由于抗生素长期被应用于人与动物的疾病治疗及在养殖业中促进动物生长，导致环境微生物耐药性逐渐增强，并严重威胁到人类健康^{[1, 2]}. 城市污水处理厂是耐药菌与抗性基因的重要储存库^{[3, 4, 5, 6, 7]}，其中城市污泥传播抗性的潜在危险性高于污水. 例如，Munir等^[8]的研究表明，城市污水处理厂的活性污泥中的耐药菌(3.17×10⁴~1.85×10⁹ CFU ·g^-1； colony-forming unit，CFU)远高于出水中的耐药菌(5.00~6.10×10³ CFU ·mL^-1). 葛峰等^[9]发现在南京4个城市污水处理厂的活性污泥中分离出的35株细菌中，97.1%的细菌具有不同程度的耐药性，80%的菌株具有多重耐药性. 刘冲等^[10]发现在上海2个城市污水处理厂的外排污泥中3种四环素类耐药菌的浓度均高于进水. 此外，研究表明城市污泥的土地利用很有可能造成抗性污染传播^{[11, 12]}. 由此可知，如果城市污泥处理不当，则会有传播耐药菌与抗生素抗性基因的巨大风险； 另一方面，城市污泥的合理处理也是控制耐药菌传播的重要工艺过程.

然而，目前已有研究大多是针对城市污水处理过程中耐药的好氧菌群^{[8, 13]}，或某特定菌如大肠菌群(Coliforms)^{[14, 15]}、 肠球菌(Enterococci)^[16]、 不动杆菌(Acinetobacter)^{[14, 17]}、 大肠杆菌(Escherichia coli)^{[18, 19]}、 金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)^[20]等的分布特征进行研究，缺乏对城市污泥典型处理工艺，即厌氧消化过程中耐药菌、 尤其是厌氧耐药菌的分布规律与去除特征的研究，污泥中耐药菌的去除及其影响因素和控制方法都有待深入探讨^[21]. 因此，本研究以北京某城市污水处理厂中温厌氧卵形消化池的进泥与出泥为对象，通过为期1 a的调查研究，重点考察应用最广泛的兽用/人类医用抗生素四环素类及β-内酰胺类的厌氧耐药菌在城市污泥中温厌氧消化过程中的分布特征与去除效果，以期为今后城市污泥处理过程中耐药菌传播污染控制提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 样品采集与处理

自2012年9月~2013年8月，定期采集北京某城市污水处理厂卵形消化池的进泥和出泥. 该污水处理厂服务人口300余万，初沉污泥采用中温卵形消化池(35~38℃)处理，日处理规模为2200~2600 m³浓缩污泥(含水率96.5%~97.5%)，污泥停留时间为24~28 d. 将现场所取得的污泥样品置于已灭菌的聚乙烯瓶(1 L)，立刻放于冰上冷藏、 运输到实验室于4℃冷藏保存. 所取污泥样品先经1 mm筛网去除大颗粒杂质后用于污泥TS等各项指标的检测. 污泥样品在取样后48 h内进行总厌氧菌与耐药菌的培养试验. 1.2 厌氧培养基的配制

根据文献^{[22, 23, 24]}推荐的厌氧耐药菌培养方法对卵形消化池进/出污泥中厌氧耐药菌进行培养，重点考察6种抗生素耐药菌在厌氧污泥中的分布情况，分别是3种四环素类抗生素：土霉素(oxytetracycline,OTC)、 金霉素(chlorotetracycline,CTC)、 四环素(tetracycline,TC)和3种β-内酰胺类抗生素：氨苄西林(青霉素类，ampicillin,AMP)、 头孢噻吩(Ⅰ代头孢菌素，cephalothin,CEP)、 头孢噻肟(Ⅲ代头孢菌素，cefotaxime,CFT).

