腐殖酸(HA)是动植物残体经过复杂的理化过程，形成的含有大量酚羟基、 醌基和其他基团的大分子有机混合物，在各种环境介质(土壤、 沉积物、 河流、 湖泊等)中广泛存在^{[1, 2, 3]}. 研究HA与污染物相互作用下污染物迁移转化过程和生态效应^{[4, 5, 6]}，已成为环境生物地球化学领域研究热点之一. HA与环境污染物之间相互作用主要通过螯合作用、 疏水作用和氢键作用等^[7,8]，其研究方法有：离子选择电极法、 溶出伏安法、 超滤法、 离子交换法、 荧光猝灭滴定法等^[9]. 其中，荧光猝灭法已被广泛应用于溶解性有机质与猝灭剂之间相互作用研究，是一种高效而灵敏的方法^{[10, 11, 12, 13]}.

洛克沙胂(ROX)因具有抗寄生虫病、 促进动物生长、 改善动物生产品质等多重作用，而被当作一种饲料添加剂，在畜牧养殖业中获得广泛应用^[14,15]. 洛克沙胂几乎不被动物体吸收，大量洛克沙胂随着动物的排泄物进入环境中，导致了养殖场废弃物(粪便、 污水)以及养殖场周围环境介质(土壤、 水体)中砷含量的增加，给人体健康以及环境安全带来威胁^{[15, 16, 17, 18]}. 截止目前，ROX与HA之间相互作用行为与机制还不清楚，环境因子影响下的ROX与HA结合常数变化规律还鲜有报道. 因此，本研究采用荧光猝灭滴定法，分析了ROX与HA之间的荧光猝灭作用与机制，以期为了解含砷污染物迁移转化和风险评估提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 材料与仪器

腐殖酸钠(HA)购自Sigma公司，洛克沙胂(ROX，98%)购自国药集团化学试剂有限公司，其它试剂均为分析纯，所有溶液均用二次蒸馏水配制. 所用的主要仪器包括：总有机碳分析仪(TOC-VSCN，日本SHIMADZU公司)，分子荧光光度计(Lumina，美国Thermo Fisher公司)，瞬态荧光光谱仪(FM-4P-TCSPC，法国HORIBA Jobin Yvon公司).

取一定体积ROX储备液加入到一系列25 mL容量瓶中，并加入2 mL 1 mmol ·L^-1的磷酸盐缓冲液(pH分别为5.00、 6.00、 7.00、 8.00、 9.00)，同时，加入一定体积HA溶液(浓度以DOC计，分别为6.32、 12.63、 25.26 mg ·L^-1)，充分混匀后定容，转移至锥形瓶中，在恒温(温度分别设置为25.0℃±0.5℃、 30.0℃±0.5℃、 35.0℃±0.5℃、 45.0℃±0.5℃、 55.0℃±0.5℃)水浴中进行磁力搅拌，平衡实验表明，HA与ROX之间的反应在30 min内达到平衡，充分曝N₂ 15 min后进行三维荧光光谱的测量. 设置对照实验和平行实验，测试结果取平均值.

HA储备液的浓度以溶解性有机碳(dissolved organic carbon，DOC)来表示，使用总有机碳分析仪测定其含量(以碳计，下同)为315.75 mg ·L^-1. 采用分子荧光光谱仪测定荧光强度. 测试条件如下：150 W氙弧灯光源，600 V PMT电压，激发和发射带通均为10 nm，响应时间0.02 s，扫描速度600 nm ·min^-1，激发波长260~500 nm，发射波长360~600 nm. 测试过程中，首先采用三维荧光光谱法(3D-EEM)确定最大峰的激发波长，并将其作为发射光谱的激发波长，进行荧光发射光谱扫描. 使用瞬态荧光光谱仪测定荧光寿命，电压为950 V，计数总数为8000.

使用Ryan-Weber非线性等式^[10,19]、 线性模型^[7]以及修正的Stern-Volmer方程^[20,21]计算结合常数等相关参数.

