环境科学  2014, Vol.35 Issue (10): 3769-3774   PDF    
引用本文
陈娇, 白晓慧, 卢宁, 王先云, 章永辉, 吴潘成, 郭心驰. 地表水体放线菌分离鉴定与致嗅能力研究[J]. 环境科学, 2014,35 (10): 3769-3774.
CHEN Jiao, BAI Xiao-hui, LU Ning, WANG Xian-yun, ZHANG Yong-hui, WU Pan-cheng, GUO Xin-chi. Actinobacteria and Their Odor-producing Capacities in a Surface Water in Shanghai[J]. Environmental Science, 2014, 35(10): 3769-3774.
地表水体放线菌分离鉴定与致嗅能力研究
陈娇1, 白晓慧1 , 卢宁2, 王先云2, 章永辉1, 吴潘成1, 郭心驰1    
1. 上海交通大学生命科学技术学院, 微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240;
2. 上海城市水资源开发利用国家工程研究中心, 上海 200082
收稿日期: 2014-3-31; 修订日期: 2014-5-4.
基金项目： 上海市科技攻关重点项目（12231201600，13231202904，12231201703，11231200300）；国家自然科学基金项目（J1210047）；沪水科2013-03
作者简介：陈娇（1988~），女，硕士研究生，主要研究方向为水质生物学，E-mail：Benita-chen@sjtu.edu.cn
通讯联系人，白晓慧，E-mail：xhbai@sjtu.edu.cn
摘要：原水中的嗅味是饮用水中嗅味的主要来源之一. 从中国南方地区某水库中分离纯化放线菌并进行菌种鉴定及产致嗅物质2-甲基异莰醇（2-MIB）和土臭素（GSM）能力研究. 使用膜滤法和高氏一号培养基分离纯化水体中的放线菌. 结合菌落菌丝形态特征、碳源利用、菌株生理生化特征及16S rRNA同源性序列分析对从该水库中分离纯化的40株放线菌进行菌种鉴定，结果表明有38株链霉菌、1株气微菌和1株假诺卡氏菌. 分别使用高氏一号液体培养基和水库水体对这40株放线菌进行摇床发酵，结合顶空固相微萃取（SPME）和气质联用（GC-MS）方法检测发酵液中致嗅物质 2-MIB和GSM含量，发现不同放线菌甚至链霉菌属内不同菌种产生致嗅物质的能力不同，且相差较大. 放线菌在液体培养基中产致嗅物质 2-MIB和GSM能力并不完全代表在水库中对水体2-MIB和GSM的贡献大小.
关键词： 水库     放线菌     嗅味     2-甲基异莰醇(2-MIB)     土臭素(GSM)    
Actinobacteria and Their Odor-producing Capacities in a Surface Water in Shanghai
CHEN Jiao1, BAI Xiao-hui1 , LU Ning2, WANG Xian-yun2, ZHANG Yong-hui1, WU Pan-cheng1, GUO Xin-chi1    
1. State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
2. Nation Engineering Research Center of Urban Water Resources, Shanghai 200082, China
Abstract: The odor in raw water is one of the main sources of odor in drinking water. The occurrence of actinobacteria and their odor producing capacities in a reservoir in Shanghai were investigated. Gauze's medium and membrane filtration were used for actinobacteria isolation. Through combined methods of 16S rRNA sequencing, colony and hyphae morphology, carbon source utilization, physiological and biochemical characteristics, 40 strains of actinobacteria were identified from the reservoir. Results showed that there were 38 Streptomyces, an Aeromicrobium and a Pseudonocardia. Liquid culture medium and the real reservoir water were used to test the odor producing capacity of these 40 strains of actinobacteria, and headspace solid phase microextraction (HS-SPME) and high resolution gas chromatography mass spectroscopy (GC/MS) were used to analyze the odor compounds 2-methylisoborneol (2-MIB) and geosmin (GSM) in the fermentation liquor. The test results showed that, the odor-producing capacities of these actinobacteria in different fermentation media showed different variation trends, even within the genera Streptomyces. The odor-producing capacity of actinobacteria in the liquid culture medium could not represent their states in the reservoir water or their actual odor contribution to the aquatic environment.
Key words: reservoir     actinobacteria     odor     2-methylisoborneol (2-MIB)     geosmin (GSM)    

