室进行的前期单因素试验表明，当温度为22℃、 pH 8.0，DO 3.5~4.0 mg ·L-1时水蚯蚓呼吸速率最大[11]，比较19号和24号[Cr(Ⅵ)浓度8.00 mg ·L-1、 26℃，pH 7.0，DO 3.0 mg ·L-1]试验组的呼吸速率可看出，19号试验组的呼吸速率为24号的1.9倍，两组试验的温度、 pH及DO与单因素试验[11]最佳呼吸速率条件较接近. 可见，造成呼吸速率差值大的主要原因在于不同的六价铬浓度，也即在试验浓度范围内，低浓度(2.50 mg ·L-1)六价铬对水蚯蚓的呼吸速率反而起到了促进作用，这可能是因为水蚯蚓体表会分泌黏液，可以遮挡外界部分有毒有害物质，且当Cr的浓度较低时，会诱导水蚯蚓体内产生SOD酶等进行应激，并通过加快呼吸速率及新陈代谢来抵抗外界毒物的刺激[17]．
 | 图 2 不同条件下的水蚯蚓呼吸速率 Fig. 2 Respiration rate of worms under different conditions |
从图 2看出，21、 25号试验组的呼吸速率最低，且与空白对照组有非常显著差异(P≤0.01)，呼吸速率分别为最大呼吸速率的20.3%、 16.3%，说明水蚯蚓的呼吸速率受到严重抑制．21号试验条件为Cr(Ⅵ)浓度8.00 mg ·L-1、 14℃、 pH 9.0，DO 5.0 mg ·L-1，25号试验条件为Cr(Ⅵ)浓度8.00 mg ·L-1、 30℃、 pH 7.0、 DO 3.0 mg ·L-1，不难发现这两组试验分别是在浓度最高、 温度分别在最低温(14℃)和最高温(30℃)的条件下进行的，这两组的呼吸速率分别为17.62 mg ·(g ·h ·L)-1、 11.26 mg ·(g ·h ·L)-1，郭茂新等[9]研究结果表明，在无铬条件下，当温度为15℃与30℃时，水蚯蚓的呼吸速率分别为29.48 mg ·(g ·h ·L)-1、 21.66 mg ·(g ·h ·L)-1，可见同一温度水平下，由于高浓度六价铬的作用，水蚯蚓呼吸速率明显下降．当Cr(Ⅵ)浓度为8.00 mg ·L-1时，除了24号试验组呼吸速率[36.36 mg ·(g ·h ·L)-1]外，其他4个试验组的呼吸速率均较低，基本在20.00 mg ·(g ·h ·L)-1以下，不到最高呼吸速率的29%，且高浓度的平均值明显远远低于其它浓度下的平均值，可见高浓度(8.00 mg ·L-1)六价铬对水蚯蚓呼吸速率起到了抑制作用．
试验因素各水平对指标的影响分析结果列于表 5中，从中可看出各水平对呼吸速率的影响大小，kA4>kA1>kA3>kA2>kA5，可以判断A4为A因素的优水平； kB4>kB5>kB1>kB3>kB2，B4为B因素的优水平； KC2>KC5>KC1>KC3>KC4，C2为C因素的优水平； KD5>KD1>KD4>KD2>KD3，D5为D因素的优水平，则4个因素的优水平组合为A4 B4 C2 D5，即水蚯蚓在此条件下可获得最高呼吸速率: Cr(Ⅵ)浓度为2.50 mg ·L-1、 温度26℃、 pH=6.0、 DO浓度6.0 mg ·L-1，即19号试验组为最优水平组合，其呼吸速率最高．
| 表 5 正交试验结果分析 Table 5 Results of orthogonal analysis |
各因素对水蚯蚓呼吸速率的影响程度可通过比较极差R的大小得到，从表 5中可看出RA>RB>RD>RC．因此各因素对试验指标影响的主次顺序是ABDC，即对水蚯蚓呼吸速率影响的因素从主到次为Cr(Ⅵ)浓度、 温度、 DO浓度、 pH值．
3 讨论 3.1 铬对水蚯蚓的急性毒性根据赵岩等[18]和蔺玉华等[19]对鱼类的毒性研究，Cr(Ⅵ)相应的LC50要高得多，这是因为水蚯蚓体表没有像鱼类一样的硬壳，能够在一定程度上分离体液和环境，起到保护的作用，而是依靠水蚯蚓体表分泌的黏液来阻挡外界毒性刺激，当曝露时间在24 h以上时，体表分泌的黏液不足以遮挡外界有毒有害物质，且通过体表接触和吸收后引起其体内生理指标的变化，导致了水蚯蚓在24 h后对铬的耐性急剧下降[20]．随着六价铬浓度的升高，对水蚯蚓的活性影响加大，水蚯蚓反应变迟钝并逐渐丧失运动能力，最终出现解体现象，水蚯蚓解体后产生大量白色絮状物，为水蚯蚓死亡后解体的产物．付荣恕等[21]研究Pb对水丝蚓的急性毒性，24 h LC50和48 h LC50分别为7.09 mg ·L-1和4.73 mg ·L-1，结合本研究结果可见，Pb和Cr对水蚯蚓的毒性相近．