微生物燃料电池(MFC)是利用微生物作为生物催化剂，通过生物电化学途径氧化有机物并产生电能的系统. 在MFC系统中，富集在阳极表面的电极活性微生物，在厌氧条件下通过降解有机物产生质子和电子，电子直接或间接传递到阳极，再经由外电路到达阴极，在阴极与来自阳极的质子反应生成水，而在外电路形成电流^[1]. 将MFC应用于污水处理系统中，既可以利用微生物降解废水中的有机物，同时还能产生电能，实现环境保护和产电节能的双赢^[2]. 然而，MFC在实际应用中还存在功率密度低、 放大性较差等瓶颈问题，尤其是MFC中高性能电极活性细菌的研究还没有得到充分重视^[3].

在MFC中，接种不同的底物时，MFC中阳极膜的微生物群落组成差别很大^[4]，因此，了解混合菌作用下MFC阳极膜的微生物群落结构，有利于后续筛选高效产电的菌株^[5]. 根据Kim等^[6]的研究，阳极膜上的优势菌群并不一定是优势产电菌，某些数量上非优势的菌属也可能是产电高效的微生物，MFC的产电过程实际是占优势的非产电菌和数量不占优势的产电菌共同作用的结果^[7]. 阳极生物膜电极活性菌的分离是MFC产电机制研究的基础，获得电极活性菌不仅能够提高MFC的库仑效率，还能够促进电子产生机制和传递途径等方面的研究进展^[3].

本研究以不同底物运行的MFC阳极膜微生物群落为对象，富集分离得到高活性的电极活性菌，通过跟踪监测分离过程中的微生物群落结构变化，探索培养条件对微生物的选择作用以及电极活性菌在MFC中的地位. 1 材料与方法 1.1 MFC的运行

反应器采用双室空气阴极反应器，两极室体积均为170 mL，以有机玻璃为材料，阳极膜材料为8 cm×6 cm碳布，阴极为碳纸，两极室间以质子交换膜(Nafion 117，Dupont)隔开，膜的有效面积为40 cm².

分别以乳酸、 乙酸和甾体药物生产废水为阳极碳源底物，并接种等量的种泥，启动MFC反应器. 接种污泥取自本实验室稳定运行的厌氧折流板反应器(ABR)污泥，该污泥中微生物种类丰富，厌氧生物多样性高，在碳硫比为2 ∶1时，硫酸盐去除率可达98%^[8]. 反应器的阴极溶液为磷酸盐缓冲液，组成为(g ·L^-1)：NaH₂PO₄ ·12H₂O 4.58，Na₂HPO₄ ·2H₂O 2.75. 阳极溶液组成为(g ·L^-1)： KCl 3.1，NH₄Cl 1.3，Na₂HPO₄ ·2H₂O 2.75，NaH₂PO₄ ·12H₂O 4.58，2 mL维生素溶液^[9]，2 mL氨基酸溶液^[10]和2 mL微量元素溶液^{[11, 12]}，分别以乳酸、 乙酸为有机底物，配成化学需氧量(COD)浓度为500 mg ·L^-1的进水溶液. 甾体药物生产废水取自山东某制药厂氢化可的松的生产车间，pH=7.2，电导率8.63 mS ·cm^-1，COD 6717 mg ·L^-1，SO^2-₄为2419 mg ·L^-1.

在MFC启动阶段，每24 h换水一次，换水时反应器底部保留约10 mL污泥混合液，直至反应器输出电压稳定，取阳极生物膜做扫描电镜观察，并记录周期内反应器的产电情况. 待分离出纯菌后，将反应器拆洗并灭菌，加入灭菌的乳酸底物阳极溶液和阴极溶液，并接种纯菌，记录纯菌产电情况. 1.2 电化学分析

为了监测混合菌和纯菌MFC的运行状况，对反应器进行电化学监测分析. 电压通过数据采集卡(PIOS 813，台湾泓格)进行在线记录. 1.3 电极活性菌的分离与鉴定

在无菌环境下，从运行状况良好的反应器阳极剪下约1 cm²碳布，放入已灭菌的LB液体培养基富集培养，获得选择性富集培养菌液； 以富集培养菌液为对象，采用基于无定形铁还原的连续稀释法^[13]分离电极活性微生物菌株，在培养基中加入无定形铁，培养一段时间后若培养基变黑，说明微生物能还原无定形铁，并有效地将电子传递到胞外电子受体^{[14, 15]}，由此判定微生物具有产电功能. 具体步骤为，将富集后的菌液用无菌水稀释至不同梯度，采用亨氏厌氧滚管稀释培养技术接种于固体培养基中，充氮气去除氧气后制成滚管，进行恒温厌氧培养，观察并挑取黑色的单菌落转接入新鲜的液体培养基中. 重复操作若干次，直至管内菌落在显微镜下的细胞形态一致^[16].