Ryan-Weber非线性模型如下：

线性模型如下：

修正的Stern-Volmer方程如下：

式(3)中符号的含义与式(2)中相同. f是滴定前后荧光的变化值占初始荧光强度的比例. 以 F₀ F₀－F 对c_ROX作图，根据直线的斜率可以计算出结合常数K. 2 结果与讨论 2.1 ROX对腐殖酸的猝灭作用及谱图识别

ROX与ROX-HA荧光强度变化如图 1所示. 从中可知，在ROX浓度为380.17μmol ·L^-1，其荧光强度约为538.9，而在相同浓度下HA-ROX体系的荧光峰荧光强度约为21785.3，HA的荧光强度为42382，ROX荧光强度只占HA-ROX荧光强度的2.47%，占HA荧光强度的1.27%，说明ROX本身荧光很弱. 在HA与ROX的反应体系中，HA是荧光物质，而ROX是猝灭剂.

图 1

Fig. 1

图 1 HA、 ROX-HA体系以及ROX荧光图谱 Fig. 1 Fluorescence emission spectra of HA,ROX-HA and ROX

HA、 ROX-HA反应体系的三维荧光光谱等高线图如图 2所示. 由图 2(a)可知，HA分子三维荧光谱图中有4个峰，依次标记为A、 B、 C、 D，E_x/E_m分别为300 nm/480 nm、 370 nm/480 nm、 420 nm/500 nm、 460 nm/520 nm. HA的3D-EEM图有一个 主峰A，其他峰B、 C、 D相对都比较小，属于主峰A的肩峰，这是因为HA分子中含有多种荧光基团如羰基和羧基. 峰A属于类FA荧光峰，峰B、峰C和D属于类HA荧光峰. 类FA荧光峰和类HA荧光峰所在区域基本代表了陆源HA的荧光峰所在的位置^[22]. 鉴于以上情况，在HA浓度对结合常数影响实验中，用峰A和峰D分别代表类FA荧光峰和类HA荧光峰，进行计算.

HA与380.17μmol ·L^-1的ROX相互作用后，其三维荧光峰的峰形不变，如图 2(b)所示. 当在HA中加入少量ROX后，峰B和峰C即消失. 峰A(E_x/Em=320 nm/500 nm)和峰D(E_x/E_m=460 nm/530 nm)的位置发生了红移，其荧光强度发生了明显的降低，但峰未消失. 峰A的E_x/E_m最大移动了约20 nm/30 nm，峰D的E_x/E_m最大移动了约20 nm/20 nm. 荧光猝灭和荧光峰位置的移动表明：HA与ROX的作用与HA和金属离子的相互作用类似，HA的构象和分子刚性在荧光猝灭反应的过程中发生了改变^{[19, 20, 21, 23, 24]}.

图 2

Fig. 2

图 2 HA的3D-EEM图 Fig. 2 Excitation-emission matrix spectra (EEMs) of HA

用Ryan-Weber模型拟合HA与ROX之间的荧光猝灭作用，其结果如图 3所示：随着ROX浓度的增加，峰A、 B、 C、 D的荧光强度迅速猝灭，当ROX浓度超过380.17 μmol ·L^-1时，4个峰的荧光猝灭速率降低; 峰A、 B、 C的猝灭程度较高，当ROX浓度超过304.14 μmol ·L^-1时，峰B和C的猝灭程度超过75%; 当ROX浓度达到1140.51 μmol ·L^-1时，峰A猝灭程度达到了70%以上，峰B和峰C猝灭程度超过了90%，峰D猝灭程度只有50%左右，猝灭率从大到小依次为：C>B>A>D. 这表明，激发波长位于短波区的类HS荧光峰所代表的官能团优先与ROX发生作用.

图 3

Fig. 3

图 3 HA-ROX反应体系中荧光峰的Ryan-Weber非线性拟合 Fig. 3 Fluorescence experimental data of peaks of HA quenching by ROX fitting to a modified Ryan-Weber model curve

使用线性模型和修正的Stern-Volmer模型，对荧光猝灭的数据进行拟合，能够用来判断猝灭是单一的静态猝灭，还是静态猝灭与碰撞猝灭同时存在的复合猝灭^{[12, 25, 26]}，拟合的曲线如图 4和图 5所示. 由图 4可知，峰A、 B、 D的和ROX浓度之间线性关系很好(R²>0.99，P<0.05)，是以单一猝灭为主，而峰C的线性相对较差. 在ROX浓度较低时，峰C的和ROX浓度之间近似为线性关系，而当ROX浓度较高时，峰C的图形较大地偏向y轴，这表明峰C与ROX之间的猝灭更倾向于复合猝灭.

