环境科学  2014, Vol.35 Issue (8): 3018-3023   PDF    
引用本文
刘春, 龚鹏飞, 肖太民, 张明, 年永嘉, 杨景亮, 张晶. SPG膜曝气-基因工程菌生物膜反应器处理阿特拉津废水研究[J]. 环境科学, 2014, 35(8): 3018-3023.
LIU Chun, GONG Peng-fei, XIAO Tai-min, ZHANG Ming, NIAN Yong-jia, YANG Jing-liang, ZHANG Jing. Atrazine Wastewater Treatment in a SPG Membrane-Aerated Genetically Engineered Microorganism Biofilm Reactor[J]. Environmental Science, 2014, 35(8): 3018-3023.
SPG膜曝气-基因工程菌生物膜反应器处理阿特拉津废水研究
刘春, 龚鹏飞, 肖太民, 张明, 年永嘉, 杨景亮, 张晶     
河北科技大学环境科学与工程学院, 河北省污染防治生物技术重点实验室, 石家庄 050018
收稿日期: 2014-1-6; 修订日期: 2014-3-11.
基金项目： 国家自然科学基金项目（51008111）；河北省应用基础研究计划重点基础研究项目（11966726D）
作者简介：刘春（1976~），男，博士，副教授，主要研究方向为废水生物处理技术，E-mail：liuchun@hebust.edu.cn
摘要：膜曝气-生物膜反应器（MABR） 是一种新型的膜-生物废水处理工艺，在MABR中采用基因工程菌生物膜可以强化难降解污染物的生物去除. 本研究在SPG膜表面形成基因工程菌生物膜，运行SPG膜曝气-生物膜反应器（SPG-MABR）处理阿特拉津废水，考察了气压、 挂膜生物量和液体流速对SPG-MABR运行性能的影响，以及基因工程菌生物膜的变化. 结果表明，提高气压可以增大透氧系数，从而提高阿特拉津和COD的去除速率以及复氧速率. 提高挂膜生物量能够加快阿特拉津和COD的生物去除，但生物膜厚度增加使得氧传质阻力增大，复氧速率降低. 层流状态下减小SPG-MABR中的液体流速，有利于污染物向生物膜扩散传质，从而提高污染物去除速率. 气压为300 kPa、 生物量为25 g·m-2、 液体流速为0.05 m·s-1时，SPG-MABR反应器对阿特拉津5 d的去除率可以达到98.6%. 在SPG-MABR运行过程中，基因工程菌生物膜呈现微生物多态化趋势. 生物膜表面逐渐被其他微生物细胞覆盖，基因工程菌分布减少，生物膜内部仍以基因工程菌细胞为主.
关键词： 膜曝气-生物膜反应器     基因工程菌     SPG膜     阿特拉津     透氧系数    
Atrazine Wastewater Treatment in a SPG Membrane-Aerated Genetically Engineered Microorganism Biofilm Reactor
LIU Chun, GONG Peng-fei, XIAO Tai-min, ZHANG Ming, NIAN Yong-jia, YANG Jing-liang, ZHANG Jing    
Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China
Abstract: Membrane-aerated biofilm reactor (MABR) represent a novel membrane-biological wastewater treatment technology. In addition, bioaugmented treatment using genetically engineered microorganism (GEM) biofilm in MABR is proposed to improve refractory pollutant removal. In the present study, a SPG membrane aerated-biofilm reactor (SPG-MABR) with GEM biofilm formed on the SPG membrane surface was applied to treat atrazine wastewater. The influences of air pressure, biofilm biomass and liquid velocity on the performance of the SPG-MABR were investigated. The variation of GEM biofilm during the SPG-MABR operation was observed. The results indicated that the increased air pressure could promote atrazine and COD removal as well as re-oxygenation by increasing oxygen permeability coefficient. A higher biofilm biomass could also enhance atrazine and COD removal, but simultaneously reduce the re-oxygenation rate because biofilm thickness and oxygen transfer resistance increased. When liquid velocity in the SPG-MABR was decreased under laminar flow condition, atrazine and COD removal was improved due to the facilitated contaminant diffusion from wastewater to biofilm. The atrazine removal efficiency reached to 98.6% in the SPG-MABR after 5d treatment at air pressure of 300 kPa, biofilm biomass of 25 g·m-2 and liquid velocity of 0.05 m·s-1. The microbial polymorphism of GEM biofilm was observed during the SPG-MABR operation. The surface of GEM biofilm was gradually covered by other microbial cells and the distribution of GEM cells reduced, but inside the GEM biofilm, the GEM cells were still dominant.
Key words: membrane-aerated biofilm reactor     genetically engineered microorganism     SPG membrane     atrazine     oxygen permeability coefficient    