分别取抗生素纯品163.27 mg土霉素(纯度≥98%，LKT Labs,US)，173.13 mg四环素(盐酸盐)(≥95%，Sigma,US)，229.58 mg金霉素(盐酸盐)(≥75%，Sigma,US)，168.88 mg头孢噻吩(钠盐，96.0%~101.0%，Sigma,US)，分别加入到50 mL的灭菌去离子水(Milli-Q,US)中，制备成含抗生素3.2g ·L^-1的母液. 将氨苄西林(钠盐，100 mg ·mL^-1，Goldbio,US)，头孢噻肟(钠盐，100 mg ·mL^-1，Goldbio,US)用灭菌去离子水稀释10倍，制备成10g ·L^-1母液，于-20℃避光保存备用. 耐药菌培养采用Wilkins-chalgren 厌氧琼脂(Oxoid，U.K.)^{[25, 26]}作为厌氧菌培养基. 配制培养基时取相应剂量的抗生素母液加入到培养基中，配制成含抗生素32μg·mL^-1的厌氧耐药菌选择性培养基. 1.3 厌氧菌的培养

取10 mL厌氧污泥加到含有90 mL灭菌PBS缓冲液的三角烧瓶内，加入适量灭菌玻璃珠，在恒温摇床内180 r ·min^-1振荡1 h，制成均匀的稀释液，即为稀释10^-1的菌液. 取1 mL水样，采用10倍梯度稀释法，依此制成10^-2~10^-8稀释菌液. 选择3个适宜的稀释梯度，每个稀释度做3个平行试验. 吸取0.1 mL稀释菌液，接种已倒入灭菌厌氧培养琼脂的培养皿中，以涂布棒涂布均匀，立刻倒置于Anaero Pack密封厌氧培养罐(MGC,JP)中，加入厌氧产气袋(用于消耗剩余氧气)以及氧气指示剂后密封，于37℃恒温生化培养箱中避光培养72 h后计数. 1.4 数据处理

采用SPSS 18.0软件对试验数据进行统计分析. 采用的统计方法包括单因素方差分析、 配对T检验、 独立样本T检验等方法. 对细菌浓度取log值后再进行相应的显著性分析(P<0.05).

2 结果与讨论 2.1 厌氧耐药菌在厌氧消化过程中的分布特征

厌氧污泥中6种抗生素厌氧耐药菌分布情况的全年考察结果见图 1所示. 卵形消化池进泥与出泥中的总异养菌与耐药菌在一年内大多在2个数量级之内波动. 厌氧进泥中总厌氧菌浓度为5.94×10⁸~6.75×10¹⁰ CFU ·g^-1，四环素类耐药菌在3.57×10⁶~1.77×10⁹ CFU ·g^-1之间，β-内酰胺类耐药菌为1.33×10⁷~2.98×10¹⁰ CFU ·g^-1之间.

图 1

Fig. 1

图(a)和(c)为厌氧进泥中耐药菌与总厌氧菌浓度； 图(b)和(d)为厌氧出泥中药菌与总厌氧菌浓度； HPC. 总厌氧菌； OTC.土霉素； TC.四环素； CTC.金霉素； AMP.氨苄西林； CEP.头孢噻吩； CFT.头孢噻肟 图 1 厌氧消化进/出泥中耐药菌浓度的全年分布 Fig. 1 ARB concentrations in the anaerobic sludge during one-year survey

由图 2可知，中温厌氧消化污泥中β-内酰胺类耐药菌量的年均值均高于四环素类耐药菌量. 方差分析结果表明，厌氧进泥的耐药菌之间存在显著差异，氨苄西林与头孢噻吩>头孢噻肟、 土霉素、 四环素>金霉素(P<0.05). 已有研究表明，污水生物处理过程，如传统活性污泥法、 氧化沟、 生物转盘、 膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)等方法可以去除0~5个数量级的耐药菌^[8]，但尚未见到污泥厌氧消化过程中厌氧耐药菌变化趋势研究的报道. 本研究中，厌氧消化过程可以显著去除1.68 log单位总厌氧菌(P<0.05)，并可显著去除各种耐药菌(1.48~1.64 log单位，P<0.05)(图 2).