图 4

Fig. 4

图 4 HA-ROX反应体系中荧光峰线性拟合 Fig. 4 Fluorescence experimental data of peaks of HA quenching to ROX fitting to a liner curve

在pH 7.00和25.0℃±0.5℃条件下，腐殖酸浓度对HA-ROX结合常数的影响如表 1所示. 从中可知，随着浓度的增加，lg K有略微上升的趋势，HA-ROX反应体系的lg K远大于双分子动态猝灭常数(在25℃的水溶液中，由高效淬灭剂O₂计算得的双分子动态猝灭常数lg K_D小于2)^[7]，表明ROX和HA中羧基和羰基等官能团发生了静态猝灭作用; 随着腐殖酸浓度的升高，F_end值逐渐升高，峰A的F_end值介于7.38~18.80，峰D的F_end值介于28.34~38.69之间，与lg K值的趋势保持一致. 这与已有研究中观察到的趋势相反，可能是由于化学平衡对结合常数的影响以及内滤光作用较低造成^[27]

图 5

Fig. 5

图 5 HA-ROX反应体系中荧光峰修正Stern-Volmer拟合 Fig. 5 Fluorescence experimental data of peaks of HA quenching by ROX fitting to a Stern-Volmer plot

通过Ryan-Weber模型、 线性模型和修正的Stern-Volmer模型分析，获得HA-ROX结合常数的结果表明：3种模型中，Ryan-Weber模型的R²值最高，均在0.99之上，修正的Stern-Volmer模型R²值最不理想，且获得的结合常数的标准偏差也较大，表明ROX对腐殖酸的荧光猝灭为静态猝灭，ROX与HA之间按1 ∶1比例形成结合物. 所以后续结果讨论中，只使用Ryan-Weber模型来计算结合常数.

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度腐殖酸条件下峰A和D的lg K、 Fend值 Table 1 Association constant (lg K) and Fend of the interaction between HA and ROX at different HA concentrations HA /mg ·L-1 Ex/Em (nm/nm) Ryan-Weber模型 Stern-Volmer模型 修正的Stern-Volmer模型 lg K/L ·mol-1 Fend R2 lg K/L ·mol-1 R2 lg K/L ·mol-1 R2 6.32 300/480 3.75±0.04 7.38±0.64 0.998 3.45±0.01 0.992 3.07±0.05 0.992 460/520 3.66±0.01 28.34±0.14 0.992 3.10±0.02 0.982 3.09±0.11 0.990 12.63 300/480 3.89±0.05 14.32±0.59 0.994 3.39±0.02 0.970 2.68±0.51 0.971 460/520 3.94±0.17 34.96±0.12 0.993 3.09±0.05 0.955 3.50±0.24 0.932 25.26 300/480 3.87±0.05 18.80±1.43 0.998 3.31±0.01 0.994 3.03±0.24 0.981 460/520 4.04±0.12 38.69±1.45 0.995 3.10±0.02 0.931 3.36±0.14 0.960

表 1 不同浓度腐殖酸条件下峰A和D的lg K、 Fend值 Table 1 Association constant (lg K) and Fend of the interaction between HA and ROX at different HA concentrations

对比表 1中峰A和峰D的数据可发现：不论是Ryan-Weber模型、 线性模型还是修正的Stern-Volmer模型，峰A的R²值都比峰D更接近于1.000，所以在后续影响结合参数的因子讨论中，均对峰A的数据进行重点分析.

在反应体系中设定了5.00、 6.00、 7.00、 8.00、 9.00等5种不同的pH值，探讨了不同pH值对HA-ROX荧光淬灭作用的影响，其结果如图 6所示. 从中可知，当pH值在5.00~9.00时，HA体系的荧光强度在pH=8.00时达到最大值(P<0.01)，HA-ROX反应体系的荧光强度在pH=7.00时达到最大值(P<0.01). HA与HA-ROX体系的荧光强度随pH值的变化趋势一致，说明可能是由于pH改变了HA-ROX体系中相关官能团如酚羟基和羧基的构象，从而导致了HA与ROX结合强度的改变^[28,29].