膜曝气-生物膜反应器(membrane aerated biofilm reactor，MABR)将膜技术与生物膜技术相结合[1, 2, 3]，逐渐成为水处理工艺研究的热点之一. MABR反应器中膜外表面附着生长生物膜，膜内腔为压缩氧气或空气，气相中的氧通过膜孔扩散进入生物膜，在生物膜内完成污染物的去除. MABR反应器采用无泡曝气[4, 5]，氧直接以分子状态扩散进入生物膜，传质液膜阻力可以忽略，传质效率高，因而MABR反应器可以获得接近100%的极高氧利用效率[6]. 同时，MABR反应器中生物膜异向传质，底物和氧的浓度梯度方向相反，有助于实现处理功能活性层化，从而具有去除有机污染物和同步硝化反硝化脱氮功能[7, 8].

目前，MABR中用于曝气的膜材料主要有3类：微孔膜、 致密膜和复合膜[2]，此外还有采用可透气性织物或陶瓷膜进行无泡曝气的报道[9]. SPG(shirasu porous glass)膜是一种具有均匀微小孔径的无机玻璃微孔膜[10]，在产生微气泡过程中得到应用[11, 12, 13]，也可以作为一种可能的膜材料应用于MABR反应器，但目前未有相关的研究报道.

基因工程菌应用于生物强化可以有效去除难降解污染物，加速处理启动过程，提高系统抗冲击能力，增强微生物群落结构及功能的稳定性[14, 15, 16]. 生物膜中细胞接触频率高，降解基因在生物膜中的迁移频率远远高于液相环境[17, 18]. 运行膜曝气-基因工程菌生物膜反应器有利于降解基因在生物膜内的水平迁移，从而改善生物强化效果及其稳定性.

阿特拉津是世界上用量最大的除草剂，环境残留严重，生态风险较高，且废水排放不当会污染水源并危害农业生产[19, 20]. 传统生物处理过程对阿特拉津的处理效果较差[21, 22]，而采用基因工程菌生物强化可以有效提高阿特拉津生物去除效率[23, 24]. 本研究在SPG膜表面形成基因工程菌生物膜，运行SPG膜曝气-生物膜(基因工程菌)反应器(SPG-MABR)处理阿特拉津废水，考察了不同运行条件下SPG-MABR中基因工程菌生物膜对阿特拉津的生物强化去除效果，并探讨了SPG-MABR的氧传质能力以及生物膜传质阻力和生物活性对氧传质能力的影响，以期为难降解废水提供一种新的生物强化处理技术.

1 材料与方法 1.1 菌株和菌悬液的制备

本研究使用的基因工程菌受体细胞为E. coli DH5α，质粒载体为pUC18，携带阿特拉津脱氯水解酶基因(atzA)、 绿色荧光蛋白基因(gfp)及氨苄青霉素抗性基因[25].

挑取单菌落于LB培养基中(含60 μg ·mL-1氨苄青霉素)，在37℃，120~140 r ·min-1摇床转速下培养过夜，离心，磷酸缓冲液(pH=7.0)洗涤，收获细胞，一定量蒸馏水重悬，制成菌悬液备用.

1.2 SPG-MABR反应器

SPG-MABR反应器装置如图 1所示. SPG膜为管式亲水膜，膜管径为1.0 cm，膜管长为50 cm，膜孔径为0.6 μm，膜面积为1.57×10-2 m2. 在SPG膜外侧形成基因工程菌生物膜，置于不锈钢柱形反应器中，反应器有效容积为0.12 L，密封进水槽有效容积为5L(即为处理水量). 采用液体循环泵实现废水在反应器内的循环处理，通过调节循环流量控制反应器内液体流速. 具有一定压力的空气(低于泡点压力)从SPG膜内侧进行无泡曝气. 单纯SPG膜泡点压力>100 kPa，形成生物膜后泡点压力显著升高(>300 kPa).