图 2

Fig. 2

图 2 中温厌氧消化进/出泥中耐药菌浓度的全年平均值 Fig. 2 Average ARB concentrations in the anaerobic sludge during one-year survey

对耐药菌在总厌氧菌中的比例进行分析，可知各种抗生素耐药率在污泥厌氧消化过程中的变化情况. 厌氧进泥与出泥中各种抗生素耐药率的变化见图 3. 厌氧进泥中氨苄西林耐药率最高，为58.01%，显著高于排名其次的头孢噻吩(23.74%)(P<0.05). 而氨苄西林与头孢噻吩的耐药率均显著高于其它4种抗生素(土霉素：4.69%； 四环素：4.81%； 金霉素：0.56%； 头孢噻肟：5.66%)(P<0.05). 虽然耐药菌浓度经过厌氧消化被去除1.48~1.64 log单位，但氨苄西林与头孢噻吩耐药比例却分别从58.01%和23.74%增加到69.99%和38.02%(P<0.05)，其它4种抗生素的耐药比例则无显著变化(P>0.05). 其他学者在研究污水处理过程中也发现了这种处理后耐药菌浓度降低，而部分耐药菌的耐药率升高的现象^{[16, 17, 18]}，但人们对此现象目前尚未有确切的解释，只是推测可能与不同细菌对抗生素敏感程度不同，即抗生素对细菌具有选择性，从而不同细菌在处理过程中的去除比例也有所不同^{[16, 17, 18]}.

图 3

Fig. 3

图 3 厌氧消化进/出泥中耐药率的变化 Fig. 3 Variation of resistance rate in the inlet/outlet anaerobic sludge

本研究的厌氧污泥的厌氧耐药菌中，四环素类耐药率相对较低，为0.56%~5.82%，青霉素类的氨苄西林和Ⅰ代头孢菌素类的头孢噻吩耐药率相对较高，为23.74%~69.99%，Ⅲ代头孢菌素类的头孢噻肟耐药率为5.66%~7.30%，略高于四环素类耐药率. 已有文献中采用传统微生物培养方法研究好氧菌在城市污水、 污泥中抗生素耐药率的结果如表 1所示. 从中可知，虽然各研究者所采用的培养基、 培养方法、 抗生素浓度各有不同，但城市污水、 污泥中的耐药菌都具有青霉素类、 Ⅰ代头孢类抗生素耐药率较高，四环素类抗生素耐药率相对低的特点. 而Kerry等^[27]发现在大量使用兽用抗生素的环境则有较高的四环素耐药率，在鱼塘使用土霉素治疗的第3 d与24 d，鱼塘沉积物中异养菌对土霉素的耐药率从9%迅速增长到26%.

表 1(Table 1)

表 1 文献中总可培养异养菌对各种抗生素的耐药率 1) Table 1 Resistance rate of heterotrophic bacteria in wastewater/sludge in the literature 样品来源 培养基 培养条件 抗生素 浓度/mg·L-1 耐药率/% 文献 青霉素 16 约78 城市污水厂出水 Nutrient agar 37℃培养24 h 氨苄西林 32 约78 [28] 四环素 16 约4 河流沉积物 R2A agar 37℃培养2 d后，室温培养7 d 金霉素 70.55 <10 [29] 土霉素 45.55 <10 城市污水厂进出水、污泥 R2A agar,200mg·L-1 cycloheximide 37℃培养2 d后，27℃培养5 d 四环素 16 <3 [30] 氧化塘污水 BHI medium 37℃培养3 d 金霉素 32 — [31] 四环素 32 — 城市污水厂进出污水、污泥 R2A agar，200mg·L-1 cyclohexamide 37℃培养2 d后，27℃培养5 d 四环素 16 3~4 [8] 城市污水厂生物固体(厌氧后污泥) R2A agar，200mg·L-1 cyclohexamide 27℃培养5 d 氨苄西林头孢噻吩四环素 323216 4.421.21.9 [32] 城市污水厂活性污泥 R2A agar — 四环素 32 <7 [33] 四环素 20 1~4.3 城市污水厂污水 LB agar 37℃培养24 h 土霉素 20 [10] 金霉素 20 鱼塘沉积物 2216 V — 土霉素 25 9~26 [27] 1)表中部分耐药率数据为原文图中估算值