图 6

Fig. 6

图 6 pH值对HA和HA-ROX反应体系荧光强度的影响 Fig. 6 Fluorescence emission intensity of HA and HA-ROX at different pH values

pH对HA-ROX结合常数的影响如图 7所示. 从中可知，在pH 5.00~9.00范围内，运用Ryan-Weber模型拟合的峰A(E_x/E_m=300 nm/480 nm)的lg K值在3.55~3.98 L ·mol^-1之间波动，并且在pH=6.00处达到最大值(P<0.01). ROX的pK_a值依次为3.49、 5.74、 9.13^[30]，ROX有ROX-H₃、 ROX-H^-₂、 ROX-H^2-、 ROX^3-这4种状态存在. 当pH=6.00时，ROX主要以ROX-H^-₂和ROX-H^2-两种形态存在(各约占50%)，与HA的结合常数最高，结合强度最高，这可能是pH对ROX形态以及HA分子构象的共同作用所致.

温度对HA-ROX结合常数的影响如图 8所示. 从中可知，在25.0~55.0℃范围内，峰A(E_x/E_m=300 nm/480 nm)的lg K值介于2.65~3.89 L ·mol^-1之间，且随着温度的上升，lg K值降低(P<0.01). 55.0℃的lg K值比25.0℃的lg K值小1.24 L ·mol^-1，这进一步证实了ROX与HA间的猝灭为静态猝灭^[11,29].

图 7

Fig. 7

图 7 pH值对HA-ROX结合常数的影响 Fig. 7 Effects of pH on the association constant of HA-ROX

图 8

Fig. 8

图 8 温度对HA-ROX结合常数的影响 Fig. 8 Effects of temperature on the association constant of HA-ROX

对HA以及HA-ROX分别进行荧光寿命的测量，使用三阶指数模型(tri-exponential compartment model)拟合，HA以及HA-ROX的峰A荧光寿命如图 9所示，拟合结果如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 HA及HA-ROX体系荧光寿命 Table 2 Fluorescence life time of HA and HA-ROX 激发/发射波长 (nm/nm) HA 荧光寿命τ0/ns HA-ROX 荧光寿命τ/ns τ0/τ F0/F 300/480 2.24 2.14 1.05 1.96 370/480 2.41 2.1 1.15 3.15 420/500 3.09 2.05 1.51 5.83 460/520 2.51 2.73 0.92 1.6

表 2 HA及HA-ROX体系荧光寿命 Table 2 Fluorescence life time of HA and HA-ROX

由图 9和表 2可知峰A、 B、 D的荧光寿命在猝灭滴定前后没有发生明显的变化，而峰C的荧光寿命发生了明显的变化; 峰A、 B、 D的τ₀/τ≈1，符合静态猝灭的条件，峰C的τ₀/τ≠1，且τ₀/τ≠F₀/F. 另外，结合2.1节中有关线性模型拟合的分析，可知峰A、 B、 D发生的是单一的静态猝灭，峰C发生的是静态猝灭与碰撞猝灭的复合猝灭^[31].

图 9

Fig. 9

图 9 荧光猝灭滴定前后，峰A、 B、 C、 D的荧光寿命图谱 Fig. 9 Fluorescence decay curve of peak A,B,C and D of HA with and without ROX

(1)在0.5 h内HA与ROX之间作用达到平衡，其中，HA是荧光物质，而ROX是猝灭剂. 在反应体系的4个荧光峰中，峰A(E_x/E_m=300 nm/480 nm)是类FA荧光峰，猝灭程度较高，其他峰属于类HA荧光峰，4个峰的猝灭程度从大到小依次为：C>B>A>D.

(2)随着HA浓度增加，ROX与峰A所代表官能团的结合常数对数值lg K有略微上升，且远大于室温下O₂双分子动态猝灭常数，F_end值逐渐升高，表明ROX能与HA中羧基和羰基等官能团发生静态猝灭作用，并形成1 ∶1结合物.

(3)pH值对HA-ROX的结合常数影响可能是pH对ROX形态以及HA分子构象的共同作用所致; 在pH值5.00~9.00范围内，峰A的lg K值在3.55~3.98 L ·mol^-1之间波动，并且在pH=6.00处达到最大值.

(4) 在25.0~55.0℃范围内，随着温度上升，lg K值降低. 峰A的lg K值介于2.65~3.89 L ·mol^-1之间，表明ROX与HA中类FA荧光基团发生静态猝灭作用.

(5)瞬态荧光分析结果和线性模型拟合数据表明：ROX能与峰A、 峰B、 峰D所代表的官能团均发生单一静态猝灭作用，与峰C所代表的官能团同时发生静态猝灭和碰撞猝灭.