在饮用水水质指标中，感官性状指标是评价水质的重要依据. 感官性状指标包括水的色度、 嗅味和混浊度，其中嗅味是人们评价饮用水质最早和最直接的参数之一. 具有嗅味的水会让人产生不信任感和不安全感. 饮用水嗅味问题已成为一个世界性问题[1]. 水体富营养化会造成微生物大量繁殖，以湖泊、 水库为原水的缓流水体中的微生物代谢是造成饮用水嗅味问题的重要原因. 在富营养化水体中的藻细胞能分泌各种致嗅物质，如土臭素、 2-甲基异莰醇、 三甲基胺等[2, 3, 4]. 有些放线菌也可以代谢产生强烈霉味的土臭素和2-甲基异莰醇以及吡嗪类等嗅味物质[5, 6, 7]. 嗅味复合物(taste and odor compounds,TOCs)2-甲基异莰醇(2-MIB)和土臭素(GSM)是饮用水中两种重要的致嗅物质[8, 9, 10]. 目前对产嗅微生物，特别是产嗅放线菌的微生物种属特征及其产嗅能力缺乏系统研究.

本实验通过对我国南方夏秋季某水库中放线菌进行分离纯化和菌种鉴定，并对这些放线菌在不同培养条件下产生致嗅物质2-MIB和GSM的能力进行评估，探究作为饮用水源的缓流水体中的放线菌的产嗅特征.

1 材料与方法 1.1 放线菌富集培养及分离纯化

本实验于2013年6~10月在南方地区某水库中逐月采样，从水库水体中分离放线菌. 使用加入重铬酸钾(抑制细菌和真菌的生长)的高氏一号培养基(每300 mL高氏一号培养基中加入1 mL浓度为3%的重铬酸钾)来富集培养水样中的放线菌. 如果放线菌数量较少，则采用0.45 μm的纤维素醋酸酯膜抽滤水样，将膜贴在培养基平板上，不像真菌和细菌，放线菌能够穿透滤膜的孔在膜的表面和下面生长[11]. 28℃恒温培养7 d，划线分离直至纯化. 使用20%的甘油管和斜面培养基进行保藏.

1.2 放线菌菌种鉴定

选取分离纯化的40株放线菌，使用离心柱型DNA提取试剂盒和溶菌酶提取放线菌的DNA. 使用放线菌的特异性通用引物，扩增16S rRNA序列，引物序列分别为S-C-Act-235-a-S-20： 5′-CGCGGCC TATCAGCTTGTTG-3′和S-C-Act-878-a-A-19： 5′-CCGTACTCCCCAGGCGGGG-3′[12].

PCR扩增体系为50 μL，其中，10×buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，引物各2.5 μL(10 mmol ·L-1)，模板 200 ng左右，Taq酶0.5 μL，DMSO 2.5 μL，用无菌超纯水补齐. 扩增片段大小为600 bp左右. 采用Touch Down PCR，条件为：95℃ 4 min； 95℃ 45 s，72℃ 45 s，68℃ 1 min，共10个循环，每个循环降低0.5℃； 95℃ 45 s，68℃ 45 s，68℃ 1 min，共15个循环，68℃延伸10 min. 结果送至测序公司检测. 将测序结果在ez-Taxon数据库中进行同源比对[13].

使用国际链霉菌计划指定培养基酵母精麦芽糖琼脂(ISP-2)、 燕麦粉琼脂(ISP-3)、 无机盐淀粉琼脂(ISP-4)、 甘油天门冬素培养基(ISP-5)观察菌株的培养特征，如气生菌丝、 基内菌丝以及可溶性色素的颜色. 在接种放线菌的高氏一号培养基上斜向插入盖玻片，28℃恒温培养5~7d后将盖玻片进行革兰氏染色，用光学显微镜观察气生菌丝和基内菌丝及孢子的形态特征.

通过放线菌的碳源利用实验(L-阿拉伯糖、 L-鼠李糖、 D-半乳糖、 D-甘露糖、 D-果糖、 D-木糖、 D-葡萄糖、 棉子糖、 肌醇、 乳糖和蔗糖)、 生理生化特征实验(牛奶凝固胨化、 明胶液化、 硝酸盐还原、 纤维素生长、 淀粉水解、 硫化氢和色素产生)，综合16S rRNA基因测序结果和菌落菌丝形态特征，分析鉴定放线菌的种属.

1.3 放线菌的发酵培养

在50 mL的锥形瓶中加入30 mL的高氏一号液体培养基[14]，接种后放置摇床中培养. 摇床转速为200 r ·min-1，28℃恒温培养7 d后，将发酵液产物5 000 r ·min-1离心10 min，尽量将发酵液吸干到干净无菌的离心管，取10 mL发酵液测定2-MIB和GSM的浓度. 将离心管内的菌体110℃烘干约2 h后冷却至室温，测菌体生物量干重.