表 1 文献中总可培养异养菌对各种抗生素的耐药率 1) Table 1 Resistance rate of heterotrophic bacteria in wastewater/sludge in the literature

目前研究人员对于污水、 污泥中抗生素残留量与耐药菌的关系尚未有定论^{[29, 34]}. 例如，有研究表明抗生素残留浓度与耐药菌的浓度呈正相关^{[13, 35]}，也有研究认为二者之间不显著相关^[30]. 然而，抗生素的大量使用可以导致耐药菌浓度或耐药水平的增加^{[36, 37]}. 由于城市污水厂接纳的污水主要来自人类生活污水，污水与污泥中耐药菌的分布受到人用抗生素的影响较大. 因此笔者考察了医院的抗生素使用量与城市污水厂厌氧污泥中耐药菌之间的关系，并将在今后研究中继续考察抗生素残留量与耐药菌之间的关系. 我国医院所使用的抗生素以β-内酰胺类为主，使用量远高于四环素类抗生素^{[38, 39, 40, 41, 42]}. 根据郑利光等^[43]对北京地区19家医院2008年6月~2009年5月的抗菌药物采购数的统计分析，北京地区所使用的人用抗生素中，头孢菌素类与青霉素类的使用频率[使用频率(DDDs)=购药总量/限定日用剂量]所占比例分别为31.05% 和6.37%，排名分别为第1和第4，四环素类抗生素则仅为0.31%，排名第15. 这可能是城市污水厂厌氧污泥中四环素类耐药率较低的重要原因之一. 2.3 耐药菌与耐药率的季节性变化

北京具有冬夏持续时间较长而春秋较短的气候特点,在5~9月，日均最高气温在26℃以上，日均最低气温在14~22℃； 而在10月~次年4月，日均最高气温为2~20℃，日均最低气温仅为-9~8℃(http://w.zuzuche.com/weather/c235.html). 此外，我国人用抗生素使用量有冬季大于夏季的特点^{[44, 45]}，而抗生素使用量的增加常会导致耐药菌浓度与耐药水平的增加^{[27, 36]}. 因此，本研究将5~9月和10月~次年4月分别作为温暖季、 寒冷季，对耐药菌在不同季节的分布情况进行分析. 由于卵形消化池内保持恒温，故本研究不考虑厌氧消化温度对耐药菌的影响.

如图 4所示，寒冷季的进泥中总厌氧菌量为1.78×10¹⁰ CFU ·g^-1，显著高于温暖季的1.66×10⁹ CFU ·g^-1(P<0.05). 进泥中寒冷季各种抗生素耐药菌为2.10×10⁷~8.42×10⁹ CFU ·g^-1，温暖季为1.12×10⁷~1.04×10⁹ CFU ·g^-1，除金霉素耐药菌外，总厌氧菌及其它耐药菌均为寒冷季显著高于温暖季(P<0.05). 对于厌氧出泥，只有头孢噻吩耐药菌在寒冷季显著高于温暖季(寒冷季为7.92×10⁷ CFU ·g^-1，温暖季为2.45×10⁷ CFU ·g^-1)(P<0.05)，其它耐药菌则无显著差异，说明一年中厌氧消化过程在总体上对耐药菌起到了很好的去除效果，出泥耐药菌浓度较为稳定.