此外，孙新元等[22]研究铜对颤蚓的急性毒性，结果表明24 h LC50、 48 h LC50、 72 h LC50分别为237.80、 212.20、 174.30 μg· L-1，可见Cu对水蚯蚓的毒性要远大于Cr的； 本试验结果与Maestre等[23]的研究结果相吻合，其报道的六价铬对正颤蚓的96 h LC50为0.19~38.10 mg ·L-1．Rathore等[24]研究结果表明，在硬水中时，六价铬对正颤蚓的24 h LC50、 48 h LC50、 72 h LC50、 96 h LC50分别为22.73、 5.59、 4.55、 4.23 mg ·L-1，与本试验结果略有所不同. 另外，与Oztetik等[25]和Mendez-Fernandez等[26]的研究结果也存在一定的差异，存在差异的主要原因有: ①所用水蚯蚓的产地不同； ②水蚯蚓的种属与纯度不同； ③试验过程的控制条件不同，如温度、 pH、 水硬度[23]等．因此，在实际应用中，应根据具体接种的水蚯蚓来决定是否适用或及时调整处理系统中重金属的浓度．
城镇污水处理厂污染物排放标准中规定，六价铬的最高允许排放浓度(日均值)为0.05 mg ·L-1，而本试验得到的六价铬对水蚯蚓的安全浓度为0.09 mg ·L-1，因此水蚯蚓可在城镇污水处理系统中存活，能否长期在系统中稳定生长及进行污泥减量还需进一步进行长期系统的蓄积性试验研究．
3.2 铬胁迫下环境因子对水蚯蚓呼吸速率的影响在不同水平Cr的胁迫下，温度26℃时，水蚯蚓平均呼吸速率最大，达到43.52 mg ·(g ·h ·L)-1，而水蚯蚓在其他温度时，其呼吸速率均小于36.00 mg ·(g ·h ·L)-1．水蚯蚓属于变温动物，其新陈代谢和生理状态均和水温相关[27]，低温会降低活性和新陈代谢速率，水蚯蚓适合生长于温度为25℃的环境[6]．曾有报道称[7]，当温度在15～25℃ 之间时，随着温度的升高水蚯蚓污泥降解率增加，25℃ 时TSS、 VSS 降解率最大，本研究结果解释了温度对水蚯蚓生长及污泥降解效果影响的机制．
重金属Cr的存在也使pH值对水蚯蚓呼吸速率的影响有所变化，当pH=6.0时，平均呼吸速率最大，为34.94 mg ·(g ·h ·L)-1，pH=8.0时的平均呼吸速率最低，仅为25.79 mg ·(g ·h ·L)-1，而pH=9.0时，呼吸速率却又达到34.57 mg ·L-1，出现此现象的原因可能是由于溶液中重金属在pH升高时会生成氢氧化物或碳酸盐等难溶物质沉淀或配合物，使得水中游离金属离子浓度降低，从而毒性抑制作用也有所降低．有研究表明[7]，在DO、 pH和温度的协同作用下，pH为6.5时水蚯蚓污泥减量率达到最高．因此结合本试验，可推测中性或略偏酸性的环境更有利于水蚯蚓生长代谢及污泥减量，因为在该环境下水蚯蚓的生命体征及代谢更活跃．
在Cr与环境因子的协同试验中，DO浓度为6.0 mg ·L-1时，水蚯蚓平均呼吸速率最高，为43.51 mg ·(g ·h ·L)-1，其他DO浓度下的平均呼吸速率均明显低于此值．有研究表明当DO低于2.5 mg ·L-1时，水蚯蚓的生长受到抑制且污泥减量率低[7]，同时，当水蚯蚓生长于低溶解氧环境下时，为了竞争更多的氧气，水蚯蚓因伸展肢体而附着不牢固，易被冲走而随污泥排出系统．然而，高溶解氧的投入意味着高能耗，且曝气量大会造成较强的生物扰动，这不利于水蚯蚓的生存，从而导致污泥降解速率较低[9]．因此，从经济角度和实际运行出发，应将溶解氧浓度控制在适中范围内．
4 结论(1) 用于本试验的霍甫水丝蚓与正颤蚓混合种水蚯蚓的干湿比为15.6%.
(2) 通过96 h急性毒性试验得到，六价铬对混合种水蚯蚓的安全浓度、 96 h LC50、 72 h LC50、 48 h LC50、 24 h LC50分别为0.09、 0.49、 0.81、 2.67、 7.94 mg ·L-1．
(3) 六价铬胁迫下，通过正交试验得知，Cr(Ⅵ)浓度、 温度、 DO浓度、 pH值这4个因素对水蚯蚓呼吸速率影响的最优水平组合为: Cr(Ⅵ)浓度为2.50 mg ·L-1、 温度26℃、 pH=6.0、 DO浓度6.0 mg ·L-1，此条件下水蚯蚓呼吸速率最高，为69.10 mg ·(g ·h ·L)-1； 对水蚯蚓呼吸速率影响的重要性从主到次为Cr(Ⅵ)浓度、 温度、 DO浓度、 pH值．
(4) 当温度为26℃时，浓度为2.50 mg ·L-1的六价铬对水蚯蚓呼吸速率起到促进作用而浓度为8.00 mg ·L-1时，则起到抑制作用，前者呼吸速率为后者的1.9倍．当六价铬浓度较低(低于2.50 mg ·L-1)时，可以通过调节温度、 pH和DO浓度到合适条件，使水蚯蚓正常呼吸，稳定生长．
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