图 1 SPG膜曝气-基因工程菌生物膜反应器示意

Fig. 1 Schematic diagram of SPG membrane-aerated GEM biofilm reactor

1.3 SPG-MABR反应器运行

挂膜：采用抽滤方法强化挂膜过程，以SPG膜为过滤介质，对SPG膜外侧一定量的基因工程菌悬液进行抽滤，将基因工程菌细胞截留至SPG膜外侧，在SPG膜外侧形成均匀致密的基因工程菌生物膜.

运行：挂膜完成后，在不同的运行条件(气压、 挂膜生物量、 液体流速)下进行间歇运行实验，运行周期为7 d，处理阿特拉津浓度为15~20 mg ·L-1的人工配水[26]，处理水量为5 L. 测定反应器内溶解氧(DO)浓度和污染物浓度(COD和阿特拉津)随时间的变化，考察反应器的运行性能及运行条件的影响，并在此过程中对基因工程菌生物膜变化进行观察.

1.4 SPG-MABR反应器透氧系数测定

无生物膜时，测定SPG膜在清水中的透氧系数. 加入Na2SO3和CoCl2去除清水中原有DO，控制一定的气压和流速，进行无泡曝气，测定DO浓度随时间变化曲线. 通过式(1)线性回归得到斜率，即为单纯SPG膜无泡曝气透氧系数.

式中,f 为透氧系数; c为t时刻的DO浓度; V为处理水量; S为SPG膜表面积; p为气压.

存在生物膜时，在SPG-MABR反应器处理废水运行过程中，测定反应器内DO浓度和COD浓度随时间的变化曲线. 在COD去除阶段(12~36 h)，通过式(2)线性回归得到斜率，估算透氧系数. 在随后的复氧阶段(72 h后)通过式(1)估算透氧系数.

式中,f 为透氧系数; Δc为Δt时间内COD的去除量; V为处理水量; S为SPG膜表面积; p为气压.

1.5 基因工程菌生物膜观察

在SPG-MABR反应器运行初期和末期，从SPG膜上获取生物膜样品进行观察分析. 通过扫描电子显微镜(SEM)(HITACHI，S-4800-I，日本)观察生物膜微生物相的变化. 采用荧光显微镜(Motic，BA200，中国)对生物膜基因工程菌细胞的绿色荧光性进行观察[27]. 采用荧光原位杂交(FISH)技术检测生物膜样品中atzA基因分布. 所用atzA特异性荧光探针序列为：5′-ACG GGC GTC AAT TCT ATG AC，5′荧光物质为FITC. 杂交后的生物膜样品置于荧光显微镜下进行观察[28].

1.6 分析方法

DO浓度采用溶解氧测定仪(WTW cellOx 325，德国)测定. COD采用国标法测定.

阿特拉津浓度：含有阿特拉津的水样用0.45 μm的滤膜过滤后，采用HP1050型HPLC检测，色谱柱为Aichrom C18反相柱，检测器为二极管阵列检测器，检测条件：流动相配比为甲醇 ∶水=70 ∶30，检测波长为223 nm. 2 结果与讨论 2.1 气压对SPG-MABR反应器运行性能的影响

在液体流速为0.05m ·s-1、 生物量为25 g ·m-2的条件下，比较了气压为200 kPa和300 kPa时，SPG-MABR反应器的运行性能. 废水处理过程中阿特拉津浓度变化如图 2所示. 可以看到，基因工程菌生物膜对阿特拉津具有良好的去除效果，提高气压可以明显加快阿特拉津去除速率. 气压为300 kPa时，基因工程菌对阿特拉津5 d的去除率可以达到98.6%.

图 2 同气压下SPG-MABR中阿特拉津去除

Fig. 2 Atrazine removal in the SPG-MABR at different air pressures

运行过程中，DO浓度以及COD浓度变化如图 3和图 4所示. 可以看到，在初始处理阶段(0~2 d)，DO浓度迅速降低并维持在极低水平(<0.5 mg ·L-1); 随后在复氧过程中，DO浓度逐渐升高并趋于稳定. 同时，废水中的COD也是在初始处理阶段(0~3 d)去除最快，去除率接近80%; 随后COD几乎不再去除. 这个过程反映了废水中的有机物在好氧代谢过程中对DO的利用消耗过程. 同时，气压较大时可以获得更快的COD去除速率和复氧速率.