对电极活性菌的鉴定，包括观察产电情况、 电子显微镜形态观察以及16S rDNA测序鉴定. 分别提取菌株Lss104和Lss121基因组DNA，以细菌16S rDNA的通用引物BSF8/20: 5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′和BSR1541/20: 5′-AAGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′进行PCR扩增(CFX96，美国伯乐)^[1]，PCR产物长度约1500 bp，所有引物均购自Invitrogen(上海). 克隆后进行测序，序列通过RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) 中的Seq Match程序进行分类，并下载相似序列. 应用Mega 4.0以NJ法构建系统发育树. 电极活性菌Lss104和Lss121的16S rDNA序列已经提交至GenBank中，登录号KJ730211-KJ730212. 1.4 纯菌分离过程中微生物群落监测分析 采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)监测纯菌分离过程中微生物群落结构动态. 获取种泥、 反应器运行稳定时阳极膜、 富集培养菌液以及纯培养微生物，采用土壤DNA提取试剂盒(Mobio,美国)提取微生物总DNA，以此为模板，进行PCR扩增，采用细菌16S rDNA通用引物BA341F: 5′-CCTACG GGAGGCAGCAG-3′和BA534R: 5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-3′，对应于E.coli 16S rRNA基因的341~534 bp； 其中引物BA341F的5′端带有GC夹. PCR程序、 PCR产物的DGGE分析根据文献^[16]进行. DGGE图谱中条带按文献^[16]方法回收并克隆测序. 序列通过RDP(http://rdp.cme.msu.edu/)中的Seq Match程序进行分类.

2 结果与讨论 2.1 不同底物MFC产电效率

分别以乳酸、 乙酸和甾体药物生产废水为碳源启动MFC反应器，反应器正常启动并运行后电压情况如图 1. 更换阳极液后，各反应器的电压上升速率为乳酸>乙酸>甾体废水，最高电压乙酸>乳酸>甾体废水，最高电压的维持时间甾体药物生产废水>乙酸>乳酸. 大分子底物在被微生物利用的过程中存在梯级降解过程，大量微生物参与复杂有机物的降解环节，而部分产电微生物则仅能利用最终降解成的小分子产电，所以在同等条件下，底物越简单，产电库仑效率往往越高. 以混合菌群为接种污泥时，乳酸在被微生物利用的过程中会产生乙酸，丙酸等挥发酸^[18]，利用过程较为复杂，且中间产物乙酸、 丙酸等也能成为部分微生物的碳源，该过程中存在着有机物的分解和利用，因此乳酸比乙酸MFC的最高电压低. 甾体药物生产废水成分相对复杂，有机底物含量高，因而其最高电压的维持时间最长； 而甾体药物生产废水的电压上升速率和最高电压均低于乳酸、 乙酸，可能是由于甾体药物生产废水中微生物种类丰富，非产电微生物多，可以消耗掉大量的电子，导致库仑效率下降，电压降低. 王超等^[19]用MFC处理黄姜废水的研究中指出，COD负荷过高将导致产电过程受抑制，高COD负荷对产电微生物产生影响，导致MFC产电性能有所下降. 而蔡小波等^[20]也曾提出，高浓度有机废水容易出现的酸化现象是MFC电压输出的限制因素.

图 1

Fig. 1

图 1 以不同有机物为底物时MFC电压变化 Fig. 1 Voltage variation of MFCs fed with lactic acid,acetic acid and pharmaceutical wastewater

将乳酸、 乙酸和甾体药物生产废水为碳源的MFC阳极膜经过预处理后，进行电镜观察，发现3种电极表面都附着了大量微生物，且微生物的形态类似，主要为长杆细菌，多层分布，附着情况良好. 产生这种现象的原因可能是在电极表面富集微生物的过程中，细菌个体以某种特定的方式连接到一起成为整体“协同分布”，这样更有利于电子的传导，使微生物获得更多的能量，微生物在阳极表面的成层分布可能存在不同的导电机制^[4].

图 2展示了利用亨氏厌氧滚管法分离纯培养的过程中每个阶段优势种群变化的DGGE图谱，比较分别以乳酸、 乙酸和甾体药物为碳源的MFC阳极膜DGGE图谱发现，乙酸阳极膜上的优势种群数量最少(多样性指数1.73)，甾体药物生产废水稍高(多样性指数2.66)，而乳酸最多(多样性指数2.95). 通常来说，底物越复杂，需要越多的微生物参与降解，但同时可能造成库仑效率的下降^[16].