为了研究放线菌在水体环境中是否具有产生嗅味物质的能力，在50 mL锥形瓶中加入30 mL的水库水，接种后放置摇床中培养. 同样条件培养7 d，水体中的菌体较少，采用了0.45 μm的纤维素醋酸酯膜抽滤发酵液，将滤膜110℃烘干后称重，计算菌体生物量干重，取10 mL发酵液测定2-MIB和GSM的浓度. 检测接种放线菌前后水样的2-MIB和GSM，由前后差值来体现放线菌对水体中嗅味物质的贡献. 进一步分析不同培养条件下放线菌的致嗅能力以及代谢产物2-MIB和GSM的关系.

1.4 致嗅物质2-MIB和GSM的检测方法

本实验使用顶空固相微萃取技术(HS-SPME) 在短时间萃取富集致嗅物质2-MIB和GSM，使用气相色谱质谱联用(美国Perkin Elmer公司AutoSystem XL GC/TurboMass MS)方法检测[15, 16, 17, 18]. 在试样瓶中加入10 mL发酵液后再加入2.4 g无水硫酸钠，70℃萃取10 min后进样. 进样起始温度为40℃，保持2 min后以10℃ ·min-1的速度升温至240℃，保持3 min. 2-MIB和GSM的响应值与浓度的标准曲线相关系数分别为0.999 7和0.999 9. 该方法精密度高，回收率高达90%，重复测定3次，相对误差在±5%以内.

2 结果与讨论 2.1 放线菌菌种鉴定结果

本实验从水库连续采样，分离纯化出40株放线菌株，综合分析菌落菌丝形态特征、 生理生化特征以及16S rRNA基因测序结果，在经过一一比对分析后，各菌株鉴定结果如表 1.

表 1 放线菌菌株鉴定结果Table 1 Identification of the isolated actinobacteria

由表 1鉴定结果可知，在40株放线菌中，只有两株菌分别是气微菌和假诺卡氏菌，其余38株菌都是链霉菌. 链霉菌是该水库水体中可培养放线菌的主要菌属. 其中，气微菌属在空气、 海洋沉积物、 土壤中曾被发现. 气微菌是气微菌属中重要的模式菌株，对环境适应能力较强. 假诺卡氏菌属是一类比 较安全的微生物，能够代谢产生多种生物活性代谢产物，有很好的研究前景. 链霉菌是一类产生抗生素的重要菌属，多数链霉菌有抗生素的耐药基因，能够对自身产生的抗生素显示耐受性. 放线菌具有独特的生态多样性和代谢产物多样性特征. 本实验主要研究上述从水库中分离出来的放线菌是否能够代谢产生2-MIB和GSM以及对水体嗅味物质2-MIB和GSM的贡献，因此，进一步对这40株放线菌分别做了高氏一号液体培养基发酵和水库水体的发酵实验.

2.2 放线菌在不同发酵介质中的产嗅能力 2.2.1 放线菌在高氏一号液体培养中的产嗅能力

由图 1可以看到，这40株放线菌在高氏一号液体培养基中培养产生2-MIB和GSM的能力大小各不相同，其中有3株放线菌(7.5%)只产生GSM，1株(2.5%)只产生2-MIB，其余的36株(90%)都能产生GSM和2-MIB. 水库中分离纯化出的气微菌(12号)和假诺卡氏菌(30号)在液体培养基中发酵时，产生致嗅物质的能力都较低，两种致嗅物质主要由链霉菌产生. 而链霉菌中不同种产生致嗅物质能力不同，且相差较大. 可以看到Streptomyces wedmorensis(39号)和Streptomyces cirratus(40号) 以及Streptomyces halstedii(26号)在高氏一号液体培养基中产生2-MIB的能力较强，单位生物量产生的2-MIB在9 000 ng ·g-1以上. 而Streptomyces melanogenes(31号)在高氏一号液体培养基中产生GSM的能力较强，单位生物量产生的2-MIB为6 769 ng ·g-1. 总体上，在液体发酵时，2-MIB的量要超过GSM，是主要致嗅物质.