图 3 不同气压下SPG-MABR运行中DO浓度变化

Fig. 3 DO concentrations during SPG-MABR operation at different air pressures


图 4 不同气压下SPG-MABR运行时COD浓度变化

Fig. 4 COD concentrations during SPG-MABR operation at different air pressures

通常认为，氧扩散传质是MABR反应器运行的限制过程[2, 29]，而气压是影响氧扩散传质的重要因素，因而气压对MABR运行性能具有显著影响. 初始处理(COD去除)阶段，由于COD的快速好氧降解，DO在生物膜内基本被消耗，因此液相主体中的DO浓度极低，可基于此阶段COD的去除速率估算透氧系数. 此时，在200 kPa和300 kPa气压条件下，基于COD去除估算的透氧系数分别为2.51 g ·(m2 ·d ·bar)-1和2.82 g ·(m2 ·d ·bar)-1. COD去除完成后为复氧阶段，DO开始从生物膜内扩散到液相主体，因此液相主体的DO浓度逐渐升高，在200 kPa和300 kPa气压条件下，通过72 h后的复氧曲线计算的透氧系数分别为0.15 g ·(m2 ·d ·bar)-1和0.29 g ·(m2 ·d ·bar)-1. 可见，300 kPa气压下的透氧系数较高，因而SPG-MABR反应器运行性能较好，但反应器运行能耗也会随之增加.

此外，100 kPa气压下单纯SPG膜透氧系数为3.31 g ·(m2 ·d ·bar)-1，与聚丙烯致密膜的透氧系数基本相当[30]. 和单纯SPG膜透氧系数相比，300 kPa气压下(气压提高3倍)，SPG-MABR复氧阶段的透氧系数大幅下降，可见生物膜传质阻力显著降低了氧扩散传质的能力; 同时，在COD去除阶段，SPG-MABR的透氧系数大大高于复氧阶段，接近单纯SPG膜透氧系数，表明生物膜内好氧降解过程对DO的消耗可以强化氧扩散传质[29].

2.2 挂膜生物量对SPG-MABR反应器运行性能的影响

在液体流速为0.05m ·s-1、 气压为200 kPa的条件下，比较了挂膜生物量为25 g ·m-2和50 g ·m-2时，SPG-MABR反应器的运行性能. 废水处理过程中阿特拉津浓度变化、 DO浓度变化和COD浓度变化如图 5~7所示. 可以看到，挂膜生物量较大时，污染物(阿特拉津和COD)的去除速率有所提高，但COD去除后的复氧速率有所降低.

图 5 不同挂膜生物量下SPG-MABR中阿特拉津去除

Fig. 5 Atrazine removal in the SPG-MABR at different biofilm biomasses

当挂膜生物量从25 g ·m-2提高至50 g ·m-2时，由于COD去除能力提高，COD去除阶段的透氧系数从2.51 g ·(m2 ·d ·bar)-1提高至3.50 g ·(m2 ·d ·bar)-1; 同时由于生物膜厚度增加，增大了生物膜传质阻力，因此复氧阶段的透氧系数从0.15 g ·(m2 ·d ·bar)-1降低至0.068 g ·(m2 ·d ·bar)-1. 此结果进一步表明，生物膜本身具有很强的氧传质阻力，但生物膜的代谢活性可以通过对DO的消耗促进氧扩散传质.

图 6 不同挂膜生物量下SPG-MABR运行中DO浓度变化

Fig. 6 DO concentrations during SPG-MABR operation at different biofilm biomasses


图 7 不同挂膜生物量下SPG-MABR运行时COD浓度变化

Fig. 7 COD concentrations during SPG-MABR operation at different biofilm biomasses

2.3 液体流速对SPG-MABR反应器运行性能的影响

液体中的污染物向生物膜的扩散传质是影响SPG-MABR运行性能的另一主要因素，而液体流速对污染物的扩散传质具有重要影响. 反应器中液体流速<0.15 m ·s-1时为层流状态，此时，污染物主要以分子扩散的方式从废水进入生物膜.

在气压为200 kPa、 生物量为25 g ·m-2的条件下，比较了液体流速为0.025、 0.05和0.10 m ·s-1时，SPG-MABR反应器的运行性能. 废水处理过程中阿特拉津浓度变化如图 8所示. 可以看到，在较小的液体流速下，阿特拉津的去除速率较快. 同时，COD的去除速率在较小的液体流速下也有所提高(数据未给出). 可见，在层流状态下，降低液体流速可以增加废水与生物膜的接触时间，有利于污染物向生物膜扩散传质，从而提高污染物去除速率.