我国城市污水厂有寒冷季进水COD普遍高于温暖季的特点，导致厌氧污泥的有机物浓度寒冷季高于温暖季. 有机负荷的增加会导致耐药菌增长，但对耐药率的影响不显著^[46]. 因此，本研究中，有机负荷、 抗生素用药量等因素均有利于耐药菌在寒冷季的增长大于温暖季，都是导致本研究中寒冷季耐药菌显著高于温暖季的重要原因.

图 4

Fig. 4

图 4 厌氧污泥中耐药菌在寒冷季与温暖季的分布 Fig. 4 ARB distribution in anaerobic sludge during cold and warm seasons

如图 5所示，虽然耐药菌去除量在寒冷季均高于温暖季，但独立样本T检验分析结果表明，除土霉素耐药菌外(寒冷季去除1.79 log单位，温暖季去除1.21 log单位)(P<0.05)，总异养菌及其它耐药菌并无显著差异(P>0.05).

图 5

Fig. 5

图 5 厌氧污泥中耐药菌在寒冷季与温暖季的去除 Fig. 5 Removal of ARB in anaerobic sludge during cold and warm seasons

独立样本T检验分析结果表明(表 2)，厌氧进泥中各种抗生素的耐药率在寒冷季与温暖季无显著区别，但厌氧出泥中金霉素耐药率温暖季显著高于寒冷季(温暖季1.02%； 寒冷季0.26%)，头孢噻吩耐药率寒冷季显著高于温暖季外(温暖季23.81%； 寒冷季48.17%)，其它抗生素耐药率无显著差异(P>0.05). 与此不同的是，Novo等^[47]发现春季与秋季中细菌对阿莫西林、 四环素、 新诺明的耐药比例有显著不同. 这些研究结果表明，环境微生物的耐药率受到较多因素影响，仍然需要深入探讨.

表 2(Table 2)

表 2 不同季节厌氧污泥中抗生素耐药率的变化 [均值(标准偏差)]/% Table 2 Variation of the resistance rate in anaerobic sludge during different seasons [means(S.D.)]/% 项目 厌氧进泥 厌氧出泥 寒冷季 温暖季 寒冷季 温暖季 OTC 5.15 (4.41) 4.04(2.76) 4.13(3.38) 8.18(5.37) TC 5.35(4.00) 4.04(3.03) 3.75(2.62) 5.11(5.11) CTC 0.36(0.31) 0.83(0.55) 0.26(0.16) 1.02(0.43) AMP 55.35(12.15) 61.72(13.90) 68.24(20.28) 72.45(20.82) CEP 26.09(10.48) 20.44(11.11) 48.17(16.61) 23.81(11.00) CFT 5.50(2.44) 5.89(4.38) 6.00(2.11) 9.12(2.97)

表 2 不同季节厌氧污泥中抗生素耐药率的变化 [均值(标准偏差)]/% Table 2 Variation of the resistance rate in anaerobic sludge during different seasons [means(S.D.)]/%

3 结论

(1)厌氧进泥中四环素类耐药菌在3.57×10⁶~1.77×10⁹ CFU ·g^-1之间，β-内酰胺类耐药菌为1.33×10⁷~2.98×10¹⁰ CFU ·g^-1之间； 中温厌氧消化可以显著去除所有的耐药菌(1.48~1.64 log单位，P<0.05)； 但经过中温厌氧消化，氨苄西林与头孢噻吩的耐药率显著增加，分别增加了12.0%与14.3%(P<0.05)，而其它抗生素的耐药率无显著变化.

(2)厌氧进泥中耐药菌浓度之间存在显著差异，整体上β-内酰胺类耐药菌含量高于四环素类耐药菌：氨苄西林与头孢噻吩>头孢噻肟、 土霉素、 四环素>金霉素(P<0.05)； 厌氧污泥中四环素类耐药率低于β-内酰胺类.

(3)厌氧进泥中耐药菌分布有明显季节特征：除金霉素耐药菌外，总异养菌及其它耐药菌均为寒冷季高于温暖季(P<0.05)； 但厌氧进泥中抗生素耐药率在不同季节无显著区别.