图 2

Fig. 2

S为接种污泥，EL、 ES、 EA分别为乳酸、 甾体药物生产废水和乙酸 为碳源阳极生物膜，CL、 CS、 CA分别为乳酸、 甾体药物生产废水 和乙酸电极生物膜富集培养菌液，104和121为分离得到的纯菌 图 2 电极活性菌分离过程DGGE图谱分析 Fig. 2 DGGE profile of electrode active bacteria separation process

另外，在种泥样品(S)中仅有一个优势条带，这说明种泥中，优势种群非常显著，其它种类微生物所占比例较少，这个结果还与DGGE方法本身的特点有关. Vallaeys等^[21]发现DGGE仅能够检测到种群数量超过群落总量1%的微生物，而含量小于1%的无法在DGGE图谱中显示. 接种污泥是ABR反应器中高度驯化的污泥，优势种群非常明显，其数量比例可能非常高.

当应用LB培养基对阳极生物膜进行富集培养后，DGGE图谱发生了显著变化，主要体现在优势种类的改变以及数量的增加. 如富集后的乳酸生物膜出现了4条优势条带，且与原生物膜种类不同； 富集后的甾体药物生产废水生物膜出现了3条优势条带，其中2条与原生物膜一致，1条为新出现的优势种群； 而富集后的乙酸生物膜优势条带与原生物膜较一致.

将DGGE图谱上的优势条带切下进行测序比较，结果如表 1. 从测序结果可以看出，种泥中的优势条带对应的菌株为变形菌Acidithiobacillus ferrooxidan，该菌株是典型的化能自养菌，为革兰氏阴性，好氧嗜酸，主要生长在pH为1~3的环境中^[22]，能在有氧条件下依靠 Fe²⁺、 各种还原性硫化物以及H₂氧化来提供能量生长^[23]. 甾体废水为碳源的电极膜优势条带对应的微生物为Desulfocapsa sulfexigens、 Sedimentibacter hydroxybenzoicus以及Porphyromonadaceae bacterium. D. sulfexigens是一种利用单质硫同时作为电子供体和电子受体而完成硫歧化的一种海洋细菌. 系统发育树中与该菌的亲缘关系最近的微生物是硫酸盐还原菌，而D.sulfexigens却不能通过还原硫酸盐获得生长； 并且在利用CO₂作为唯一碳源代谢单质硫、 亚硫酸盐、 硫代硫酸盐的过程中，其生长速率与代谢过程是不成比例的^[24]. S. hydroxybenzoicus最初是从池塘沉积物中分离出来的能利用氨基酸的不动厌氧杆菌.

表 1(Table 1)

表 1 微生物群落 PCR-DGGE 图谱中优势条带克隆测序结果 Table 1 Cloning sequencing results of PCR-DGGE 序号 长度/bp 相似菌种 序列号 相似度/% 系统发育关系 1 187 Acidithiobacillus ferrooxidans DQ168465 100 Proteobacteria 2 187 Zoogloea sp. A5 DQ342276 100 Proteobacteria 3 194 Desulfocapsa sulfexigens DSM 10523 NR102510 100 Proteobacterial 4 178 Porphyromonadaceae bacterium JN18_A107_G DQ168658 100 Bacteroidetes 5 163 Sedimentibacter hydroxybenzoicus (T) L11305 96 Firmicutes 6 184 Acinetobacter sp. LMG V90 AJ633641 100 Proteobacteria 7 168 Fodinicurvata sediminis NR044595 99 Proteobacteria 8 161 Clostridium bifermentans DSM 10716 100 Firmicutes 9 163 Clostridium bifermentans DSM 13560 100 Firmicutes 10 162 Clostridium bifermentans AY604562 100 Firmicutes 11 162 Clostridium bifermentans X73437 100 Firmicutes 12 187 Cronobacter sakazakii FJ947061 100 Proteobacteria 13 185 Citrobacter freundii DQ294288 100 Proteobacteria 14 186 Citrobacter freundii DQ010114 100 Proteobacteria

表 1 微生物群落 PCR-DGGE 图谱中优势条带克隆测序结果 Table 1 Cloning sequencing results of PCR-DGGE

乙酸碳源的电极膜优势微生物Acinetobacter sp. LMG V90为革兰阴性球杆菌，菌体大小为1.5~2.5 μm，双排列，革兰染色不易褪色，多数菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛. 乳酸电极膜微生物富集培养中的优势条带对应的菌为Fodinicurvata sediminis. 将3种碳源驯化的电极膜在LB培养基中富集培养，稀释后用Fe₂O₃的培养基进行亨氏厌氧滚管分离，从3种滚管中各挑取4株黑色菌落分别在LB培养基中厌氧扩大培养并测序. 在分离出的12株菌中，有10株是弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii，来自3种碳源MFC，另外两株则是Cronobacter sakazakii，仅分离自甾体废水反应器. 3种反应器的接种污泥相同，经过不同碳源驯化之后群落结构发生了改变，优势菌种向不同方向发展. 但是将电极膜用亨氏厌氧滚管技术富集分离培养后，不同群落中的优势菌发生了变化，且向单一方向转变，最终从不同反应器中分离得到同一菌株. 另外，根据DGGE图谱，菌株104在富集培养液中是存在的，但在原始的阳极膜中并未显示，表明其在阳极生物膜中所占的数量比例很低. 2.3 电极活性细菌的鉴定及产电情况