图 8 不同液体流速下SPG-MABR中阿特拉津去除

Fig. 8 Atrazine removal in the SPG-MABR at different liquid velocities

需要指出的是，SPG-MABR在不同条件下运行过程中，阿特拉津去除负荷范围为90~260 mg ·(L ·d)-1，显著高于基因工程菌生物强化MBR反应器对阿特拉津的去除负荷[70 mg ·(L ·d)-1][23]，表现出SPG-MABR的工艺优势.

2.4 基因工程菌生物膜变化

对挂膜后运行初期的SPG膜表面基因工程菌生物膜进行观察，结果如图 9所示. 由图 9A可以看到，采用抽滤方法强化挂膜，可以快速形成均匀致密的生物膜. 采用SEM对生物膜进行观察，可以看到生物膜细胞形态均为杆状基因工程菌细胞[图 9B]. 基因工程菌细胞具有gfp基因标记，因此采用荧光显微镜直接观察生物膜，可以看到生物膜中基因工程菌具有明显绿色荧光现象[图 9C]. 采用FISH技术对生物膜中基因工程菌进行atzA基因检测，可以观察到均匀、 丰富的atzA基因分布[图 9D]. 以上观察结果表明，SPG膜表面形成了具有生物活性的基因工程菌生物膜.

图 9 运行初期SPG膜表面基因工程菌生物膜观察

Fig. 9 Observation of genetically engineered microorganism biofilm on the SPG membrane surface at the initial operation phase

A.SPG膜表面生物膜; B.生物膜细胞形态; C.生物膜基因工程菌绿色荧光观察; D.生物膜atzA基因FISH检测

对SPG-MABR反应器运行结束后的基因工程菌生物膜进行观察，结果如图 10所示. 可以看到，生物膜表面的绿色荧光现象明显减弱(图 10A1)，而且生物膜表面的atzA基因丰度也显著降低(图 10 A2)，而生物膜表面SEM观察表明杆状基因工程菌细胞减少，其它形态的微生物细胞大量出现(图 10 A3). 可见，在SPG-MABR运行过程中，基因工程菌生物膜呈现微生物多态化趋势，特别是生物膜表面逐渐被其他微生物细胞覆盖，基因工程菌的分布减少. 然而，在生物膜内部绿色荧光现象仍较为显著(图 10B1)，atzA基因丰度也明显高于生物膜表面(图 10B2)，且细胞形态仍然以杆状基因工程菌细胞为主(图 10B3)，可见生物膜内部基因工程菌保持较好，因而MABR反应器在运行过程中，对阿特拉津的去除性能未受到明显影响.

图 10 运行末期SPG膜表面基因工程菌生物膜观察

Fig. 10 Observation of genetically engineered microorganism biofilm on the SPG membrane surface at the final operation phase

A1.生物膜表面绿色荧光观察; A2.生物膜表面atzA基因FISH检测; A3.生物膜表面细胞形态; B1.生物膜内部绿色荧光观察; B2.生物膜内部atzA基因FISH检测; B3.生物膜内部细胞形态

3 结论

(1) 在SPG-MABR反应器运行中，提高气压可以增大透氧系数，从而提高阿特拉津和COD的去除速率以及复氧速率. 增加挂膜生物量能够提高阿特拉津和COD的去除速率; 但随着生物膜厚度增加，氧传质阻力增大，复氧速率降低. 层流状态下减小反应器中的液体流速，有利于污染物向生物膜扩散传质，从而提高污染物去除速率.

(2) 气压为300 kPa、 生物量为25 g ·m-2、 液体流速为0.05 m ·s-1时，SPG-MABR反应器中基因工程菌生物膜对阿特拉津5 d的去除率可以达到98.6%.

(3) 采用抽滤方式可以在SPG膜表面快速形成均匀致密的基因工程菌生物膜. 在SPG-MABR运行过程中，生物膜呈现微生物多态化趋势. 生物膜表面逐渐被其他微生物细胞覆盖，基因工程菌分布减少，生物膜内部仍然以基因工程菌细胞为主.

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