图 1 40株放线菌在液体培养基中单位生物量产生的2-MIB和GSMFig. 1 2-MIB and GSM production by the 40 strains of Actinobacteria in the liquid medium
2.2.2 放线菌在水库水体中的产嗅能力

由图 2可以看到，40株放线菌在水库水中产生2-MIB和GSM的能力也是大小各不相同. 其中有8株放线菌(20%)只能产生GSM，其余32株(80%)都能产生GSM和2-MIB，这也说明在水中能够产生致嗅物质GSM的放线菌菌株居多. 但是从图 2中可以看到，放线菌对水体2-MIB的贡献量明显高于GSM. 气微菌(12号)在实际水体中发酵时产生致嗅物质的能力同样较低，而假诺卡氏菌(30号)产生2-MIB的能力较强，与液体培养发酵时效果不同. 在水库水中发酵时，链霉菌对水中致嗅物质贡献最大，但链霉菌中不同种在水中产生致嗅物质能力不同，且相差较大.

图 2 40株放线菌在水库水中单位生物量产生的2-MIB和GSFig. 2 2-MIB and GSM production by the 40 strains of Actinobacteria in the real reservoir water

图 3 不同培养条件下放线菌菌株单位生物量产生的2-MIB和GSM的比值Fig. 3 Ratios of 2-MIB to GSM produced by Actinobacteria in different fermentation media
2.2.3 放线菌在不同培养条件下的致嗅能力分析

从图 1和图 2可以看到，Streptomyces rochei(2号)在水中发酵培养产生2-MIB与GSM的能力相对最强，但在高氏一号液体培养基中并没有显示出很强的产致嗅物质能力. 而对于Streptomyces halstedii(26号)，在高氏一号培养基中产生致嗅物质2-MIB的能力较强，但在水中产生能力较弱. 因此以上放线菌在高氏一号培养基中的致嗅能力并不代表在水体环境中的致嗅能力. 有研究者通过实验发现从湖泊底泥中分离出的6株链霉菌在不同的培养基中产生致嗅物质2-MIB和GSM的能力不同[19]，说明不同的营养条件会影响放线菌的致嗅能力，而不同的放线菌对环境条件改变的适应能力不同. 同时，从图 1和图 2可看到，Streptomyces cirratus(40号)在高氏一号培养基中和在水中产生致嗅物质2-MIB的能力都较强. Streptomyces galbus(11号)在高氏一号培养基中和在水中产生致嗅物质GSM的能力都较强，所以这两株放线菌在高氏一号培养基中产致嗅物质2-MIB和GSM的能力可以体现其在水体环境产生致嗅物质的能力. 如图 3，对于在液体培养基和水体环境中发酵都能产生2-MIB与GSM的放线菌，反映不同致嗅物质相对贡献的2-MIB与GSM比值并不是一个定值，且随着培养条件的改变，同一放线菌2-MIB与GSM比值有不同程度的改变. 其中，在高氏一号液体培养基中发酵时，50%的放线菌2-MIB与GSM比值大于1； 在水库水体中发酵时，63.3%的放线菌菌株大于1. 由图 3中可以看到，在高氏一号液体培养基中2-MIB与GSM比值较大的放线菌(如4、 5、 26、 38号等)，在水体中发酵时2-MIB与GSM比值明显降低，这说明水体环境更促进这些放线菌GSM的产生而抑制2-MIB的产生. 而2-MIB与GSM比值变化幅度最大的Streptomyces omiyaensis(20号)，则是水体环境促进了2-MIB的产生而抑制了GSM的产生. 有研究者报道了放线菌中2-MIB和GSM的生物合成途径[20, 21, 22]. 通过分析合成途径，发现是异戊烯基焦磷酸(IPP)转换成香叶基焦磷酸(GPP)，香叶基焦磷酸(GPP)转换成法尼焦磷酸(FPP)和2-MIB，法尼焦磷酸(FPP)最后转换成GSM. 2-MIB和GSM的比值变化可能是由于GPP转换成FPP以及FPP转换成GSM的途径受到不同程度的影响.

3 结论

(1)从水库水样中分离出40株放线菌，其中链霉菌38株、 占95%，其余为气微菌和假诺卡氏菌各一株.

(2)水库中分离出的放线菌大部分可同时产生2-MIB和GSM，但是不同的放线菌甚至不同的链霉菌种产生致嗅物质2-MIB和GSM的能力不同，水中放线菌总数与水体致嗅物质2-MIB和GSM的浓度不一定呈正相关性.

(3)对分离出的大部分放线菌，在高氏一号液体培养基中代谢产生2-MIB和GSM的能力大小并不完全代表对水库水体中致嗅物质的贡献大小，不同的培养条件会影响到放线菌的致嗅能力，但放线菌Streptomyces cirratus和Streptomyces galbus例外.

(4)不同放线菌产生的2-MIB和GSM不存在固定的比值，同一放线菌在不同培养条件下产生的2-MIB和GSM的比值也存在不同程度的变化. 在水库水中发酵时，2-MIB是主要的致嗅物质.

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