以还原氧化铁的能力为指征，利用亨氏厌氧滚管稀释培养技术分离到两株电极活性细菌，分别为Lss104和Lss121. 对两株菌16S rDNA测序，并构建系统发育树，结果如图 3. 从中看出，与Lss104 最相似的微生物是路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii En-119^T，GenBank登录号: AJ853891)，相似性99%. E. ludwigii 是以在细菌系统分类学上有突出贡献的微生物学家Wolfgang Ludwig命名，第一次是从临床样品中分离得到的菌种. 研究表明，该菌革兰氏阴性，过氧化氢酶阳性，氧化酶和脱氧核糖核酸酶阴性，能发酵葡萄糖，是无色素的运动型棒状细菌. 它的生长温度和在LB、 HB等通用培养基生长情况与其他肠杆菌属特征相似，能通过在肌醇和3-O-methyl-D-glucopyranose上的生长状况与其他肠杆菌区别开来^[25]，目前尚未见该菌产电的报道.

图 3

Fig. 3

相似序列下载于RDP(rdp.cme.msu.edu)，采用Mega 4.0 NJ 法构建系统发育树(bootstrap=1000), 分支处数字为支持率(%)，左下比例尺显示分离距离 图 3 本研究分离到的细菌菌株Lss104和Lss121与相似序列构建的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of the isolates Lss104 and Lss121 and the similar sequences

与Lss121最相似的菌株是弗式柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii MRB070425-1，GenBank登陆号: GU126684)，相似性99%. 该菌革兰氏阴性菌，1～5 μm，长杆状周身有鞭毛可以运动，是致病菌^[26]. 李颖等^[27]从MFC中分离出1株产电菌株Citrobacter freundii LY-3，发现其菌悬液在循环伏安扫描时出现氧化还原峰，且氧化还原不可逆； LY-3菌株在MFC中能利用牛肉膏产电，最大功率密度为 98.2 mW ·m^-2. 另外，有研究 发现Citrobacter freundii Z7以柠檬酸钠为电子供体时^[28]，在单室空气阴极MFC中可获得最大输出电压0.26 V，最大功率密度204.5 mW ·m^-2，显示出了较强的电化学活性. 可见，弗式柠檬酸杆菌是重要的电极活性细菌.

为了检验两株电极活性细菌Lss104和Lss121是否能够直接产电，将纯菌菌液直接加入灭菌的乳酸碳源MFC反应器中，在线监测电压变化，结果如图 4. Lss104和Lss121的最高电压分别是0.104 V和0.136 V，Lss104的产电周期短于Lss121. 一般来说，电极活性菌纯菌株的产电能力低于混合菌群，主要是由于混合菌群在底物和利用过程中能够协同作用，不同种类的微生物分别负责电子受体的产生、 大分子物质的水解和有机物的产电等过程^[29].

图 4

Fig. 4

图 4 两株电极活性细菌菌株Lss104和Lss121的产电情况 Fig. 4 Voltage changes of two electrical active bacteria,Lss 104 and Lss 121

电极活性微生物有助于MFC的产电过程，而混合菌群中其他微生物对产电过程的作用则需要进一步探究. MFC利用微生物处理复杂有机废水并产电是一个复杂的过程，需要多种微生物共同合作. 对微生物之间的相互作用进行深入研究，正确利用微生物之间的协同和拮抗作用，可以形成处理特定有机废水的高性能微生物组合，帮助人们更准确地认识微生物产电和废水处理过程，提高MFC的产电效率.

3 结论

(1)利用亨氏厌氧滚管稀释培养技术，以还原氧化铁的能力为指征，富集和分离电极活性微生物. 结果表明，微生物富集分离过程中群落结构动态变化显著，对微生物群落表现出强烈的选择作用. 甾体药物生产废水等复杂底物MFC阳极膜中优势种类较简单底物，如乳酸和乙酸，要丰富得多.

(2)采用以氧化铁为指征的厌氧滚管稀释培养技术可分离到阳极膜上丰度较低的电极活性微生物，本研究分离到两株产电菌，即路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)和弗式柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，其最大电压分别为0.10 V和0.14 V.